离体兔心Langendorff灌注的多参数光学标测

摘要

本文介绍了使用全景成像系统和双模态（电压和钙）成像技术，在离体兔心Langendorff灌流心脏上进行光学标测实验的基本操作步骤。

摘要

光学成像与荧光探针极大地推动了心脏电生理学领域的研究方法，其成效是其他技术手段无法实现的¹。利用钙离子和电压敏感性染料，光学标测能够在不与组织发生物理接触的情况下，以高空间分辨率测量跨膜动作电位和钙瞬变。这使得在许多传统电极难以使用或无法应用的条件下，仍可实现对心脏电活动的测量¹。例如，在刺激和除颤期间及之后，光学记录能够准确反映膜电位的形态变化，而传统电极技术则因电极极化而在刺激期间及之后产生刺激诱导的人工伪迹¹。

Langendorff灌流兔心是研究人类心脏生理学和病理生理学最常用的模型之一。临床上观察到的多种心律失常均可在兔心模型中重现。研究表明，在室性心律失常期间，兔心内的波形模式由心脏有效尺寸和折返波长决定，与人类心脏非常相似²。此外，兔心肌兴奋-收缩（EC）耦联的关键特征，例如肌浆网（SR）的相对贡献，也与人类的EC耦联极为相似³。本文介绍了在Langendorff灌流兔心中进行光学标测实验的基本操作步骤，包括Langendorff灌流系统的搭建、光学标测系统的设置、心脏的分离与插管、心脏的灌流及染料染色、兴奋-收缩解耦联处理以及光学信号的采集。这些方法也可适用于除兔以外的其他物种心脏，只需对流速、光学系统、溶液等条件进行相应调整。

介绍了两种光学标测系统。全景标测系统用于对兔心脏整个心外膜进行标测^4-7。该系统可提供心律失常发生和除颤过程中折返环演变的全局视图，并已被用于研究心律失常的机制及抗心律失常治疗^8,9。双通道标测系统则用于从同一视野内同步记录动作电位（AP）和钙瞬变（CaT）^10-13。该方法加深了我们对钙在电交替现象及心律失常诱发中重要作用的理解^14-16。

方案

1. 准备

1. 制备新鲜的 Tyrode 溶液（单位：mM，含 128.2 NaCl、1.3 CaCl₂、4.7 KCl、1.19 NaH₂PO₄、1.05 MgCl₂、20.0 NaHCO₃ 和 11.1 葡萄糖）。为加快溶液的日常配制，可预先配制两种储备液，并在 +4°C 冰箱中保存：（1）储备液 I（每 2L 含 g 数：374.6 NaCl、9.56 CaCl₂、17.52 KCl、8.21 NaH₂PO₄、10.67 MgCl₂）；（2）储备液 II（每 2L 含 g 数：84.01 NaHCO₃）。配制一次实验所需的 2L Tyrode 溶液时，取 1840 mL 去离子水，加入 80 mL 储备液 I、80 mL 储备液 II 和 4 g 葡萄糖，混合均匀。
2. 配制染料和解偶联剂的储备液：（1）激发-收缩解偶联剂 blebbistatin 储备液（Tocris Bioscience，2 mg/mL 的 DMSO 溶液）；（2）电压敏感染料 di-4-ANEPPS 储备液（Invitrogen，1 mg/mL 的 DMSO 溶液）；（3）电压敏感染料 RH 237 储备液（Invitrogen，1.25 mg/mL 的 DMSO 溶液）；（4）钙离子指示剂 Rhod-2AM 储备液（Invitrogen，1 mg/mL 的 DMSO 溶液）。一次兔心脏实验大约需要 30 μL di-4-ANEPPS 储备液、30 μL RH237 储备液和 200 μL Rhod-2AM 储备液。为避免反复冻融，我们将 di-4-ANEPPS 分装为每管 100 μL，于 -20°C 保存。其他染料也均在 -20°C 保存。溶解后的 blebbistatin 应保存于 +4°C 冰箱中。
3. 在取材心脏前，将 Tyrode 溶液转移至 2L 瓶中，并置于水浴装置（Fisher Scientific）中，使溶液温度维持在 37 °C。溶液以 95% O₂ - 5% CO₂ 混合气体进行氧合。通过调节氧合程度，将溶液 pH 值维持在 7.35±0.05。溶液在 Langendorff 灌流系统中循环，并在灌流管路中经由置于插管前的尼龙网滤器（孔径：11 μm，Millipore）进行过滤。
4. 在取材心脏前，准备好监测设备。使用压力换能器（WPI）监测实验过程中的主动脉压力。当心脏未连接至灌流系统时，将压力换能器的基线调至 0 mmHg。在腔室内放置伪 ECG 电极，以近似模拟 Einthoven 三角 ECG 的 I、II 和 III 导联。

2. 兔心脏的收获与灌注

1. 将兔子固定在兔固定器中，通过静脉注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）并联合使用2000 U肝素实施安乐死。当兔子完全死亡（以痛觉反射消失为判断标准）后，迅速打开胸腔，取出心脏和肺组织。
2. 在升主动脉上端、主动脉弓各分支之前做一切口，冲洗出升主动脉内的空气，然后迅速将心脏插管至已预先连接气泡捕获器的16号插管上；该气泡捕获器对于防止空气进入冠状动脉至关重要。一旦心脏在非循环式Langendorff灌流系统中实现逆向灌流，立即迅速剪开心包。
3. 在灌流冲洗血液的同时，去除肺、气管、脂肪及结缔组织。
4. 非常重要！将一段硅胶管（长约3 cm，直径2 mm）经肺静脉穿过二尖瓣插入左心室（LV），并在整个实验过程中保持其位置。该导管可释放滞留在左心室内的心肌灌流液。在机械固定心脏的Langendorff灌流实验中，若长时间无循环灌流，极易导致左心室腔内严重缺血并引发心律失常。
5. 将带有插管的心脏转移至配备光学标测装置的循环式Langendorff灌流系统中。

3. 使用全景光学成像系统进行实验

1. 将心脏置于定制的六边形腔室中，并将套管连接至灌注系统。通过调节灌注泵的流速，将主动脉压力维持在60 ± 5 mmHg。监测I导联伪心电图。将pH值维持在约7.35 ± 0.05。
2. 关闭室内灯光，因为blebbistatin会被紫外线及短波长光（450–490 nm）光解失活。¹⁷ 可见光谱部分。通过位于套管上方气泡捕集器中的注射端口，缓慢注入blebbistatin储备液。每次团注时缓慢注入0.1 ml blebbistatin。下一次注射前需等待压力稳定。
3. 将起搏电极轻柔地放置在根据实验设计确定的特定位置。
4. 从围绕心脏均匀分布的三个角度，对准位于每个光电二极管阵列（PDA）像平面处磨砂玻璃上的心脏图像进行聚焦。调节插管的位置以及每个PDA与心脏之间的距离，使心脏完全位于三个PDA的视场范围内。拍摄每块磨砂玻璃上已聚焦的心脏图像。
5. 缓慢注入 10˜20μL 通过气泡捕集器的注射端口将 di-4-ANEPPS 储备液加入灌流液中。等待 1˜3 分钟后开始光学记录。
6. 首次记录时，打开绿色LED灯（无激发滤光片，LED泛光，LUMILEDS），通过自制的数据采集系统，同步采集三个光电二极管阵列（PDA）的光学信号。⁵ 并关闭LED灯。检查所有三个PDA各像素信号的质量。若观察到光学动作电位中存在运动伪影，则加入0.1˜0.2 mL的blebbistatin储存液。再加入另一份 5 μL 如果信噪比较低，可使用 di-4-ANEPPS 储备液。
7. 完成功能性研究的预定实验方案。用心脏组织进行复染，增加额外的染色步骤 5μL 若因光漂白或信号流失导致实验过程中信号减弱，可添加 di-4-ANEPPS 储存液。
8. 功能研究完成后打开室内灯光。从36个等间距角度拍摄心脏图像。通过以固定步进旋转心脏实现 10° 使用固定在其中一个PDA位置的数码相机。
9. 取出心脏，排空所有灌注液。依次使用去离子水、70% 试剂级酒精和去离子水清洗灌注系统。
10. 数据分析包括根据36张数字照片重建心脏几何结构，将光学信号配准到重建的几何表面上，以及动作电位时程（APD）、传导速度（CV）、相位等参数的量化。⁶

4. 使用双映射系统进行实验

1. （接第2部分）将插管的心脏放入玻璃灌流室（Radnoti）中，并将插管连接至灌流系统。用针将心脏的心室顶端和心房固定在灌流室硅胶底部。
2. 关闭室内光源。在灌流插管前通过注射口缓慢注入blebbistatin储备液（约15˜20分钟使终浓度达到10μM），以使心脏静止不动。
3. 在心外膜表面放置一个塑料培养皿或其他玻璃盖片，以减少溶液表面的扰动。
4. 调节双通道光学标测系统（Ultima-L, SciMedia）中的两个CMOS相机，使其对准同一视野。发射的荧光通过二向色镜（635nm截止，Omega Optical）分离，并分别通过700nm长通滤光片（Thorlabs）采集电压信号，以及590/30 nm带通滤光片（Omega Optical）采集钙信号。
5. 将两盏卤素灯（Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA）的导光管对准标测视野，以实现均匀照明。使用531/40 nm激发滤光片（SemRock）。
6. 通过注射口注入电压敏感染料RH 237储备液（10˜30 μL）对心脏进行染色。
7. 将Rhod-2AM储备液（0.2mL）与Pluronic F-127（Invitrogen，1:1混合）混合。在水浴超声仪中处理1分钟。通过气泡捕集器的端口注入该混合液。等待约20分钟，使Rhod-2 AM完成去酯化反应后再开始标测。
8. 每次记录时，关闭灌流泵以避免溶液表面运动；打开激发光源（卤素灯）；使用连接至数据采集系统（Ultima-L, SciMedia）的两台相机进行光学记录；关闭激发光源；重新打开灌流泵。检查光学信号质量。必要时重新染色。
9. 完成本研究设计的其余实验步骤。
10. 打开室内光源，拍摄包含标测视野的心脏照片。将心脏从灌流室中取出，排空所有溶液。依次使用去离子水、70%试剂级乙醇（Fisher Scientific）和去离子水清洗灌流系统。
11. 数据分析包括动作电位时程（APD）、传导速度（CV）、钙瞬变持续时间（CaTD）、动作电位上升相与钙瞬变上升之间的延迟、钙瞬变上升时间，以及钙瞬变衰减单指数拟合的时间常数的测量。

代表性结果：

图1. 使用全景光学标测系统进行兔离体Langendorff灌注实验的代表性结果。（A）兔心脏的前视图，以及以三维网格曲面形式重建的兔心脏几何结构。（B）根据相位（通过相平面分析¹⁸获得）进行颜色编码的心外膜展开表面图，显示在心动过速性心律失常发作期间的波阵面（红色表示）。（C）来自B图中标记为1-5的相位奇点周围五个位置的光学动作电位记录。（D）稳定折返性心律失常一个周期内激活波阵面（红色）传播的八个时间点快照。波阵面围绕一个相位奇点顺时针旋转，该奇点可见于心脏前表面。复极化相位以蓝色表示，并设置为部分透明，以便观察心脏后侧的波阵面（例如在80 ms、100 ms和120 ms时）。本折返性心律失常的动态视频见补充视频1。有关几何重建、信号配准、相位图计算及表面展开的方法详见其他文献⁶。

图2. 使用双映射系统（同时记录动作电位和钙瞬变）在离体Langendorff灌流兔心脏实验中获得的代表性结果。(A) 心脏前表面，黑色圆点标示出映射视野范围。(B) 某一记录位点的局部放大视图。(C) 来自(A)图中黑色圆点标记的多个等间距位点的动作电位（蓝色）和钙瞬变（红色）典型记录曲线。注意：并非显示所有像素的记录结果，空间分辨率为200μm。

讨论

根据我们的经验，成功进行离体兔心Langendorff灌注实验的关键因素包括：配制良好的台氏液、迅速完成心脏取材、稳定维持灌注压力，以及灌注系统中氧合溶液的适当pH值。为了以尽可能高的信噪比记录信号，我们需要考虑光源、光学滤光片、聚焦光学系统、光电探测器等因素¹⁹。这些方面的详细内容在其他文献中已有讨论¹⁹。可选用年轻兔子（年龄：4–5个月；体重：7–9磅），以避免心外膜脂肪过多，后者会降低光学信号的信噪比。

每个像素记录的信号是来自组织一定体积内发射光的加权积分。该组织体积的深度取决于所用染料的激发和发射波长。以di-4-ANEPPS为例，在兔心脏中的估计穿透深度为300μm²⁰。因此，当窦房结、房室结以及室性心律失常期间存在电活动的局部异质性时，应谨慎解释光学信号^1,21,22。

与电极记录相比，光学标测技术的一个局限性在于，光学动作电位的复极化相常常受到心脏收缩引起的心肌运动伪影的干扰而发生畸变。机械约束可用于减少此类伪影，但无法完全消除。相比之下，药理性兴奋-收缩解偶联剂可有效去除运动伪影。然而，这些解偶联剂（例如 2,3-丁二酮单肟）可能对电生理产生显著的副作用。研究表明，肌球蛋白抑制剂 Blebbistatin 在正常心脏中对心脏电生理无不良副作用²³，因此是一种有前景的解偶联剂。需要注意的是，由于收缩被抑制可能导致水肿加速，这也可能影响电生理特性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	费舍尔科技	S271-1
CaCl2 (2H2O)	费舍尔科技	C79-500
KCl	费舍尔科技	S217-500
MgCl2 (6H2O)	费舍尔科技	M33-500
NaH2PO4 (H2O)	费舍尔科技	S369-500
NaHCO3	费舍尔科技	S233-3
D-葡萄糖	费舍尔科技	D16-1
Blebbistatin	托克里斯生物科学	1760
Di-4-ANEPPS	英维特罗根	D1199
RH237	英维特罗根	S1109
Rhod-2AM	英维特罗根	R1244
泊洛沙姆 F127	英维特罗根	P3000MP
二甲基亚砜 (DMSO)	西格玛-奥德里奇	D2650