本文描述了一种利用钛宝石飞秒激光振荡器的双光子吸收效应，对含有笼锁型荧光蛋白的单个细胞进行光激活的方法。为了对光激活的细胞进行命运图谱绘制，采用免疫组织化学技术。该技术可应用于任何类型的细胞。
本文内容
摘要
摘要
对单个细胞进行差异标记的能力在发育生物学中具有重要意义。例如，确定造血、淋巴和血管谱系在发育中的胚胎中如何形成，需要对未分化的前体细胞进行命运图谱绘制和谱系追踪。近年来，光激活蛋白如 Eos1, 2、PAmCherry3、Kaede4-7、pKindling8 和 KikGR9, 10 作为细胞示踪探针受到了广泛关注。这些光敏蛋白的荧光光谱可通过紫外光激发轻松转换，从而能够将一群细胞与邻近细胞区分开来。然而，激活后蛋白的光效率可能限制长期的细胞追踪11。作为光激活蛋白的替代方案，笼锁型荧光素-葡聚糖已在胚胎模型系统中被广泛使用7, 12-14。传统上，为了释放笼锁型荧光素-葡聚糖的活性，通常采用荧光灯源或单光子紫外激光进行紫外激发；然而，这类光源限制了光激活的空间分辨率。本文报道了一种用于命运图谱绘制、谱系追踪以及检测单个标记细胞的实验方案。在注射了笼锁型荧光素-葡聚糖的胚胎中，利用钛宝石飞秒激光器产生的近红外激光脉冲对单个细胞进行光激活。该激光器是所有双光子共聚焦显微镜（例如本文所使用的 LSM 510 META NLO 显微镜）的标准配置。由于生物组织对近红外辐射具有通透性15，激光脉冲可聚焦于胚胎深层，而不会在选定焦平面的上方或下方激活细胞。因此，仅在几何焦点处诱导非线性的双光子吸收，从而在单个细胞内释放荧光素-葡聚糖。为检测含有释放后荧光素-葡聚糖的细胞，我们描述了一种简单的免疫组织化学方案16，以快速可视化被激活的细胞。本文所介绍的激活与检测方案具有良好的通用性，可应用于任何模型系统。
注意：本方案中使用的试剂可在文章末尾附带的表格中找到。
方案
1. 笼锁型荧光素-葡聚糖的合成（改编自参考文献14）
- 配制 0.1 M 硼酸钠溶液，用 ddH₂O 稀释2O.
- 称取4 mg的10 kDa氨基葡聚糖，加入CMNB-笼锁荧光素管中。
- 添加 500 μL 将配制好的硼酸钠溶液（步骤1.1）加入CMNB-笼锁荧光素管中。盖紧管盖，涡旋振荡30秒以溶解混合物。
- 在室温下于旋转混合仪上避光反应过夜。用金属箔包裹试管，以避免混合物暴露于环境光线下。
- 获取一个Zeba脱盐离心柱，拧下底部盖帽。在柱子上标记一个点，用于离心时定位方向。将柱子放入一个15 mL圆锥形Falcon管中。注意：离心柱中的溶液为柱缓冲液。
- 松开脱盐离心柱的顶盖。将装有脱盐离心柱的15 mL圆锥形Falcon管放入离心机中。使离心柱上的标记点（步骤1.4）朝向离心机转子的中心。在室温下以1000 × g离心2分钟。
- 离心后，从 Falcon 管中取出脱盐离心柱，弃去收集的穿流液及 15 mL 圆锥形离心管。取一个新的 15 mL 圆锥形 Falcon 管，将脱盐离心柱放入新的 Falcon 管中。注意：离心后，柱内树脂床应呈现压实状态。请立即使用该柱。
- 获取第1.3步中的反应混合物（笼状荧光素-葡聚糖）。取下脱盐离心柱的盖子，用移液器吸取反应混合物，并缓慢加至脱盐离心柱的中心。加样完毕后，重新盖上离心柱盖子。
- 将装有脱盐离心柱的Falcon管放入离心机中。参照步骤1.5的操作，使离心柱上的标记点朝向离心机转子中心。在室温下以1000 × g离心2分钟。
- 离心后，将收集到黄色混合物（笼锁型荧光素-葡聚糖）（约 400 μL) 加入15 mL Falcon管中。将笼锁荧光素-葡聚糖混合物转移至1.5 mL微量离心管中。
- 立即用金属箔覆盖试管，避免混合物暴露于环境光线下。在真空离心浓缩仪中冻干偶联荧光素-葡聚糖混合物。冻干过程的 350 μL 大约需要4小时。
- 完全冻干后，将粉末（约3 mg）重悬于ddH₂O中。2O 至终浓度约为 1% w/v。短暂涡旋振荡以混匀并悬浮粉末。
- 将笼锁型荧光素-葡聚糖分装至单独的金属箔包裹的试管中，并于 -20 °C.
2. 胚胎的收获与荧光素-葡聚糖探针显微注射
* 本实验以斑马鱼作为动物模型系统。
- 注射前一天，在繁殖缸中设置斑马鱼交配组合，雄鱼与雌鱼比例为1:1或2:1，并使用隔板分隔。
- 次日早晨更换繁殖缸中的水并移除隔板。立即配制5 μL的笼锁荧光素-葡聚糖工作液，将其稀释10倍，溶剂为1× Danieau培养基（参见溶液配制）或ddH2O。用金属箔包裹工作液管，避免光照。
- 将配制好的笼锁荧光素-葡聚糖溶液（步骤2.2）吸入注射针中。在体视显微镜下剪切针尖至合适大小前，先在白色光源前放置一块透明黄色滤光片。该黄色滤光片可防止注射过程中荧光素-葡聚糖自发解笼。通过目镜观察时，光源应呈黄色。
- 收集胚胎并用移液器转移至显微注射模具板中。设定显微注射量为3至4 nL的笼锁荧光素-葡聚糖。在体视显微镜下用镊子调整胚胎方向，将3至4 nL的笼锁荧光素-葡聚糖注射至卵裂球细胞基部（卵裂球-卵黄交界处）。注射时胚胎应处于1-至2-细胞期。
- 注射后，将胚胎从显微注射模具板中取出，转移至含新鲜鱼水的洁净培养皿中。可在鱼水中加入亚甲蓝，终浓度为0.02 % w/v，以抑制真菌生长。用金属箔覆盖培养皿，防止注射入的笼锁荧光素-葡聚糖提前解笼。
- 将注射后的胚胎培养至目标细胞需要光激活的发育阶段。进行光激活前，用ddH2O配制0.6 %低熔点琼脂糖溶液。根据胚胎发育阶段，可向低熔点琼脂糖中添加Tricaine（MS222）。具体操作为：将0.02% Tricaine稀释至低熔点琼脂糖中，终浓度为0.0014 %。
- 一旦胚胎达到合适的发育阶段，立即在1× Danieau培养基中用镊子去除胚胎的绒毛膜。去膜过程中，确保白色光源路径中放置有透明黄色滤光片（见步骤2.3）。
- 将0.6 %低熔点琼脂糖溶液加热至37 °C。吸取1 mL低熔点琼脂糖加入LabTek腔室盖玻片的孔中。小心地将3至4个胚胎埋入低熔点琼脂糖中，并用镊子调整方向，使待光激活的细胞朝下紧贴底部盖玻片。
- 待琼脂糖凝固后，向琼脂糖上方缓慢加入1 mL的1× Danieau培养基。
- 对更多胚胎重复步骤2.8至2.9。
3. 双光子激活笼锁型荧光素-葡聚糖
* 本实验步骤假设胚胎表达报告基因 GFP。使用连接到 LSM 510 META NLO 显微镜的氩离子（488 nm）激光源观察胚胎。选择一个 GFP 阳性细胞，并利用与 LSM 510 耦合的 Mai Tai 激光器（飞秒激光）进行光激活。对于无荧光的胚胎，操作步骤相同。也可先使用白光定位待激活细胞，随后用 Mai Tai 激光源进行激活。
- 启动 LSM 510 软件。将透明黄色滤光片放入白光光路中。
- 选择“扫描新图像”，然后点击“启动专家模式”。
- 选择“激光”选项卡。打开氩离子激光器（488 nm）和 Mai Tai（飞秒）激光器光源。
- 将 Mai Tai 激光波长设置为 740 nm。
- 选择“配置”选项卡。为氩离子激光器和 Mai Tai 激光器设置光路配置。
- 选择“扫描”选项卡。将物镜更改为 20X/0.8。
- 通过点击“最大”按钮设置最大扫描速度。
- 将模式、方法和次数分别设置为“线扫描”、“平均”和“1”。
- 在“通道”选项卡下，取消选择除 Mai Tai 以外的所有激光光源。
- 在光路中放置一个功率计。
- 选择“连续”按钮以启动连续扫描。
- 调节透射百分比，直到功率计显示平均激光功率为 47 mW。
- 通过选择“停止”按钮结束扫描。
- 在“通道”选项卡下，取消选择 Mai Tai 激光器，并选择氩离子激光器（488 nm）。
- 选择“快速 xy”按钮。在“通道”选项卡下，调节氩离子激光器的针孔、探测器增益、放大器偏移和放大器增益，以获得最佳图像质量。
- 使用载物台控制器找到待激活的细胞并调焦。
- 点击“停止”按钮。
- 使用缩放工具放大已激活的细胞，直至“模式”选项卡下的缩放倍数显示为 50 至 70。
- 通过选择“停止”按钮结束扫描。
- 在“通道”选项卡下，取消选择氩离子激光器（488 nm），并选择 Mai Tai 激光器。
- 在“模式”选项卡下，将扫描速度设置为 31.46 秒。
- 选择“单次”按钮，开始对选定细胞的笼锁型荧光素-葡聚糖进行双光子激活扫描。
- 激活后，在“通道”选项卡下取消选择 Mai Tai 激光器，并重新选择氩离子激光器（488 nm）。
- 将“模式”下的缩放倍数设为 1，并点击“速度”标题下的“最大”按钮，设置为最快扫描速度。
- 选择“快速 xy”以查看光激活区域。检查光激活区域是否未发生激光消融。有关激光消融的更多信息，请参阅讨论部分。
- 对其他胚胎重复上述步骤。
4. 解笼化荧光素-葡聚糖的免疫检测（改编自参考文献16）
- 光激活后，在白光光源前放置一个透明的黄色滤光片，并使用尖头镊子手动将每个胚胎从低熔点琼脂糖中取出。将所有取出的胚胎放入一个新的培养皿中，内含新鲜的1× Danieau培养基。用金属箔覆盖培养皿，以防止胚胎暴露于光照下。
- 如有需要，将胚胎培养至目标发育阶段。同时，配制4%多聚甲醛溶液（参见“溶液配制”部分）。将1.5 mL配制好的多聚甲醛分装至微量离心管中。
- 当胚胎达到目标发育阶段后，用移液器将胚胎转移至步骤4.2中的微量离心管中。用金属箔覆盖管口，避免光照。
- 在4°C条件下于摇床上孵育过夜。次日，准备梯度乙醇（EtOH）溶液，分别用磷酸盐缓冲液（PBS）和ddH2O配制：30% EtOH:PBS、50% EtOH:PBS、70% EtOH:ddH2O和100% EtOH。
- 次日，将胚胎从4°C取出。移除管口的金属箔，迅速吸除多聚甲醛（保留少量液体以完全覆盖胚胎）。向管中加入1.5 mL 30% EtOH:PBS。重新用金属箔覆盖管口，在室温下于摇床上孵育10分钟。
- 依次使用50%、70%和100%梯度乙醇溶液重复步骤4.5。在100% EtOH洗涤后，再次用100% EtOH冲洗胚胎10分钟。
- 洗涤完成后，将胚胎在-20°C下过夜保存。次日，准备磷酸盐缓冲吐温溶液（PBT；参见“溶液配制”部分）、5×封闭缓冲液（参见试剂说明书配制方法）、马来酸缓冲液（配制方法见封闭缓冲液说明书）、10 mg/mL蛋白酶K，以及10×抗体溶液（Anti-fluorescein-AP；参见“溶液配制”部分）。
- 另将2%小羊血清（LS；参见“溶液配制”部分）用PBT稀释。将抗体溶液在4°C摇床上孵育过夜。2% LS可在4°C保存。
- 次日，将胚胎从-20°C取出。移除管口的金属箔，迅速吸除100% EtOH。向管中加入1.5 mL 70% EtOH:ddH2O。重新用金属箔覆盖管口，在室温下于摇床上孵育10分钟。
- 依次使用50%和30%梯度乙醇溶液以及100% PBT重复步骤4.8。在100% PBT洗涤后，再用100% PBT冲洗胚胎3次，每次10分钟。
- 若胚胎发育超过24小时，需进行蛋白酶K处理；否则，直接进入步骤4.13。具体操作：将已配制的蛋白酶K（步骤4.7）用PBT按1:1000稀释。将胚胎在蛋白酶K中孵育10分钟，若胚胎更老，则可延长孵育时间。孵育过程中需用金属箔覆盖，避免光照。
- 蛋白酶K处理后，用PBT洗涤胚胎5次，每次10分钟。洗涤后，在室温下用4%多聚甲醛在摇床上固定胚胎30分钟。固定后，立即用PBT再洗涤5次，每次10分钟。整个过程需用金属箔覆盖，避免光照。
- 通过将5×封闭缓冲液用马来酸缓冲液稀释至1×，配制封闭缓冲液。将胚胎从PBT中取出，转移至1×封闭缓冲液中。用金属箔覆盖后，在室温下于摇床上孵育5至6小时。
- 封闭5至6小时后，将胚胎在65°C进行热激处理15至20分钟。
- 取前一日配制的抗体溶液和2% LS。将抗体溶液在最大转速下离心。将上清转移至2% LS管中，轻轻颠倒混匀。
- 将胚胎从封闭缓冲液转移至LS-抗体混合液中。保持胚胎被金属箔覆盖，避免光照。在4°C下于摇床上孵育过夜。
- 次日，在室温下用PBT洗涤胚胎6次，每次15分钟。同时，准备AP缓冲液（参见“溶液配制”部分）。
- 在室温下用AP缓冲液洗涤胚胎2次，每次10分钟。准备NBT/BCIP显色溶液（参见“溶液配制”部分）。
- 将胚胎转移至NBT/BCIP溶液中，在避光条件下进行显色反应。
- 通过用PBT洗涤胚胎3次，每次5分钟，终止显色反应。
- 用于成像时，将胚胎置于0.6%低熔点琼脂糖或3%甲基纤维素中封片，并使用倒置或正置复式显微镜采集图像。
- 光激活样品可通过梯度乙醇脱水后长期保存以供后续分析（染色信号保持稳定）。按照步骤4.4至4.7进行样品脱水处理。
5. 代表性结果：
图 1. 光笼型荧光素-葡聚糖的光激活。（A，B）在13/14体节阶段，经光激活前的斑马鱼胚胎侧视图的明场与荧光图像。（C，D）在13/14体节阶段，使用波长740 nm、扫描时间31秒、平均激光功率47 mW的条件，对其中一个体节（箭头所示）进行光激活。光激活后（D），可观察到解笼释放的荧光素-葡聚糖产生的荧光信号。方向：背侧（右），腹侧（左）。比例尺：100 μm。
图 2. 笼锁型荧光素-葡聚糖的免疫检测。图 2 显示了在 18/19 小时受精后（hpf）的斑马鱼胚胎中，经光解激活后荧光素-葡聚糖的免疫染色结果。在 10 体节期，使用与图 1 中所述相同的激光参数，在胚胎侧板中胚层的一个小区域进行光解激活。通过免疫检测程序，箭头所指即为被激活的区域，且背景染色极低。方向：背侧（上），腹侧（下）。比例尺：100 μm。
讨论
本文介绍了一种基于光激活笼锁型荧光素-葡聚糖的单细胞命运图谱绘制的多功能方法。通过将Mai Tai飞秒激光器与Zeiss LSM 510 META共聚焦显微镜联用，利用双光子吸收在单个细胞中实现笼锁型荧光素-葡聚糖的解笼锁。在光激活的细胞中，解笼锁后的荧光素-葡聚糖可通过简单的免疫组织化学步骤快速可视化。
在本实验方案中，用于光激活笼锁型荧光素-葡聚糖的双光子吸收波长为 740 nm。该波长是通过在注射了笼锁型荧光素-葡聚糖的野生型胚胎中进行实验测定的。激光激发波长在 600 至 800 nm 范围内变化，并定性判断光激活后是否存在荧光素荧光。我们发现，740 nm 激发后产生的荧光素信号最强。理想情况下，740 nm 应适用于所有模型系统；然而，我们建议测试一系列波长，以确定您的样品的最佳双光子激发波长。
在显微注射了笼锁型荧光素-葡聚糖的野生型胚胎中，针对每种测试的双光子激发波长，我们也改变了激光的平均功率。当激发波长为740 nm时，47 mW的平均激光功率在激活区域产生的荧光素信号强于较低平均功率下的信号。更高的平均激光功率并未产生更强的荧光素信号，但会引起组织消融。由于飞秒激光脉冲在消融生物组织方面效率较高15，我们建议确定光激活的阈值平均激光功率，以避免组织消融。
双光子吸收发生在一个较小的相互作用体积内。为了确保笼锁型荧光素-葡聚糖被充分激活，必须将细胞调整至合适的焦平面。在上述方案中，通过白光同时观察GFP阳性细胞，以确认细胞的聚焦状态。因此，建议在采集其他通道图像的同时也进行白光图像的采集。在确认细胞聚焦后，本方案建议放大所激活的细胞。推荐的放大倍数为50至70倍，但该数值取决于所选细胞的大小。增加放大倍数可将激活的细胞与邻近细胞分离开来，并限制双光子激活的扫描区域。理想情况下，扫描区域应覆盖细胞的较大范围。
检测单个活化细胞要求背景染色尽可能低。在上述免疫检测方案中，关键步骤是将样品在封闭缓冲液中封闭5至6小时（步骤4.13）。使用NBT/BCIP显色时，光解后的荧光素标记葡聚糖应在10至20分钟内可见。如果背景染色较强，建议延长封闭时间，并增加洗涤次数以去除抗体（步骤4.17）。
图1和图2展示了光激活与免疫检测的代表性结果。在图1中，将笼锁型荧光素-葡聚糖注射到野生型胚胎的早期1-至2-细胞阶段。胚胎培养至体节发生中期，并以侧向固定于低熔点琼脂糖中。图1(a,b)显示了光激活前胚胎的明场与荧光图像。图1(b)中未见荧光素荧光信号，表明荧光素仍处于笼锁状态。使用平均激光功率47 mW、波长740 nm的激光照射31秒，对体节内的一个小区域进行激活，如图1(c)所示（箭头）。激活后，荧光素-葡聚糖发生双光子脱笼，表现为激活区域出现荧光信号，如图1(d)所示（箭头）。由于体节组织保持完整，未发生激光消融，如图1(c)所示。图2展示了脱笼后荧光素-葡聚糖的免疫检测结果。在10个体节期胚胎的侧板中胚层中，使用与图1所述相同的激光参数对一小区域进行光激活。随后按照步骤4.1至4.20对胚胎进行培养与处理。图2中的箭头指示了被激活的区域，表现为蓝色沉淀物的聚集。仅在激活位置可清晰检测到信号，无背景染色干扰。
溶液的制备：
1 X PBT（1 L）
100 mL 10 X PBS
2 g BSA
10 mL 20 % Tween
10 X PBS（1 L）
80 g NaCl
2 g KCl
6.1 g Na2HPO4
1.9 g KH2PO4
ddH2O 定容至 1 L
调 pH 至 7.3
4% 多聚甲醛（160 mL）
32% 多聚甲醛（两支 10 mL 安瓿瓶）
8 mL 20× PBS
132 mL ddH2O
AP缓冲液（50 mL）
1 mL 5 M NaCl
2.5 mL 1 M MgCl2
5 mL 1 M Tris pH 9.5
250 μL 20 % Tween
41.25 mL ddH2O
抗体溶液（适用于1个样本）
5.5 μL 丙酮粉
40 μL PBT
0.8 μL LS
0.1 μL 抗荧光素-碱性磷酸酶抗体
2% LS（每样本 360 μL）
7.2 μL 100% LS
352.8 μL PBT
1 X Danieau 培养基（1 L）‡
11.6 mL 5 M NaCl
700 μL 1 M KCl
400 μL 1 M MgSO4
600 μL 1 M Ca(NO3)2
5 mL 1 M HEPES
ddH2O 定容至 1 L
pH 调至 7.6
‡ Danieau 溶液是培养去壳斑马鱼胚胎的理想盐溶液。也可使用其他培养基，前提是其为具有适当渗透压的等渗溶液（斑马鱼约为 300 mOsm）
NBT 储存液（1 mL）
50 mg 氮蓝四唑（Nitro Blue Tetrazolium）
0.7 mL 无水二甲基甲酰胺（dimethyl formamide anhydride）
0.3 mL 去离子水（ddH2O）
BCIP 储存液（1 mL）
50 mg 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐
1 mL 无水二甲基甲酰胺
NBT/BCIP 显色液
1 mL AP 缓冲液
4.5 μL NBT 储存液
3.5 μL BCIP 储存液
丙酮粉
- 选取20条成年鱼，用液氮速冻。
- 用研钵和研杵将冷冻的鱼研磨成粉末。
- 将鱼粉转移至50 mL锥形管中。
- 用100%丙酮充满锥形管，涡旋混匀。
- 以最大转速离心10分钟，弃去上清液。
- 用100%丙酮再洗涤沉淀3次，每次均以最大转速离心10分钟。最后一次洗涤后，上清液应呈透明状。
- 再次向沉淀中加入100%丙酮，将管子置于室温下静置。较重的颗粒会沉降，而较细的颗粒则保持悬浮状态。
- 将含有细颗粒的上清液倾入新管中。将粉末悬液分装至不同的管中，并于-20 °C保存。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢 J. Chen 提供笼锁型荧光素-葡聚糖合成方案。本研究由美国出生缺陷基金会资助项目5-FY09-78、美国心脏协会资助项目09BGIA2090075以及美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所资助项目R01 HL107369-01（授予S.S.）支持。特别感谢 C. Closson 在显微成像方面提供的协助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CMNB-笼锁型荧光素 SE | Invitrogen | C20050 | |
| 10 kDa 氨基葡聚糖 | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba 脱盐离心柱 | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| 低熔点琼脂糖 | Amresco | 0815-100G | |
| 硼酸钠 | Amresco | 1131117-100G | |
| 三卡因甲磺酸盐 / MS222 | Research Organics | 1347A | |
| 抗荧光素-碱性磷酸酶偶联物 | Roche Group | 11376622 | |
| 封闭缓冲液 | Roche Group | 11 096 176 001 | |
| 马来酸 | Sigma-Aldrich | MO375-500G | |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| NBT | Sigma-Aldrich | I8377-250mg | |
| BCIP | Fisher Scientific | PI-34040 | |
| 显微注射仪 | Harvard Apparatus | PLI-2000 | |
| LabTek 带腔室盖玻片 | Nalge Nunc international | 155380 | |
| 蛋白酶 K | Invitrogen | AM2544 | |
| 羊血清 | Invitrogen | 16070096 | |
| LSM 510 META NLO | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 20X 0.8 NA 空气复消色差物镜 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 透明黄色滤光片 | Theatre House Inc. | Roscolux 滤光片 色号：312 |
参考文献
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