创伤性脑损伤小鼠模型中的鼻内间充质干细胞递送

所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。

1. 用超顺磁性氧化铁 （SPIO） 纳米颗粒标记间充质干细胞 （MSC）

1. 要用 SPIO 标记 MSC，请将 6 mL 标记培养基（25 μg/mL SPIO 在 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 中，不含胎牛血清 （FBS）） 添加到含有 MSC（80% 汇合度）的 T75 烧瓶中。
将
2. 细胞与标记培养基一起在 CO₂ 培养箱（37°C，5% CO₂）中孵育，不要摇动。24小时后，使用无菌巴斯德移液器轻轻取出标记介质，并将塑料吸头连接到真空中。用 6 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 单层洗涤细胞 2 次，以去除任何未内化的 SPIO 痕迹。
   1. 要确定细胞是否已成功标记，请在荧光显微镜或共聚焦显微镜下检查标记的细胞，如果SPIO用荧光团标记（即，就像这里使用的那些;图1B，C）。
3. 通过用 3 mL 胰蛋白酶处理收获贴壁细胞并在 37 °C 下孵育。孵育 5 分钟后，加入 7 mL 预热的 DMEM 培养基和 10% FBS （v/v） 以灭活胰蛋白酶。使用移液器将细胞悬液收集到 15 mL 锥形管中。
将
4. 细胞悬液以 300 x g 离心 5 分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于 PBS 中。使用台盼蓝染料和血细胞计数器计数活细胞。
   注意：由于铁负载，标记细胞的细胞沉淀将显示为深色（图1D）。该协议与 MSC 标记和磁共振成像 （MRI） 相关。MSC 标记的程序之前已经过优化，此处仅包括制备标记的 MSC 以进行体内跟踪的步骤，因为体内跟踪是重点。研究人员应优化其他细胞类型的培养和标记方案。
5. 使用 PBS 将细胞浓度调整为 18 μL PBS（或鼻内输送程序中使用的总体积）中的 150,000 个细胞（或产生足够 MRI 信号的数量）。
   注意：注意到高于 150,000 个细胞/18 μL PBS 的细胞浓度会导致细胞聚集， 这可能会影响鼻内给药的效率。如果鼻内给药需要更多细胞数量，请增加细胞悬液的总体积并增加鼻内给药的次数，因为鼻内给药是一种非侵入性手术，并且可以多次给药。

2.受控皮质撞击（CCI）损伤

：在本方案中，雄性C57 BL / 6小鼠（7-8周龄）被保存在12/12小时的明/暗循环中，并随意获得食物和水。

1. 为了准备每只小鼠进行CCI损伤，请通过腹膜内（ip）注射（1mL / kg）给予唑拉西泮（50mg / kg）和甲苯噻嗪（20mg / kg）麻醉混合物。确保麻醉深度足够，因为没有脚趾捏住反应。或者，将小鼠置于提供2%-4%异氟醚的腔室中60秒。
2. 使用电子理发器剃掉耳朵之间颅骨背表面的皮毛。使用浸有碘的无菌棉签清洁剃须区域数次。使用浸泡在 70% 乙醇中的棉签清除碘。
将
3. 麻醉的小鼠放入立体定向框架中，并使用耳杆和鼻杆固定鼠标。使用无菌剪刀在剃光的皮肤上做一个矢状中切口（约 2.5 厘米），以接触颅骨表面。
4. 使用化妆棉去除骨头上的组织，露出头骨。使用浸泡在 3% 过氧化氢 （H₂O₂） 中的棉签清洁颅骨表面 10 秒，然后用干燥的化妆棉清洁。
   注意：现在可以轻松识别颅骨缝合线以及 bregma 和 lambda。
确定颅骨
5. 表面选择的CCI损伤坐标，并使用铅笔或适当的记号笔在坐标周围画一个圆圈（直径4毫米）。
   注意：在本协议中，前后（AP）-2.0mm和中外侧（ML）+1.5mm处的坐标用于CCI诱导。
6. 使用微钻和圆形毛刺（直径 0.5 毫米）在标记的圆圈处使头骨变薄。避免在钻孔时施加压力，因为钻穿骨头可能会对脑实质造成损害。使用干净干燥的棉签清除骨尘。
7. 使用无菌细镊子轻轻取出骨瓣，露出硬脑膜，同时保持其完整。将鼠标从用于损伤前准备的立体定向框架中取出，并将其放入CCI设备的立体定向框架中。
8. 使用耳杆和鼻杆稳定鼠标头部。确保鼠标头部在喙尾方向上水平，并在需要时调整鼻杆。
9. 按照控制盒上的说明将冲击器尖端归零到暴露的皮质表面。使用冲击器底部的 X 和 Y 控制轮确保冲击器尖端直接对齐到要冲击的所需皮层坐标上方。
10. 使用控制箱设置实验参数，速度为5 m/s，停留时间为250 ms，损伤深度为1 mm，以诱导小鼠轻度损伤。
11. 按下控制箱上的"撞击"按钮以造成伤害。使用无菌棉签擦拭任何出血。
将
12. 鼠标从立体定向框架中取出，并使用丝状手术缝合线闭合切口。不要使用金属夹子关闭手术部位，因为鼠标会受到磁场的 MRI 影响。
在
13. 手术部位使用局部抗生素（杆菌肽新霉素）以防止感染。将鼠标放在加热垫上，并在恢复阶段密切监控。
14. 手术后 3 天每天服用酮洛芬（2.5 mg/kg，IP），除非酮洛芬给药与研究目标相矛盾。

3. 鼻内给药

1. 在 CCI 诱导后 1 天，通过腹膜注射给予唑西泮 （50 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （20 mg/kg） 麻醉混合物。确保小鼠因缺乏脚趾捏捏反应而受到深度麻醉。
准备
2. 小鼠通过透明质酸酶治疗鼻内递送间充质干细胞。
   1. 抓住鼠标的颈背，牢牢地转动它的背部，同时固定头骨。将含有透明质酸酶的移液器尖端置于无菌PBS（4 U / μL）中，以45°角靠近小鼠鼻孔。
   在
   2. 每个鼻孔中施用 3 μL 透明质酸酶混悬液。将鼠标固定并在干净的垫子上朝上 5 分钟。重复透明质酸酶治疗 4 次（总共 100 U 透明质酸酶混悬液）。
3. 透明质酸酶治疗后，将处理过的小鼠朝上放在干净的垫子上30分钟。
4. 要将间充质干细胞输送到大脑中，请牢牢握住小鼠，如步骤 3.2.1 中所述。以 3 秒的间隔施用 3 μL/鼻孔的 MSC 混悬液。将鼠标保持在同一位置 30 秒，直到样品滴完全消失。
   注意：避免在给药过程中形成气泡。
5. 以2分钟的间隔重复给药，最多3次。
   注意：要递送的细胞总数为150,000个，因此每个鼻孔可以以3μL剂量递送18μL细胞悬液，每个鼻孔3次。
将
6. 鼠标放回笼子并密切监测，直到它从麻醉中完全恢复。

图1：MSCs摄取SPIO摄取的方案和体外确认的示意图。（A）将间充质干细胞与SPIO孵育24小时进行标记。然后，通过鼻内 （IN） 途径将标记的 MSC 递送至 TBI 小鼠模型中。在不同时间点进行MRI以跟踪标记的间充质干细胞。由于SPIO纳米颗粒被FITC标记，因此使用FITC通道通过（B）荧光显微镜和（C）共聚焦显微镜确认了SPIO对MSC的充分标记。（D）标记的间充质干细胞的细胞沉淀由于铁负载而呈深色。FITC = 异硫氰酸荧光素;SPIO = 氧化铁的超顺磁性颗粒;MSC = 间充质干细胞;MRI = 磁共振成像;IN = 鼻内;TBI = 创伤性脑损伤。