本文介绍了一种基于乙二醇的小鼠胚胎玻璃化冷冻方法。该方法具有操作简便、胚胎毒性低的优点，因此可广泛适用于多种小鼠品系，包括近交系和基因修饰小鼠。
本文内容
摘要
摘要
小鼠胚胎的冷冻保存是一项支持生物医学科学研究的技术基础，因为通过基因改造已培育出大量品系的小鼠，且每年数量持续增加。该技术的发展始于20世纪70年代的慢速冷冻方法1，随后在80年代末发展出玻璃化冷冻方法2。通常情况下，后一种技术具有操作快速、简便以及解冻后胚胎存活率高的优势。然而，所使用的冷冻保护剂具有高度毒性，可能影响后续胚胎发育。因此，即使在胚胎操作过程中将溶液冷却至4°C以减轻毒性作用，该技术仍不适用于某些小鼠品系。在理化学研究所生物资源中心，保存着超过5000种具有不同遗传背景和表型的小鼠品系3，为此我们优化了一种玻璃化冷冻技术，能够对多种不同品系的小鼠胚胎进行冷冻保存，并在室温下解冻（或更准确地说，融化）后实现较高的胚胎存活率4。
本文介绍了一种在本中心已成功应用的小鼠胚胎玻璃化冷冻方法。该冷冻保存溶液采用乙二醇代替二甲基亚砜（DMSO），以降低对胚胎的毒性5。同时含有Ficoll和蔗糖，分别用于防止复玻璃化和调节渗透压。胚胎可在室温下操作，并可在5分钟内转移至液氮中。由于原始方法针对塑料细管作为容器进行了优化，我们对该方案进行了轻微修改，以适用于实验室更易获得且更耐物理损伤的冻存管。我们还详细描述了玻璃化冷冻胚胎的复苏操作步骤，因为这是高效获得活体小鼠的关键环节。这些技术方法将有助于需要以安全、经济的方式保存小鼠品系以供后续使用的科研人员和技术人员。
方案
实验的整体方案如图1所示。
1. 试剂制备
- 根据下表，在100 ml玻璃瓶中配制基础培养基（以下简称PB1）：
分子量 毫摩尔浓度（mM） 每100 ml含毫克数（mg/100ml） NaCl 58.4 136.98 800.0 KCl 74.6 2.68 20.0 KH2PO4 136.1 1.47 20.0 Na2HPO4·12H2O 358.14 8.04 288.1 MgCl2·6H2O 203.3 0.49 10.0 葡萄糖 180.2 5.56 100.0 丙酮酸钠 110 0.33 3.6 CaCl2·2H2O 147 0.9 13.2 青霉素G 6.0（约） - 配制Ficoll-蔗糖（FS）溶液：
- 在50 ml离心管中，向14 ml PB1溶液中加入以下化学试剂：
Ficoll 70 6.0 g 蔗糖 3.424 g BSA 42.0 mg - 将Ficoll 70和蔗糖加入PB1溶液中，充分振荡直至完全溶解。
- 确认上述物质完全溶解后，将BSA加至溶液表面，并于4°C静置，直至BSA完全溶解（>4小时或过夜）。
- 在50 ml离心管中，向14 ml PB1溶液中加入以下化学试剂：
- 在50 ml离心管中配制平衡溶液（EFS20）和玻璃化冷冻溶液（EFS40）：
- EFS20：含20%（v/v）乙二醇、24%（w/v）Ficoll和0.4 mol/L蔗糖的PB1溶液（含BSA）
- EFS40：含40%（v/v）乙二醇、18%（w/v）Ficoll和0.3 mol/L*蔗糖的PB1溶液（含BSA）
*对于来自BALB/c或ICR品系的胚胎，因其对冷冻损伤更为敏感，需将蔗糖浓度提高至0.9 mol/L6。
EFS20溶液 EFS40溶液 乙二醇 1 ml 2 ml FS溶液 4 ml 3 ml - 使用0.45 μm滤膜过滤除菌。分装至5 ml聚苯乙烯管中，4°C保存。可使用约6个月。
- 配制含0.75 M蔗糖的胚胎解冻溶液（TS1）：
- 将7.7 g蔗糖溶解于步骤1.1中配制的PB1溶液中，并定容至30 ml。轻轻振荡混匀，直至蔗糖完全溶解。
- 将90 mg BSA加至溶液表面，静置至完全溶解。
- 通过过滤除菌。
- 分装并储存于4°C。可使用约1个月。
注：TS1也可使用市售M2培养基配制。
- 将7.7 g蔗糖溶解于M2培养基中，并定容至30 ml。
- 轻轻振荡混匀，直至蔗糖完全溶解。
- 通过过滤除菌。
- 分装并储存于4°C。可使用约1个月。
- TS2（含0.25 M蔗糖的解冻溶液）：
- 根据需要，用PB1或M2将10 ml TS1稀释至总体积30 ml。
- 分装并储存于4°C。可使用约1个月。
2. 小鼠2细胞胚胎的玻璃化冷冻
- 通过自然交配或常规方法制备小鼠2细胞期胚胎 体外 授精技术
- 等分试样 50 μl 将EFS40转入冻存管中。此后，其余玻璃化冷冻步骤均在室温下进行。
- 等分试样 50 μl 在35 mm或60 mm塑料培养皿底部加入EFS20。
- 使用玻璃毛细管将最多30个胚胎转移至EFS20中，仅携带最小量的培养液。启动计时器，持续2分钟。
注意：将胚胎放置在液滴底部，以实现胚胎的高效脱水。使用体视显微镜检查胚胎形态。脱水后的胚胎呈现皱缩形态，如图所示。 图 2A如果脱水不充分，需再等待1至2分钟。 - 约1.5分钟时，用最小量溶液从EFS20液滴中拾取胚胎，转移至步骤2.1中准备好的冻存管内的EFS40溶液中。注意：为获得最佳效果，应调整拾取胚胎的时间，使所有胚胎均能在约2分钟时转移至EFS40溶液中。
- 等待 1 分钟。
- 将冻存管直接放入液氮（LN₂）中2).
3. 解冻玻璃化保存的2细胞期小鼠胚胎
- 解冻前，准备一个培养皿，内含 10 μl 用于回收胚胎的胚胎培养液滴（参见步骤 3.13）。用油覆盖培养皿后置于 CO₂ 培养箱中2 孵育器中保存至使用。注意：尽管本实验可使用任何常规胚胎培养培养基，但我们推荐使用渗透压较高的培养基，例如 M16 培养基。
- 将TS1预热至 37°C.
- 戴上口罩和低温手套。打开液氮罐2 将冻存管从液氮罐中取出，管内含有胚胎。
- 迅速打开管盖，弃去液氮2等待30秒，以防止TS1在下一步骤中冻结。
- 使用1000 μl移液器加入 850 μl TS1 的37°C将溶液加入管中，轻轻吹打约10次（25秒内），混匀，直至溶液完全均匀溶解。
- 将试管中的全部液体转移至一个塑料60 mm培养皿（或表面皿）中（图 3A）。注意：胚胎应在室温（22-25°C）直至将其放入 CO2 步骤 3.14 中的培养箱
- 启动计时器，计时3分钟。
- 在TS1阶段约2分钟时，轻轻摇晃培养皿，直至含有胚胎的培养基均匀铺展在培养皿表面（图 3B注意：这有助于胚胎沉降到管底，因为胚胎在转移到TS1时会漂浮在液面附近。
- 放三个 50 μl 将TS2滴加到培养皿中（图 3C).
- 在TS1中孵育3分钟后，使用体视显微镜检查胚胎形态；此时胚胎应略微收缩。参见早期胚胎的形态（图 2B）以及之后（图 2C) 在TS1中。注意：如果胚胎仍然肿胀，需在TS1中继续放置1至3分钟。
- 挑取胚胎并将其转移至第一滴 TS2 中（图 3D）。启动计时器，计时3 min
- 3分钟后，将胚胎转移至第二滴液滴，随后转移至第三滴液滴（图 3E).
- 将胚胎转移至第3.1步准备的培养基中。胚胎的形态如图所示 图 2D.
- 将培养皿放入 CO₂ 培养箱中2 培养箱中。约10分钟后，将胚胎转移至下一滴培养液中，以洗去从TS2带出的蔗糖。
- 在CO2培养箱中继续培养，直至胚胎移植。
注意：在解冻当天将胚胎移植至受体雌性动物的输卵管中。长时间培养 体外 可能会降低某些小鼠品系胚胎的存活率。
4. 代表性结果：
体外- 和 体内解冻后胚胎发育情况见表1和表2。该方案的优点在于胚胎解冻后存活率高，且适用于多种小鼠品系。
| 品系 | 总管数 | 玻璃化冷冻胚胎数 | 复苏数（数量（%）） | 形态正常数（数量（%）） | 发育至囊胚数（数量（%）） |
| C57BL/6J | 20 | 400 | 397 (99) | 394 (99) | 342 (87) |
| BALB/cA | 15 | 300 | 296 (99) | 282 (95) | 238 (84) |
| ICR | 24 | 480 | 474 (99) | 443 (93) | 398 (90) |
表1. 体外常用小鼠品系玻璃化冻融胚胎的发育
| 胚胎状态 | 受体雌性数量 | 移植胚胎数 | 着床位点（数量（%）） | 存活后代（数量（%）） |
| 新鲜 | 12 | 180 | 141 (78.3) | 110 (61.1) |
| 玻璃化冷冻 | 16 | 242 | 202 (83.5) | 125 (51.7) |
表2. C57BL/6J小鼠玻璃化冻融胚胎的体内发育情况。
图 1. 实验的整体流程，包括胚胎的平衡、玻璃化冷冻和解冻过程。
图 2. 胚胎在解冻各步骤中的形态。
图3. 胚胎解冻操作流程。所有步骤均在室温下进行。（A）将850 μl TS1溶液（37°C）加入冻存管中，并将冻存管内的全部液体转移至塑料培养皿中。此时胚胎呈现肿胀状态，如图2B所示。（B）轻轻振荡培养皿，使液体均匀铺展于皿表面。（C）在塑料培养皿中放置三滴TS2溶液，每滴50 μl。（D）将胚胎转移至第一滴TS2溶液中。3分钟后，胚胎呈现皱缩状态，如图2C所示。（E）依次将胚胎转移至其余TS2液滴中，最后转移至培养液中。
讨论
自1985年Rall和Fahy首次报道小鼠胚胎玻璃化冷冻技术以来2，已有多种技术改进被提出，以提高胚胎解冻后的存活率。其中最成功的改进之一是使用乙二醇作为冷冻保护剂，因其具有较低的毒性和较高的细胞膜通透性。这些优势使我们能够在室温下操作胚胎的冷冻过程4；而其他玻璃化冷冻方法则需在较低温度下操作，且并不总是适用于包括BALB/c在内的某些小鼠品系6。基于乙二醇的首项玻璃化冷冻技术由Kasai等人于1990年建立5,7。由于原始方法是针对塑料吸管作为容器进行优化的，我们对该方案进行了轻微修改，改用实验室更易获得且更耐物理损伤的冻存管。因此，本文所述的玻璃化冷冻方法可能适用于众多以小鼠为研究模型的实验室。该方法同样可用于桑葚胚和囊胚阶段的小鼠胚胎8以及大鼠胚胎9。然而，我们最近发现冻存管的质量可能影响胚胎冻融后的存活率。因此，在进行胚胎玻璃化冷冻前，必须检查冻存管内表面的光滑程度（例如：参见试剂与设备表）。
玻璃化冷冻方法相较于传统的慢速冷冻方法具有诸多优势，但在运输方面存在固有的缺点。由于玻璃化冷冻的胚胎必须保存在-120°C以下才能维持其活性，因此通常使用干式液氮运输罐（dry shippers）进行安全运输。然而，干式液氮运输罐重量大、体积大，往返运输成本高昂，尤其是在国际运输中更为显著。目前我们正在开发一种新型玻璃化冷冻方法，可使玻璃化冷冻的胚胎在干冰温度（约-80°C）下至少保存7天10。该方法有望成为下一代玻璃化冷冻技术。
披露
我们无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究与日本文部科学省国家生物资源项目合作开展。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 | Merck & Co., Inc. | 12657 | |
| 乙二醇 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 058-00986 | |
| Ficoll 70 | GE Healthcare | 17-0310-10 | |
| 葡萄糖 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| NaCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 191-01665 | |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 163-03545 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| Na2HPO4·12H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 500-04195 | |
| MgCl2 ·6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-00165 | |
| CaCl2 ·2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 031-00435 | |
| 青霉素 G | Sigma-Aldrich | P-4687 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | P-8574 | |
| 蔗糖 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-00015 | |
| M16 培养基 | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 培养基 | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cryotube | 住友电木株式会社 | MS-4501 | “冷冻小瓶” |
参考文献
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C. Science. 187, 411-414 (1972).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Yoshiki, A. The mouse resources at the RIKEN BioResource center. Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).
- Mochida, K., Ogura, A. Cryopreservation of embryos in laboratory species. J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).
- Kasai, M. A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Kasai, M., Mukaida, T. Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).
- Miyake, T. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology. 40, 121-134 (1993).
- Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).
- Jin, B. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).
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