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分离 & Hoechst 染料的表征低 CD45阴性 小鼠肺间充质干细胞

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DOI：

10.3791/3159

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2011年10月26日

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1Charles C. Gates Regenerative Medicine and Stem Cell Biology Program, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver, 3Cancer Center, University of Colorado Denver, 4Webb Waring Institute, University of Colorado Denver

本文内容

摘要

本文中，我们展示了从小鼠肺组织中分离常驻肺间充质干细胞（肺MSC）、扩增、鉴定及其免疫调节特性的分析方法。

摘要

组织驻留的间充质干细胞（MSC）是组织修复或再生、纤维化、炎症、血管生成以及肿瘤形成的重要调节因子。综合这些研究结果表明，肺组织驻留的MSC在肺组织稳态、损伤及修复过程中发挥作用，例如在肺纤维化（PF）和肺动脉高压（PAH）等疾病中。本文描述了一种用于定义肺组织驻留MSC群体的技术。该群体的界定 体内 利用一组明确的标记物对肺组织进行分析，可通过流式细胞术重复分离出特征明确的干细胞群体，并用于特定细胞类型及其功能的研究。

方案

1. 肺组织分离

  1. 使用过量异氟烷处死成年小鼠（8-10 周龄；18-20 g；C57Bl6J），随后采用无菌技术放血致死。不同品系间表型略有差异。
  2. 手术取出膈肌，通过在小鼠两侧肋骨侧面剪开以暴露胸腔。经右心室轻柔灌注 3–5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），以冲洗肺部血液。
  3. 解剖分离肺叶，去除气管和大支气管，置于盛有Hanks平衡盐溶液（HBSS）的培养皿中。收集全部肺叶后，使用镊子将组织转移至培养皿盖上。用一次性手术刀片将组织切碎成细小碎片，加入适量液体以保持湿润，但避免过多导致组织漂浮移动。
  4. 解剖其中一只小鼠的后肢，分离骨髓，作为染色对照用于设定流式细胞术的设门参数。骨髓（BM）染色操作按先前所述方法进行1。

2. 从肺组织制备单细胞悬液

  1. 每个肺组织使用优化的组织重量与体积比（0.2 g : 5 ml）进行消化，即在无菌HBSS中溶解预热的0.2% Worthington II型胶原酶（Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ; 货号 # LS004202）。将混合物置于37°C水浴中孵育30分钟2,3。
  2. 充分吹打样本，直至肺组织消化液能轻松通过10 ml移液器（约重复10次）。随后在37°C下继续孵育15分钟，以完成组织消化，并获得更均匀的单细胞悬液。
  3. 用HBSS稀释肺细胞悬液，并使用5 ml移液器吹打，以分散残留的组织碎片。
  4. 使用70 μm细胞筛过滤悬液，去除未消化的组织碎片。此时可将样本分装至多个锥形管中，以避免单个细胞筛过载，并缩短过滤时间。
  5. 在1500 rpm下离心10分钟，沉淀细胞悬液，并弃去上清液。
  6. 用室温红细胞裂解缓冲液（eBiosciences, San Diego, CA; 货号 # 00-4333-57）轻柔重悬细胞沉淀，在室温下孵育5分钟。加入等体积的HBSS以终止裂解反应，并使用40 μm细胞筛过滤细胞悬液，去除碎片和细胞聚集体。
  7. 取10 μl待染色的各样本，使用血细胞计数板对肺组织和骨髓（BM）样本的细胞数量进行计数。注意：记录细胞的总体积。
  8. 将肺组织单细胞悬液在1500 rpm下离心10分钟，沉淀细胞。
  9. 将肺组织和骨髓细胞均以1×106 个细胞/ml的浓度重悬于预热（37°C）的DMEM+培养基中（DMEM高糖培养基，含2%胎牛血清（FBS）和10 mM HEPES；Gibco, Carlsbad, CA; 货号 # 11965-092）。
  10. 将Hoechst 33342染料（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; 货号 # B2261）以水配制为1 mg/ml的储存液，并过滤除菌1,4。Hoechst染料可分装后保存于-80°C。
  11. 将Hoechst 33342染料加入单细胞悬液中，使其终浓度为5 μg/ml（即1 mg/ml储存液的200倍稀释）。
  12. 轻柔颠倒混匀细胞，置于37°C水浴中准确孵育90分钟。

3. 肺细胞悬液的染色与流式细胞术分析前处理

  1. 90 分钟后，所有使用 Hoechst 染色肺细胞的操作步骤必须在 4°C 或冰上进行，以防止染料外排。在 4°C 条件下以 1500 rpm 离心 10 分钟收集细胞，并用预冷的染色缓冲液（PBS + 2% FBS）重悬细胞。
  2. 将细胞重悬于含 2% FBS 和 10 mM HEPES 的 PBS 中，浓度不超过 1×107 个细胞/管，每管体积为 300–600 μl。
  3. 向肺组织和骨髓样本中加入适当滴定浓度的 CD45 抗体（通常为 CD45-APC（BD Pharmingen, San Diego, CA; cat # 559864）按 1:200 稀释）。冰上孵育 10–15 分钟。实验过程中设置未染色对照有助于设定分析门控。
  4. 在 4°C 条件下以 1500 rpm 离心 5 分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于 500 μl 预冷的染色缓冲液（PBS + 2% FBS）中，转移至预冷的 snap cap 聚丙烯管（Fisherbrand, Schaumburg, IL; cat # 14-956-1D）中。
  5. 向样本中加入碘化丙啶（PI，PBS 中 200 μg/ml 储存液），使其终浓度为 2 μg/ml，用于排除死细胞。PI 必须与 Hoechst 33342 染料联合使用，才能在流式细胞术分析中获得正确的荧光图谱。
  6. 将样品管置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。

4. 利用Hoechst染料外排检测侧群细胞（SP）通过流式细胞术分析定义并分离肺部间充质干细胞（lung MSC）群体

  1. 本实验对仪器有以下要求：
    • 488 nm 和紫外光（350-355 nm）激光器
    • 紫外激光光路配备两个检测器，分别带有蓝色（450/65）和红色（675/50）滤光片
    • 紫外光红色检测器必须对红色信号具有高灵敏度。这一点在较老型号的细胞分选仪上可能存在问题
    • 配备制冷装置，以维持样本温度在 5-10°C
  2. 根据制造商的操作说明，校准激光并设置细胞分选参数
  3. 使用线性刻度采集红（x轴）和蓝（y轴）Hoechst 荧光信号
  4. 调节光电倍增管电压，使 G0/G1 期细胞峰位于图中右上方中心位置，以便充分显示拖尾的细胞亚群。细胞周期中的部分 S 期及全部 G2 期细胞可能超出图右上方范围。蓝色信号相对较亮，而红色信号较弱。以 MoFlo XDP（Beckman Coulter, Miami, FL）为例，蓝色通道典型电压为 425，红色通道为 650
  5. 使用碘化丙啶（PI）设门排除死细胞。可采用标准 PI 检测通路（激发波长 488 nm，发射波长 630 nm）。或者，PI 也可由紫外激光激发，此时死细胞群体会出现在侧群（SP）图右侧超出量程的位置。这种方法避免了对其他荧光染料（如 FITC 和 PE）进行 PI 信号补偿的需要。原始 Goodell 方法即采用后者方案5-7
  6. 在分析和分选过程中保持相对较低的压力差，以确保侧群细胞的分辨清晰
  7. 侧群表现为肺细胞主群体之外的一个侧向亚群，该群体被称为 Hoechstlow
  8. 通过直方图分析 Hoechstlow/SP 群体，以区分 CD45 阳性和阴性细胞群2,3（图 1）
  9. 在选定并设门 HoechstlowCD45neg 肺间充质干细胞（MSC）群体后，可通过分选将细胞收集至离心管中作为混合群体，或分选至 96 孔板中以分离单细胞克隆3
  10. 进行板式分选时，应将分选液流偏转角度调整为 25%，以获得比常规管式分选更垂直的液流
  11. 通过向 96 孔板的左上角和右下角孔发送测试液流脉冲，校准分选液流位置
  12. 设置分选仪软件中的板图，以将目标数量的细胞沉积至各孔中
  13. 为分离单细胞克隆，将单个肺间充质干细胞分选至含有 150 μL 培养基（α-MEM 添加 20% FBS）的 96 孔板孔中。分选完成后，再向每孔添加 100 μL 培养基

5. 肺部间充质干细胞及其克隆的分离、培养与表征

  1. 采用标准培养条件（37°C、5% CO2 和 >95% 湿度），对分选后获得的混合肺间充质基质细胞（MSC）群体及其单细胞克隆进行培养与扩增。细胞分离后需孵育16小时以促进贴壁。每48小时更换一次培养基（α-MEM 添加 20% 胎牛血清）。当细胞增殖加快并达到75–80%融合度时进行传代（图2）。
  2. 用预热的HBSS洗涤细胞，并在37°C下用0.5%胰蛋白酶/EDTA（Cellgro, Manassas, VA; 货号 # 25-053-Cl）孵育少于2分钟。通过倒置显微镜观察，确认形成单细胞悬液。
  3. 根据当前培养物的增殖速率，将肺MSC以1:2或1:3的比例进行分瓶传代。
  4. 对每一批细胞制备物，评估其向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等经典间充质谱系分化的能力，以及其细胞表面是否表达公认的间充质细胞标志物。同时进行细胞遗传学带型分析，以确认不存在明显的染色体异常2,3,8-11。

6. 采用集落形成实验（CFU-F）对肺部间充质干细胞进行计数

  1. 将细胞用完全 MesenCult 培养基（Stem Cell Technologies，温哥华，BC）稀释至终浓度为 1×106 个细胞/mL。
  2. 进行系列稀释，使 10 mL 培养基中 100 mm 培养皿的终细胞浓度分别为 6×104 个细胞、3×104 个细胞、1.5×104 个细胞和 0.75×104 个细胞。每种细胞浓度设两个或三个重复，可根据培养表面积按比例调整。
  3. 在标准条件下培养细胞 10 天。第 10 天用 PBS 洗涤细胞，并在室温下用 100% 甲醇固定 5 分钟。
  4. 用 0.4% w/v 吉姆萨染色液（Sigma Chemical Co，圣路易斯，MO）以去离子水 1:20 稀释后染色，以检测 CFU-F 克隆。样品自然晾干后，计数每个克隆中细胞数大于 25 的克隆数量（图 3）。

7. 肺间充质干细胞对T细胞增殖和凋亡的免疫调节特性分析

  1. 6.25×104 每孔接种肺间充质干细胞至96孔板，过夜静置培养 2.
  2. CD4+ 从识别卵清蛋白323-339肽段的OT-II T细胞受体（TCR）转基因小鼠的脾脏中分离细胞，通过去除CD8细胞进行纯化+，CD19+，MHC-II+ 和 CD25+ 使用 Miltenyi AutoMACS 细胞分选仪（Miltenyi，Auburn，CA）对细胞进行分选。通过正向分选 MHC-II 分子富集抗原提呈细胞（APC）。+ 细胞 12.
  3. APC 用 4% 多聚甲醛固定，在 PBS/5% BSA/2 mM EDTA 中洗涤 3 次，并加载 0.5μg/ml 或 5μg/ml OVA323 肽段
  4. 将模拟的、生长停滞的 APC 加入96孔板中的肺部 MSC。
  5. 纯度大于 95% 的 CD4+ 1x105 细胞用……进行标记 5μM 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE；Sigma，St. Louis MO）溶于PBS中，避光孵育5分钟，用PBS-5% BSA洗涤，然后加入含DMEM 5% FBS培养基的APC和肺MSC细胞中。细胞随后孵育96小时。
  6. T细胞随后用抗CD40（Cy5）、CD4（APC-Cy7）、CD8（ViolBlue）和Vbeta 5（PE）抗体染色，并使用Miltenyi MacsQuant 7色流式细胞仪（Miltenyi，Aurburn，CA）及FloJo分析软件（Treestar，Ashland，OR）进行检测。增殖情况通过CFSE平均荧光强度相对于未暴露于抗原呈递细胞（APC）的CFSE标记T细胞背景值的下降程度来衡量（图4）。同时计数T细胞，并通过台盼蓝排斥法评估细胞活力。

8. 代表性结果：

流式细胞术分析图表，展示细胞群体分化及CD45表达水平。
图1. 流式细胞术分析与肺源MSC的定义。肺组织消化后的单细胞悬液用Hoechst 33342染色，并通过流式细胞术分析其在A. 前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）以及B. Hoechst蓝色与红色荧光上的差异。图中门控区域可见侧群（SP）细胞的存在。进一步对Hoechstlow的SP细胞进行分析，以分离出C. CD45阴性的肺源MSC群体。肺SP中CD45阳性与阴性细胞的比例通常为70:30 / 60:40。

显微镜图像中的细胞培养比较；A：分离的细胞，B：成纤维细胞网络形成。
图 2. 肺间充质干细胞的分离与培养。通过细胞分选获得肺间充质干细胞后，将细胞接种于30 mm培养皿中，使用添加20% FBS的α-MEM培养基进行培养。A. 新分选的细胞呈小而圆且透亮。 B. 培养约2-3周后，出现具有间充质样表型的克隆集落，增殖现象更加明显。

细胞培养分析；显微镜图像；培养皿，细胞克隆生长，用于测量的比例尺。
图3. 通过成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）实验对间充质干细胞（MSC）进行计数。 扩增后的肺源性MSC按照所述CFU-F实验方案接种。 A. 培养10天后，经吉姆萨染色可见明显克隆。 B. 克隆较大，由数百个细胞组成。 C. 细胞呈现间充质表型。 A & B，比例尺 = 0.5 cm；C，比例尺 = 0.14 cm。

流式细胞术分析、散点图、T细胞、抗原呈递细胞、肺间充质干细胞影响、CFSE与CD40表达示意图。
图4. 基于CFSE的T细胞增殖实验。在无肺间充质干细胞存在、但有抗原呈递细胞（APC）存在且添加或不添加卵清蛋白（OVA）的条件下，CD40阳性效应T细胞的CFSE荧光强度降低，表明细胞发生增殖（红色圆圈）。T细胞膜上的CFSE荧光强度在每次细胞分裂时均按化学计量比例下降，即每次分裂后荧光强度减半。而在存在肺间充质干细胞、抗原呈递细胞（APC）及添加或不添加OVA的条件下，CD40阳性效应T细胞的CFSE荧光强度无明显变化，表明细胞未发生显著增殖（红色圆圈）。

讨论

我们改进了一种最初用于鉴定骨髓造血细胞的方法，以分离小鼠肺组织中特定的常驻肺间充质干细胞（MSC）群体。由于该分离方法具有良好的可重复性，所获细胞被充分鉴定为MSC。这些细胞的来源被确定为成年小鼠肺组织常驻细胞（而非骨髓来源），并已对其表型和分子特征进行了系统描述。 2能够反复分离出这一特征明确的细胞群体，使得进一步研究肺部间充质干细胞在组织稳态与疾病中的生物学意义和作用成为可能。该细胞群体的最新定义 体内 在小鼠和人类肺组织中，促进内源性细胞的修复策略有助于在肺损伤和疾病期间实现肺组织修复。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究获得了对 SMM 的资助：AHA GIA0855953G，NIH 1R01 HL091105-01。额外支持来自：DW：NIH RO1DK075013、DDK 以及 Kleberg 基金会；UCCC 流式细胞术核心（NIH 5 P30 CA 46934-15），UCCC 基因芯片核心（NCI P30 CA 46934-14）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichP-5368
Hanks 平衡盐溶液（HBSS）Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30588.01
0.2% Worthington II 型胶原酶Worthington BiochemicalLS004202
红细胞裂解缓冲液eBioscience00-4333-57
DMEMInvitrogen11965-092
H–chst 33342 染料Sigma-AldrichB2261
CD45-APCBD Biosciences559864
碘化丙啶Sigma-Aldrich81845
a-MEMThermo Fisher Scientific, Inc.SH30265.01
FBSInvitrogen16000-069
0.5% 胰蛋白酶/EDTACellgro25-053-Cl
完全 MesenCult 培养基Stem Cell Technologies05511
0.4% w/v 吉姆萨染色液Sigma-AldrichGS1L
4% 多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710将16%多聚甲醛用PBS稀释至4%
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）Sigma-Aldrich21888

参考文献

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