多参数的Langendorff灌注兔心脏的光学测绘

摘要

本文介绍采用全景成像系统中的Langendorff灌注兔心脏进行光学测绘实验的基本程序，和双（电压和钙）的成像方式。

摘要

光学成像和荧光探针在¹其他的方法，已经不能完成方式在心脏电生理领域的显著先进的研究方法。光的映射允许使用的钙和电压敏感染料，没有身体接触与组织跨膜动作电位和钙瞬变的高空间分辨率的测量。这使得许多条件下使用电极不方便或不可能¹心电活动的测量成为可能。例如，光学记录在刺激和除颤后立即提供准确的形态学改变膜电位，而传统的电极技术刺激诱 ​​发的文物遭受刺激，由于^电极极化1期间和之后。

的Langendorff灌流兔心脏是人类心脏的生理和病理生理研究最多的车型之一。观察临床心律失常的种类很多，可以在兔心脏模型扼要。结果表明，在兔心脏室性心律失常的波浪纹，有效的心脏和折返波长的大小决定的，在^人的心脏2非常相似。它也表明，关键方面对家兔心肌兴奋收缩（欧共体）耦合，如肌浆网（SR）的相对贡献，是非常类似人类^EC耦合​​3。在这里，我们目前光的映射实验的基本程序，包括Langendorff灌流系统设置，光学测绘系统设置，隔离和插管，心脏，灌注和染料染色的心脏，兴奋收缩的Langendorff灌注兔心解偶联，并收集光信号。从其他物种比兔与流速的调整，光学，解决方案等，这些方法也可以应用到心脏

两个光学测绘系统，进行了阐述。全景测绘系统是用来映射整个兔心脏外膜^4-7。该系统提供了一个全球视野，在折返性心律失常和除颤电路的演变，并已用于研究心律失常和抗心律失常^治疗 8,9的机制。双绘图系统是用来绘制动作电位（AP）和钙瞬变（CAT），同时从同一领域的^观点 10-13 。电交替和诱导心律失常¹⁴日至16日，这种做法增强了我们对钙的重要作用的认识。

方案

1。制备

1. 准备新鲜的Tyrodes"解决方案（毫米，128.2氯化钠_，氯化钙1.3，4.7氯化钾，1.19的_NaH 2 _PO 4，1.05，20.0 MgCl ₂的_碳酸氢钠 3和11.1葡萄糖） 。为了加快解决方案的日常准备，提前准备两只股票的解决方案和存储在4 ° C冰箱:（1）股票我（g/2L，374.6氯化钠，9.56，8.21 _17.52氯化钙，氯化钾的_NaH 2 _PO 4氯化镁_2）和（2）股份II（在g/2L碳酸氢钠_{3），84.01，10.67。}为了使Tyrodes的解决方案一个实验以足够的2L我股票，股票二80毫升，和4G的葡萄糖80毫升去离子水和混合1840mL。
2. 准备染料和uncouplers股票的解决方案:（1）兴奋收缩解偶联剂blebbistatin原液（Tocris生物科学2mg/mL的解决方案，在DMSO）;（2）电压敏感染料DI - 4 - ANEPPS原液（Invitrogen公司，为1mg/ml （3）解决方案，在DMSO）;电压敏感染料相对湿度237原液（Invitrogen公司1.25mg/ml在DMSO溶液）;（4）钙指标Rhod - 2AM原液（Invitrogen公司，1mg/ml的DMSO溶液）。一个单一的兔实验大约需要30μLDI - 4 - ANEPPS原液，30μLRH237原液，200μL的Rhod - 2AM原液。为了避免反复冻融，我们储存在-20 ° C 100微升等分DI - 4 - ANEPPS其他染料也存放在-20 ° C。储存在4 °彗星冰箱溶解blebbistatin。
3. 收获之前到2L的瓶子的心脏，转让Tyrodes的解决方案，并放入水浴（尔科技）的溶液温度保持在37 ° C。解决的办法是含氧95％O ₂ - 5％的CO _2。 pH值保持在7.35 ± 0.05调整血氧水平。解决的办法是发给在Langendorff灌流系统，是由尼龙网过滤器（孔径:11μm，微孔）过滤，置于前插管灌注线。
4. 准备收获之前的心脏监测设备。一个压力传感器（WPI）是用来监视在实验过程中的主动脉压力。压力传感器的基准调整时心脏灌注系统没有连接到零毫米汞柱。伪心电图电极放置在近似铅I，II和III Einthoven三角心电图室。

2。收获和灌注兔心

1. 修复兔在兔限位。安乐死兔静脉注射戊巴比妥钠（50毫克/公斤），与2000 U肝素。当兔子是完全安乐死，这是缺乏痛觉反射，迅速打开胸腔，心脏和肺部切除。
2. 请在升主动脉主动脉弓分支前的上端切。从升主动脉冲洗出来的空气，然后迅速cannulate 16号套管，先前已连接到一个泡沫捕手，这是非常重要的，保持空气冠状动脉的心脏。一旦心脏是逆行灌注在一个非循环的Langendorff灌流系统，削减迅速打开心包。
3. 取出肺，气管，脂肪和结缔组织，而血灌注冲洗。
4. 很重要的！一个硅胶管（〜3cm长，直径和2mm）通过肺静脉和二尖瓣进入左心室（LV）的插入，并保持在整个实验。这管释放被困在LV的解决方案。没有流通小时Lan​​gedorff在机械固定的心脏灌注实验期间，它可能会导致在LV腔严重缺血，产生心律失常。
5. 移动光学测绘仪器与套管循环的Langendorff灌注系统的心脏。

3。进行实验使用的全景光学测绘系统

1. 放置在一个特制的六边形室的心脏，连接导管灌注系统。调整灌注泵的流量保持动脉压在60 ± 5毫米汞柱。监视器导致我伪心电图。保持pH值约为7.35 ± 0.05。
2. 关掉室内的灯光，因为紫外线和低端（450-490纳米）的频谱的可见部分^的 17 photoinactivated blebbistatin 。通过注射套管上方的气泡捕手口慢慢注入blebbistatin原液。慢慢注入0.1毫升blebbistatin每推注。前等待下一次注射压力稳定。
3. 轻轻地放置到特定的位置，以你的实验设计的起搏电极。
4. 重点从三个磨砂玻璃位于平面图像的每个光电二极管阵列（PDA）的心脏图像均匀分布心脏周围的角度。调整位置的套管和每个PDA和心脏之间的距离，以适应心脏在所有三个掌上电脑领域的视图。以每个集中在磨砂玻璃形象的图片。
5. 慢慢注入10〜20μLDI - 4 - ANEPPS通过原液注射到灌注液中的气泡陷阱端口。采取光学录音之前，请等待1〜3分钟。
6. 第一张唱片，打开绿色的LED灯（没有激发滤光片，LED泛光灯，Lumileds公司），同时采取与定制的数据采集系统连接三个掌上^电脑 ，5光学录音和关闭LED灯。检查从不同的三个掌上电脑的所有像素的信号质量。如果注意到在光学动作电位的运动伪影，添加0.1〜悬液0.2ml blebbistatin原液。如果信号信噪比低，另外5μLDI - 4 - ANEPPS原液添加。
7. 完成的功能研究设计的实验方案。再额外5μLDI - 4 - ANEPPS原液染色心脏，如果实验过程中，由于漂白或冲刷恶化的信号。
8. 房间的灯打开后，完成的功能的研究。从36个均匀分布的角度，对心脏的图片。这是通过旋转10 °的一个步骤，与固定在一个PDA的位置数码相机的心脏。
9. 室取出的心脏。漏所有的解决方案。 DI水，70％的试剂酒精，并再次DI水的顺序清洗灌注系统。
10. 数据分析包括从36个数码照片，登记到重建的几何表面的光信号，和量化的动作电位时程（APD），传导速度（CV），相位^等 6个心脏几何重建

4。使用双绘图系统进行实验

1. （第2部分后继续）放置在一个玻璃容器（Radnoti）空心的心脏和连接导管灌注系统。牵制的硅，在心室心尖部和心房腔底部的心脏。
2. 关掉室内的灯光。慢慢注入的blebbistatin股票解决方案（15〜20分钟达到10μM）前通过注射口灌注导管固定的心脏。
3. 把一个塑料培养皿中，心外膜表面或以上其他玻璃窗口覆盖，降低溶液的表面的议案。
4. 聚焦在两个CMOS摄像头的双绘图系统在相同的视野（终极- L SciMedia）。发射荧光是由一个分色镜（635nm的截止，欧米茄光）分离，由一个700nm的长通滤波器（Thorlabs）为电压信号，由三十零分之五百九十零纳米带通滤波器（欧米茄光学）钙信号的过滤。
5. AIM两个卤素灯（新港奥丽尔仪器，斯特拉特福德，CT; SciMedia，科斯塔梅萨，加利福尼亚）的光导对测绘领域的观点，以达到均匀的照明。用于激励过滤器（四十〇分之五百三十一纳米，SemRock）。
6. 染色电压敏感染料相对湿度237原液通过注射口（10〜30μL）的心脏。
7. 组合聚醚F - 127的Rhod上午02时（悬液0.2ml）原液（Invitrogen公司，1:1的混合物）。 1分钟超声在水浴sonicator。通过泡沫捕手的端口注入混合物。等待约20分钟，让Rhod - 2 -酯化上午开始之前映射。
8. 对于一个记录，关闭灌流泵，以避免在表面的解决方案的议案;打开的激发光源（卤素灯）;采取使用这两款相机连接到数据采集系统（终极- L SciMedia）的光学录音关闭激发光;打开灌流泵。检查光信号的质量。重新染色的组织，如果必要的。
9. 完成的一项研究设计的实验方案的其余部分。
10. 打开室内的灯光，并采取包含视野的心脏的照片。室取出的心脏。漏所有的解决方案。在序列的试剂70％酒精（尔科技），去离子水，DI水冲洗灌注系统。
11. 数据分析包含的APD，简历，钙瞬变时间（CaTD），AP向右上挑和猫上升，钙瞬变的上升时间，和一个单指数拟合的CAT衰减的时间常数之间的延迟测量。

代表性的成果:

图1。一个的Langendorff灌注兔实验使用的全景光学测绘系统的代表结果。 （一）在兔心脏和重建，形成一个立体的网状网格表面的兔子心脏几何的前视图。 （B）T他解开心外膜表面颜色编码的快速心律失常发作时显示为红色的眼波相（相平面分析¹⁸获得）。 （三）光学行动从五个地点周围标记面板B.（四）八激活眼波（红色）传播的快照在一个稳定的折返性心律失常的周期由1-5的阶段奇异的潜力录音。波前圆顺时针围绕一个阶段的奇点，这是在心脏的前表面可见。复极的颜色（蓝色）是部分透明，让后波前是可见的（例如，在80毫秒，100毫秒，而120毫秒）。此折返性心律失常的电影中提供的补充视频1。几何重建，信号登记，计算相图，和表面解缠的方法是在细节别处⁶描述。

图2:从一个的Langendorff灌注兔心脏的实验使用的双绘图系统（动作电位和钙瞬变的同时映射）代表结果。 （一）心脏的前表面的黑点所涵盖的映射字段。 （B）从一个站点的录音特写。 （三）样品的痕迹（蓝色）的动作电位和钙瞬变阵列标记面板A.注意，并非所有的像素录音显示和空间分辨率为200μm的黑点均匀分布地点（红色）。

讨论

根据我们的经验，一个成功的Langendorff灌注兔心脏实验的关键，包括精心准备Tyrodes的解决方案，快速收获的心脏，维护良好的灌注压，和适当的pH值在灌注系统的含氧解决方案。为了记录尽可能高的信号信噪比的信号，我们需要考虑的因素包括光源，光学过滤器，聚焦光学系统，光电^探测器等19。这些方面的详细讨论其他^地方 19 。幼兔（4-5个月;重量:年龄7-9磅），可以用来避免心外膜脂肪，从而减少了信号，光信号的信噪比。

记录每个像素的信号是从组织体积所发出的光的加权融合。本组织体积的深度取决于所用染料的激发和发射波长。对于DI - 4 - ANEPPS，作为一个例子，估计穿透深度是在兔子心脏^20300μm。因此，光信号的解释应谨慎时，当地的电气功能的异质性窦房结，房室结，并在^室性心律失常1,21,22。

与电极记录相比，光的映射技术的一个限制，往往是由心脏收缩造成的运动伪影distored的光学动作电位复极相。可以用来减少工件机械约束，但不能完全消除它。相比之下，药理激发收缩uncouplers有效地​​消除运动伪影。然而，这些uncouplers（如2,3 - 丁二酮肟）可能有显著的电生理的副作用。 Blebbistatin被证明有²³在正常心脏的心脏电生理无不良副作用，因此是一个有前途的解偶联剂光映射。应该指出的是，加速水肿，由于取消收缩也可能影响电。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂	公司	目录编号
氯化钠	费舍尔科学，公平的草坪，新泽西州	S271 - 1
氯化钙2（H 2 O）	费舍尔科学，公平的草坪，新泽西州	C79 - 500
氯化钾	费舍尔科学，公平的草坪，新泽西州	S217 - 500
氯化镁2（H 2 O）	费舍尔科学，公平的草坪，新泽西州	M33 - 500
的NaH 2 PO 4（H 2 O）	费舍尔科学，公平的草坪，新泽西州	S369 - 500
碳酸氢钠3	费舍尔科学，公平的草坪，新泽西州	S233 - 3
D -葡萄糖	费舍尔科学，公平的草坪，新泽西州	D16 - 1
Blebbistatin	Tocris生物科学，Ellisville，莫	1760
DI - 4 - ANEPPS	Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA	D1199
RH237	Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA	S1109
Rhod - 2AM	Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA	R1244
聚醚F127	Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA	P3000MP
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma公司，圣路易斯，密苏里州	D2650