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利用核磁共振波谱法对低密度浮游群落环境代谢组学样品中代谢物的浓缩方法

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DOI：

10.3791/3163

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2012年4月7日

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1Biosphere Oriented Biology Research Unit, RIKEN Advanced Science Institute, 2Graduate School of Nanobioscience, Yokohama City University, 3Advanced NMR Metabomics Research Team, RIKEN Plant Science Center, 4Graduate School of Bioagricultural Science, Nagoya University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种从浮游微生物群落中提取代谢物的方法。通过将样品过滤至特制的滤膜上，实现整个群落的采样。经过冻干处理后，提取水溶性代谢物。该方法可将环境代谢组学应用于自然或实验性微生物群落的跨组学研究。

摘要

环境代谢组学是一个新兴领域，正在推动人们对生物体在生化水平上如何响应环境以及彼此之间相互作用的新认识1。核磁共振（NMR）波谱法是多种可用于此类研究的技术之一，其他技术包括气相色谱-质谱联用（GC-MS），在该领域具有广阔前景。NMR的优势在于适用于非靶向分析，能够提供结构信息，并且其谱图可通过近年来可用的单个代谢物谱图数据库，以定量和统计方式进行比对查询2,3。此外，NMR谱数据还可与其他组学层面的数据（如转录组学、基因组学）相结合，从而更全面地理解生物类群对彼此及环境的生理响应4,5,6。然而，NMR的灵敏度低于其他代谢组学技术，因此在应用于天然微生物系统时存在困难，因为在这些系统中，样本生物数量通常密度较低，代谢物浓度也远低于来自定义明确且易于提取的来源（如完整组织、生物体液或细胞培养物）中的代谢物。因此，迄今为止开展的少数直接针对环境微生物的代谢组学研究，仅限于基于培养或易于定义的高密度生态系统，例如宿主-共生体系统、构建的共培养体系，或可额外使用稳定同位素标记以增强NMR信号的肠道环境操控实验7,8,9,10,11,12。目前尚缺乏能够将环境代谢物富集至适合NMR检测浓度的方法。鉴于近期研究 increasingly 关注水生环境中生物体的环境代谢组学，而水体中大部分能量与物质流动均由浮游生物群落介导13,14，我们开发了一种通过过滤法对浮游微生物系统中的全群落代谢物进行富集和提取的方法。 commercially available 亲水性聚-1,1-二氟乙烯（PVDF）滤膜经过特殊处理以彻底去除可提取物，避免其在后续分析中成为污染物。经处理的滤膜用于过滤感兴趣的环境或实验样品。含有湿样品材料的滤膜经冷冻干燥后，使用标准化的磷酸钾提取缓冲液2直接提取水溶性代谢物，用于常规NMR波谱分析。采用这些方法获得的数据可进行统计分析以识别有意义的模式，或与其他组学层面数据整合，以全面理解群落和生态系统的功能。

方案

1. 去除可提取物的滤器准备

  1. 使用 25 毫米直径、孔径为 0.22 μm 的 Durapore PVDF 亲水性滤膜（Millipore）。用镊子将滤膜放入干净的 500 ml Pyrex 烧杯中。用蒸馏水预冲洗三次，每次冲洗时充分振荡，防止滤膜相互粘连。加入 300 ml Milli-Q（Millipore）或同等质量的高纯水。进行高压灭菌，以彻底去除滤膜中的可溶出物。
  2. 倒出 Milli-Q 水，再用 Milli-Q 水对滤膜进行三次冲洗。用镊子将单个滤膜放置于干净干燥的表面（如铝箔纸）上，并在适当温度下（例如 37 °C）干燥或自然晾干。滤膜现已准备就绪，可供使用。

2. 样品材料的过滤

  1. 为演示本方案，使用 Millipore 不锈钢三联过滤装置，配备 25 mm 微型分析滤柱及玻璃支撑架，并连接机械泵。采用无菌操作技术，将一张 25 mm 滤膜置于滤柱底座上，安装滤柱并夹紧。
  2. 向滤柱中加入 15 ml 样品，打开过滤装置上的节流阀，启动泵。在轻微压力下过滤，以尽量减少细胞破裂（<5 kPa）。其他类型的泵（如手动泵或蠕动泵）也可适配本方案。对于密度较低的样品，可能需要连续添加水；在加水间隔期间，切勿让滤膜长时间干燥。
  3. 对于海水样品，在完成样品过滤后，可进行可选的去离子水冲洗步骤，以减少样品及滤膜上残留的顺磁性离子。此步骤可能有助于提高波谱仪磁体更精确的调谐效果。只需在过滤结束时，轻轻加入少量去离子水，并使其通过已收集的样品进行过滤即可。
  4. 过滤完成后，关闭泵，并保持阀门开启，使滤膜下方仍维持负压状态。取下夹具和滤柱。
  5. 一手使用洁净镊子夹住滤膜，将其对折，但不要压出折痕。另一只手用无菌 2 ml 微量离心管的管口边缘压住滤膜，松开镊子后，再用镊子重新夹住滤膜的两个边缘，并以与折痕成 45° 角的方向重新夹紧。
  6. 将滤膜放入 2 ml 离心管中，松开镊子使其自然展开，确保样品面朝内。可将最多两张滤膜以这种方式放入同一无菌 2 ml 微量离心管中。若使用两张滤膜，应尽量减少重叠面积。立即冷冻保存（至少 -30 °C）。

3. 提取水溶性代谢物

  1. 将样品冷冻干燥过夜或至少 10 小时。
  2. 冻干后，向每根试管（Tokken）中加入一个不锈钢研磨珠。加入 750 μl 含有 2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸钠（DSS）标准物的标准化磷酸钾核磁共振缓冲液（重水，2H > 90%）（KPi；38.3 mM KH2PO4，61.7 mM K2HPO4，DSS 0.1 mM，pH 7.0，90% D2O）2。
  3. 在 4 °C 条件下，将样品置于水浴超声仪（Bioruptor，Diagenode）中进行 5 分钟超声处理，以从滤膜上剥离细胞物质。用洁净镊子取出滤膜。
  4. 使用研磨仪（1600 rpm）破碎细胞，持续 5 分钟。
  5. 在台式摇床（Eppendorf）上 65 °C、1400 rpm 振荡条件下孵育 15 分钟。
  6. 用洁净镊子取出金属研磨珠，并在 13,000 g 条件下离心 5 分钟。
  7. 直接吸取上清液至核磁共振管中，用于核磁共振波谱分析。

4. 核磁共振波谱与数据分析

  1. 将样品装入核磁共振（NMR）波谱仪中（本实验使用配备三轴梯度TXI探头的Bruker DRX-500波谱仪，由运行XWIN-NMR软件的计算机控制）。
  2. 通过XWIN-NMR界面，采用已发表的适当方法2,15获取1D 1H NMR谱图。在本研究中，1H NMR谱图在298 K条件下于500.03 MHz的DRX-500波谱仪上采集。采用Watergate脉冲序列抑制残留水信号，重复时间为1.2 s。每张谱图采集128次瞬态信号，获得32,000个数据点。
  3. 将NMR数据目录转移至安装有NMRPipe软件16的PC。对原始数据进行处理，并以DSS为0 ppm参考标准，手动校正谱图相位。使用rNMR、Automics软件，或通过ECOMICS网站（https://database.riken.jp/ecomics/）公开提供的FT2B程序包3,17，对谱图数据进行积分或“分箱”处理，将其数字化为一组离散数值。在本示例中，使用ECOMICS在0.5至10.5 ppm范围内以0.032 ppm为积分区间进行积分，并将数据归一化至DSS或总信号强度。所得输出数据可用于后续统计分析，例如使用免费软件R18进行主成分分析（PCA）。

5. 典型结果

使用上述方法获得的1H NMR 谱图示例见图1。这些样品来自微宇宙实验中两个不同时间点，显示出由于藻类代谢活动引起的明显差异。第4天的谱图相较于第1天的样品，在3-4 ppm范围内显示出更多的峰信号，且峰强度显著。这些峰可归因于微宇宙中硅藻水华期间产生的糖类物质。在另一项类似实验中，通过比较天然浮游生物群落在人工海水与天然海水中的生长情况，可利用基于分段NMR谱图的主成分分析（PCA）得分图等统计方法，展示两种处理之间的显著代谢差异（图2），而载荷图则可用于识别影响数据分布的关键谱峰。此类结果可与其他组学层面的数据进行比较，例如基因组指纹图谱方法所得数据（图3）。这些NMR谱峰可单独进行查询（例如通过BMRB数据库；http://www.bmrb.wisc.edu/）19，或对整个谱图进行统计学分析（例如使用SpinAssign工具，网址：http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search）2。在本示例中，处理组之间的差异主要表现为天然浮游生物群落代谢物谱图中糖类区域（3.39 ppm至4.04 ppm）的峰信号更为丰富，同时利用SpinAssign初步鉴定出人工海水中浮游群落特有的若干谱峰，可能为乳酸和甲酸。

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图1. 采用本实验流程处理样品后获得的代表性1H NMR 谱图。微宇宙样品在硅藻大量繁殖前（第1天）和繁殖期间（第4天）采集。NMR 实验在 Bruker DRX-500 上进行，信号以内部标准物峰高（DSS；0 ppm）归一化。

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图 2. 基于微宇宙系统中天然（空心菱形）或人工（黑色圆点）海水中自然来源的浮游微生物群落代谢组的分段 NMR 谱图进行主成分分析（PCA）得分图。散点图中可明显观察到代谢差异。通过该分析生成的载荷图可用于识别体系中具有显著意义的特征峰；这些峰可根据需要进一步分析。

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图3. 结合核磁共振（NMR）与基因组数据的多组学分析示例。基于对与图2相同样品的18S（左）和16S（右）rRNA基因进行变性梯度凝胶电泳所获得的群落组成，也显示出天然（空心菱形）与人工（实心圆）海水微宇宙之间明显的微生物群落差异。代谢组与来自天然系统的基因组之间的这种对应关系，表明了该方法的应用价值。

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讨论

本文所展示的过滤与代谢物提取方法，能够收集到足量的浮游微生物生物量，用于核磁共振（NMR）代谢组学分析。尽管此处仅展示了使用磷酸钾缓冲液（KPi）提取水溶性代谢物并结合一维1H NMR检测的方法，但也可采用其他提取溶剂和光谱分析手段。一个有效的示例是使用氘代甲醇作为中等极性溶剂，该方法已被证明可从成分复杂的样品中获得更高质量的NMR谱图，且对海洋样品中常见的顺磁性离子污染具有较低的敏感性15。在此类情况下，上述提取步骤所得的沉淀物应予以保留，以便进行后续的连续提取。我们先前的研究已证实，在此类孵育时间和温度条件下谱图具有良好的稳定性，并验证了直接水相提取法适用于NMR波谱分析15,20。然而，研究人员也可根据需要对提取步骤进行调整，例如在提取前增加变性步骤以灭活酶活性，或采用不同于本实验中简单冷冻细胞的快速淬灭方法。此外，尽管本文所述方法最适合用于观察不同处理组间代谢物的相对变化，但如有需要，也可在过滤前对滤膜进行预称重，并在样品过滤及冷冻干燥后再次称重以获得干重数据，或利用过滤样品的体积来获取更具定量性的代谢物来源信息。

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致谢

本研究部分得到了日本文部科学省挑战性探索研究助成金（J.K.）以及科学研究费助成金（A类）（J.K. 和 S.M.）的资助。理化学研究所FPR博士后 fellowship（R.C.E.）提供了额外支持。作者对千叶惠介博士、关山泰世博士和冈本真美博士在核磁共振及统计分析方面的技术支持表示衷心感谢。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 μm 亲水性 Durapore PVDF 滤膜，25 mmEMD MilliporeGVWP02500
微量分析滤器支架，25 mm，带烧结玻璃支撑EMD MilliporeXX1002500
三通道不锈钢滤器装置，47 mmEMD MilliporeXX2504735
KH2PO4和光纯药工业株式会社169-04245
K2HPO4和光纯药工业株式会社164-04295
氘代水，2H > 90%Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-4
DSSFluka92754
AutomillTokkenTK-AM4包含不锈钢研磨器
Thermomixer comfortEppendorf5355 000.011
BioruptorDiagenodeUCD-200
真空浓缩仪EYELACVE-3100
NMRBruker CorporationDRX-500 配备 5 mm-TXI 探头
谱图分箱工具自主开发FT2DBhttps://database.riken.jp/ecomics/
代谢物注释工具与数据库自主开发SpinAssignhttp://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search

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