小鼠创伤性脑损伤模型中的鼻内间充质干细胞递送

摘要

来源：Shahror, R. A. et. al., 利用磁共振成像追踪经鼻递送后在创伤性脑损伤小鼠模型中分布的超顺磁性氧化铁标记间充质干细胞。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了在小鼠模型中进行鼻内间充质干细胞（MSC）递送的方法。MSC 吸收进入鼻腔组织后，通过细胞因子信号迁移到脑部，并在损伤部位分泌神经营养因子，为神经元修复提供神经治疗潜力。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 使用超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒标记间充质干细胞（MSCs）

1. 为了用SPIO标记MSCs，向含有MSCs（80%融合度）的T75培养瓶中加入6 mL标记培养基（含25 µg/mL SPIO的DMEM，不含胎牛血清（FBS））。
2. 将细胞置于CO₂培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育，不摇动。24小时后，使用连接真空泵的带塑料头的无菌巴斯德吸管轻轻移除标记培养基。用6 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞单层2次，以去除未被细胞摄取的残留SPIO。
   1. 为确定细胞是否成功标记，若SPIO带有荧光标记物（例如此处使用的SPIO），可在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察标记后的细胞（图1B, C）。
3. 用3 mL胰蛋白酶处理贴壁细胞以收获细胞，并在37 °C孵育。孵育5分钟后，加入7 mL预热的含10% FBS（v/v）的DMEM培养基以灭活胰蛋白酶。用移液器将细胞悬液收集至15 mL锥形管中。
4. 将细胞悬液以300 x g离心5分钟。弃去上清液，用PBS重悬细胞沉淀。使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞。
   注意：由于铁的负载，标记后细胞沉淀....

结果

图1：实验方案的示意图流程及SPIO被MSCs体外摄取的验证。 （A）将MSCs与SPIO共孵育24小时以进行标记，随后通过经鼻（IN）途径将标记后的MSCs递送至TBI小鼠模型中。在不同时间点进行MRI检测以追踪标记的MSCs。通过（B）荧光显微镜和（C）共聚焦显微镜（使用FITC通道）对SPIO标记MSCs的效果进行验证，因为SPIO纳米.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养耗材（塑料制品）	ThermoFisher Scientific	Varies	可替换为任意来源
一次性切片刀片	VWR	95057-832
含GlutaMAX的D-MEM/F-12（1X）	GIBCO	10565-018
冷冻组织标本包埋介质（O.C.T.）	Sakura Finetek	4583
胎牛血清（FBS）	GIBCO	12662-029
荧光宽场显微镜	Olympus	Olympus BX43
镊子	Fine Science Tools	11293-00	手术用
庆大霉素（10 mg/mL）	GIBCO	15710-064
毛发剪刀	Pet Club	PC-400
头部创伤挫伤装置	Precision Systems and Instrumentation	Model TBI-0310
牛睾丸来源透明质酸酶	MilliporeSigma	H3506
氯胺酮（Ketavet）	Pfizer	778-551
小鼠	中国台湾国家实验动物中心	C57BL6	本研究中使用的野生型小鼠品系
微型钻机	Nakanishi	NE50	与钻头配合使用以制备颅骨窗
切片机	Leica	RM2265
小鼠（C57BL/6）间充质干细胞	GIBCO	S1502-100
MRI扫描仪	Bruker Biospec
磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
聚维酮碘 7.5%	Purdue product L.P.		外科刷洗剂
剪刀	Fine Science Tools	14084-08	手术用
立体定位仪	Kopf Instruments	Model 900
超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒	BioPAL	Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51	用于MRI体内追踪的干细胞标记
单丝缝合线	Ethicon	G697	缝合用
计时器	Wisewind		可替换为任意来源
TrypLE	GIBCO	12604-013
赛拉嗪（Rompun）	Bayer	QN05 cm92