大鼠操作规程 原位 骨骼肌收缩特性

摘要

本视频展示了研究大鼠内侧腓肠肌标本收缩反应所需的手术准备及操作步骤 原位该制备方法可在生理条件下测量骨骼肌的收缩特性。将动物麻醉后，于肌肉远端将其从周围组织中分离。跟腱连接至力传感器，可在37°C且血液循环完整的情况下测量肌肉的收缩反应。

摘要

在许多情况下，需要在生理条件下（如正常血液循环、完整的整体肌肉、体温状态）获取骨骼肌的收缩反应。这包括对强直后增强、阶梯现象和疲劳等收缩反应的研究。此外，疾病、失用、损伤、训练和药物治疗所导致的影响也可能具有研究意义。本视频展示了建立和使用这一重要肌肉标本的适当操作步骤。

进行该制备时，需先将动物麻醉，并通过手术分离腓肠肌内侧头，保持其起点完整。操作过程中必须注意保留肌肉的血液供应和神经支配。清除坐骨神经一段较长区域的结缔组织，并在近端切断。将远端神经残端中所有不支配腓肠肌内侧头的分支全部切断。将远端神经残端插入内衬不锈钢刺激导线的套管中。切断跟骨，仅保留一小段骨骼仍附着于跟腱。可植入声学测微晶体和/或用于肌电图记录的电极。通过金属探针固定股骨和胫骨，以防止肌肉起点移动。将跟腱连接至力传感器，并将松弛的皮肤向两侧拉起，形成一个容器，内盛温热的石蜡油。油浴可使热量均匀分布，并减少蒸发散热。用红外热灯照射肌肉，使肌肉和大鼠逐渐升温至37°C。在升温过程中，可确定最大刺激电压和最佳肌肉长度。这些是开展完整整体肌肉实验所需的重要初始条件。实验内容可包括测定标准的收缩特性，如力-频率关系、力-长度关系以及力-速度关系。

只要在手术分离过程中小心操作，固定肌肉起点，并将肌腱单元与力传感器对齐，再辅以恰当的数据分析，即可利用该肌肉制备获得高质量的测量结果。

方案

1. 引言

1. MacIntosh 实验室多年来一直使用腓肠肌内侧头肌肉制备方法，此前则采用与 Phil Gardiner 博士共同开发的完整腓肠肌肌肉制备方法¹。

2. 麻醉

1. 在我们的实验室中，通常使用成年 Sprague-Dawley 大鼠（200–300 g）来研究肌肉的收缩特性in situ。可将大鼠固定在市售的有机玻璃固定装置中，或用毛巾包裹并手动固定。
2. 我们使用氯胺酮/赛拉嗪（每种均为 100 mg·ml^-1），按 85:15 混合，以每 100 g 体重 0.1 ml 的剂量进行肌内注射^2,3。也可使用戊巴比妥钠（50–60 mg·kg^-1，腹腔注射）或异氟烷（2–3.5%，吸入）⁴。
3. 在麻醉起效期间，可精确称量动物体重，并剃除左侧后肢的毛发。此时也应检查所有电子设备是否已开启并处于就绪状态，包括计算机、张力传感器放大器、油浴加热器等。
4. 应定期检查反射反应是否恢复，并根据需要追加麻醉剂（每 100 g 体重 0.05 至 0.1 ml）。

3. 开始手术

1. 我们使用一块有机玻璃平台来固定大鼠以进行手术。简单的美纹纸胶带即可完成固定。确保动物从左后肢到右前肢充分伸展。在眼睛上滴加一滴润滑剂，我们使用石蜡油，否则在氯胺酮麻醉下眼睛会变干。
2. 使用小型手术灯较为方便。这种灯发出的热量有助于维持动物体温。也可选用循环水加热垫。在继续操作前，需确认角膜反射或脚趾夹捏反射已消失。由于该操作为急性实验，无需无菌操作技术。动物不会从麻醉中恢复。当所有操作完成后，我们通过麻醉过量（0.2 ml，心脏内注射）对大鼠实施安乐死。
3. 第一道切口从足跟开始，沿皮肤切至脊柱。我们使用剪刀，因为可以控制切割深度，并用剪刀分离皮肤与下方组织。大鼠止血能力良好，只要避免损伤大血管，出血将十分有限。尽可能使用等渗盐水浸湿的纱布覆盖暴露的组织表面。
4. 当皮肤与下方结缔组织分离后，开始切开浅层肌肉层。注意不要切得太深，以免损伤坐骨神经、血管或目标肌肉。从腓肠肌上方开始，沿皮肤切口的同一方向向近端切开。可轻轻掀开组织观察下方结构，以定位并避开坐骨神经。一旦看到神经，可沿其走行方向继续切开，但切口应保持在神经上方一定距离。肌肉之间存在明显的分界线，找到该分界线后，沿此线向膝关节方向切开。注意观察并避开血管。

4. 在股骨上制备骨钉的导孔

1. 切开股骨远端表面的薄层肌肉，暴露骨面。使用手持式旋转工具、钻头或手摇钻（0.9 mm碳钢钻头），在骨皮质上钻一个小的导向孔，深度仅穿透皮质并进入骨髓腔即可。切勿钻得过深，以免引起大量出血。此孔后续将用于插入骨针，以固定股骨于肌动图仪底座上。

5. 分离腓肠肌内侧头的神经支配

1. 下一步需要使用解剖显微镜。找到胫神经消失于内侧腓肠肌后方的位置。轻轻分离各分支，并切断所有不支配内侧腓肠肌的分支。可通过微刺激确定支配关系。在此阶段，还需确保切断坐骨神经的浅表分支。
2. 现在清除坐骨神经周围的结缔组织，以便后续将其置入神经套管（稍后操作）。务必轻柔处理神经。任何对神经的牵拉都可能导致其失去兴奋性，从而提前终止实验。

6. 分离跟腱和腓肠肌

1. 可使用钝性分离法（必要时辅以剪刀）将腓肠肌与其他组织分开。将跖肌肌腱从跟腱下方拉出，结扎并切断。结扎仅用于固定肌腱，在切断肌腱并将跖肌与腓肠肌沿较长一段分离后，即可剪除结扎线。用一根#1号丝线结扎跟腱，打方结固定。结扎时不可过紧，以免损伤肌腱。我们使用咬骨钳切断跟骨，保留一小块骨组织仍附着于跟腱上。切割时保持切面水平，以确保骨骼被切断而非仅切断肌腱。这一步可保证后续能将跟腱牢固固定于肌力测量仪上。
2. 在腓肠肌的腹侧可见比目鱼肌。再次使用钝性分离法将比目鱼肌与腓肠肌分开。我们的目标是分离出内侧腓肠肌，使其成为唯一仍与跟腱相连的肌肉。在比目鱼肌肌腱远端附近将其切断。随后可分离内侧与外侧腓肠肌，并切断外侧肌腱，仅保留内侧腓肠肌与跟腱相连。将外侧腓肠肌从内侧腓肠肌上沿约50%的长度拉开。超过此长度后，肌纤维会相互交叉，继续牵拉将导致组织损伤。检查确认肌肉已完全去除结缔组织。

7. 切断胫骨

1. 在骨干上打一个结扎线，位置略高于中点。结扎需紧固，但不得切入组织。打结前先绕第二圈有助于防止滑脱。再次使用方结进行固定。
2. 使用小型锯子将下肢截除。切割位置应在胫骨中段附近。
3. 将一根尖头探针插入胫骨骨髓腔内。该探针将用于将胫骨固定在肌动仪底座上以实现固定。
4. 使用米歇尔夹（Michel clips）将两根弹性线固定在皮肤上。这些弹性线及额外添加的弹性线将用于将皮肤向上提起并围绕肌肉形成一个容器，随后将注入温热的石蜡油。

[可选]

8. 插入声学测距晶体（可选步骤）⁵

1. 将动物置于调至低档的加热垫上。此时可插入直肠探头（若尚未插入），使用少量石蜡油进行润滑。
2. 利用微刺激法确定肌束在肌肉内的起止点。用21号针头分别刺入肌肉起点和止点的部位。
3. 将声学测距晶体沿针头刺出的孔道插入，并用Vet-Bond外科胶水密封。胶水用量宜极小，确保恰好覆盖晶体。将胶水涂抹在尖角剪裁的纸片上，有助于精确施胶。我们将在通过微刺激法确定的肌束止点处额外放置一枚晶体。

[继续]

9. 在装置中安装（见图1）

1. 将大鼠置于肌动图仪基座上，使胫骨探针朝向杠杆。将探针放入固定夹中，以固定腿部。
2. 将两侧皮肤向上拉起，形成一个容器，并用弹性带固定。
3. 设置钻头（1/16）^th 将钻头（安装在手摇钻中）插入股骨，利用手术准备过程中预先钻好的导孔。在放置钻头时，务必支撑住股骨的前部，以免股骨断裂，导致实验提前终止。将手摇钻固定在横杆上，以固定股骨。
4. 将坐骨神经远端残端穿过神经刺激套管（阴极朝向肌肉），并将其折叠回靠近肌肉起点处。将刺激器连接至这些导线上。
5. 将跟腱连接到带有应变计传感器的杠杆上。绑扎时应牢固，但需预留后续调整的空间。确保肌肉的排列方向与杠杆垂直。
6. 用温热的石蜡油填充由皮肤形成的容器。
7. 打开加热灯，并将用锡箔制成的遮挡板置于动物头部和力传感器上方。可能需要额外的锡箔遮挡板，以确保动物的核心体温不超过 38 °C可通过调整肌肉长度，直至内侧腓肠肌与力传感器之间的连接线无松弛。

10. 设置最大电压和参考长度

1. 在肌肉预热的同时，设置刺激器并测试刺激电压。必须确保刺激的脉冲持续时间非常短暂，我们通常使用 50 μs。最大电压应低于 1 V。从 0.5 V 开始逐步增加电压，直至抽搐幅度不再增大。最大电压是指能够激活所有运动单位的最低电压。我们通常以最大电压的两倍或 3 V（取较高者）进行刺激。
2. 通常，实验开始时将肌肉置于产生最大抽搐收缩的长度。通过单个刺激脉冲获得一次抽搐反应。然后将肌肉长度增加约 1 mm，再次引发抽搐。只要抽搐幅度仍在增加，就重复此过程。一旦抽搐幅度开始下降，便将肌肉长度恢复至产生最大幅度抽搐的长度。
3. 完成初始长度设定后，我们通过所谓的“预适应强直收缩”来测试系统。将刺激器设置为以 200 Hz 的频率持续刺激 500 ms。该刺激会引发完全融合的强直收缩。肌肉产生的力量将拉紧所有连接部位，包括肌肉上的结。在充分休息以消除增强效应⁴后，重新设定肌肉的参考长度（见第 9.2 部分）。通常，预适应强直收缩会导致肌束长度有所缩短，因此需要略微拉伸肌肉，使其恢复到能产生最大幅度抽搐收缩的长度。

11. 启动实验

1. 一个典型的实验将包括长度调节和/或采用多种刺激模式进行刺激。数据采集可能仅涉及力，或同时采集力、长度、肌束长度和肌电图。

[可选]

12. 力-频率关系²

1. 设置足够长的刺激持续时间，以使在任何感兴趣的频率下均能达到力量的平台期。在200 Hz时，腓肠肌内侧头可达到最大等长收缩力。刺激持续时间至少应为200 ms；对于较低频率，更长的持续时间效果更佳，但如果使用多次收缩来确定力-频率关系的完整范围，则可能导致一定程度的疲劳。我们通常采用0、20、40、60、80、100和200 Hz的刺激频率进行收缩实验。该频率范围可充分描述力-频率关系的完整特征。每次收缩之间必须给予适当的休息时间（1–10 分钟），以避免疲劳累积。

13. 力-长度关系⁶

1. 在先前已确定估计的最佳长度后，可使用伺服电机装置将肌肉长度系统地从 -4 mm 调整至 +4 mm，从而测定力-长度关系。此过程应采用最大刺激频率（200 Hz），但我们发现极短暂的收缩也能得到相同的真正最佳长度⁷。亚最大收缩（如单收缩）也可使用，但这将产生不同的力的长度依赖性⁸。
2. 测定力-长度关系的一个重要方面是需要估算在肌束长度下测得的力所对应的被动力。主动力计算为总力与相应被动力之间的差值。由于并联弹性结构承受被动力，而这些结构与串联弹性结构呈串联关系，因此在收缩过程中，随着串联弹性结构被拉伸，被动力对总力的贡献必须减少³。一旦已知所有相关肌肉长度下的被动力，即可通过声学测微技术连续测量肌束长度来估算相应的被动力，或通过估算测量系统以及肌肉-肌腱单元中串联结构的顺应性来实现。若不进行此校正，则会对标本的最佳长度和峰值力产生低估。

14. 力-速度关系⁹

1. 如果需要测定力-速度关系，则需将力传感器连接至一个可控制负荷或长度变化速率的系统。最简单且成本最低的方法是使用气压来限制肌肉在可控负荷下的缩短。在我们的系统中，肌肉连接在支点一侧的杠杆上，而气压则作用于另一侧以阻碍长度变化。需要使用长度传感器，以便检测等张收缩期间肌肉长度的变化。该装置可实现具有气动阻力的后负荷收缩。双气罐系统可实现等长收缩后释放至等张负荷。应获取总共15-20次收缩数据，负荷范围从接近无负荷至最大等长收缩力。在将数据拟合至方程时，不应使用超过等长收缩力90%的负荷数据⁹。

15. 代表性结果：

图 2 展示了样本收缩曲线。这些收缩数据用于说明收缩力与刺激频率之间的关系。计算这些收缩的峰值主动收缩力，并将主动收缩力对频率作图，可得到图 3，即力-频率关系曲线。图 2 中的数据可拟合为以下方程：AF=c/(1+eˆ((a-F)/b)+d)；其中 AF 表示主动收缩力，F 表示频率，a、b、c 和 d 为常数。

对于大鼠内侧腓肠肌，在未疲劳肌肉中，刺激的半最大频率通常为 50–60 Hz²。实验结果将与上述方程描述的曲线高度吻合。

图1. 实验装置与肌肉设置：左侧为气动装置，右侧为等长收缩装置。左侧所示的杠杆系统在需要进行动态收缩实验时连接至移动平台（改编自¹³）。步进电机由计算机控制（改编自¹⁴）。

图 2. 重叠的等长收缩：20、40、60、80、100 和 200 Hz。200 Hz 收缩的幅度为 8.13 N。

图3. 力-频率关系：将图2中的收缩主动力进行绘图，线条表示最佳拟合线。

讨论

通过仔细的手术准备、牢固地将标本安装在仪器上以及使用高质量的电子设备，可以获得良好的收缩质量结果。当学生学习该手术时，一些常见的失误包括：拉伸坐骨神经、破坏血流以及过度出血。必须小心处理神经，以防止损伤。如果在最佳长度下的最大强直收缩力明显低于图3所示，或激活所有运动单位所需的最大刺激电压超过5伏，则表明神经已受损。在手术过程中，相对容易避开为该肌肉供血的血管。当钻头置于股骨尾端表面时，可能会损伤这些血管。如果引导孔未对准股骨的平坦面，钻头可能发生滑动，进而有可能损伤腘血管。若装置安装完成后肌肉周围出现血液积聚，表明这些血管已被破坏。如果较大的静脉被切断且未结扎，也可能导致过度出血。需特别注意踝部周围的较大静脉。

in situ 肌肉制备是研究肌肉收缩特性的有效方法。可以激活单个运动单位¹⁰，但通常所有运动单位会同步激活。与通过自主运动单位募集所产生的正常异步激活相比，这是一种劣势，因而构成一种局限性。然而，从积极角度来看，同步激活能够量化所有运动单位的平均反应。

有两种方法可用于避免同步激活。一种是使用带有多个刺激导线对的电极套管。这种方法允许每对导线激活部分运动单元，并通过轮流使用不同的导线对实现异步激活。这种激活方式可与阳极阻滞¹¹相结合，以尝试根据大小原则¹²按适当顺序激活运动单元。在此方法中，所有运动单元均由近端的一对电极激活，同时通过直流电刺激施加阻滞。可通过调节阻滞刺激的幅度来抑制不需要激活的运动单元。显然，阻滞在最低电压下首先影响较大的轴突，并逐渐影响更小的单位。

的 原位 大鼠腓肠肌制备是研究健康与疾病状态下骨骼肌收缩特性及生物化学特性的有价值的生理学方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电推剪			高质量的宠物电推剪
手术灯	Dyna-Lume		多种型号均可使用
肌动描记仪			定制设备
刺激器	Grass Technologies	S-88	多种型号均可使用
应变计放大器	CWE, Inc.	PM-1000
遥测温度计	YSI	YSI-400
机器人平台	Arrick Robotics	MD-2
声学测距放大器	Sonometrics	Sonolab
计算机与数据采集系统	配备NI数据采集卡的PC机		定制软件（LabVIEW）
块状加热器	Labline Instruments	Multi-block
神经套管			自制
微型刺激器			自制