小鼠创伤性脑损伤模型中的鼻内间充质干细胞递送

摘要

来源：Shahror, R. A. et. al., 利用磁共振成像追踪经鼻递送后在创伤性脑损伤小鼠模型中分布的超顺磁性氧化铁标记间充质干细胞。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了在小鼠模型中进行鼻内间充质干细胞（MSC）递送的方法。MSC 吸收进入鼻腔组织后，通过细胞因子信号迁移到脑部，并在损伤部位分泌神经营养因子，为神经元修复提供神经治疗潜力。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 使用超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒标记间充质干细胞（MSCs）

1. 为了用SPIO标记MSCs，向含有MSCs（80%融合度）的T75培养瓶中加入6 mL标记培养基（含25 µg/mL SPIO的DMEM，不含胎牛血清（FBS））。
2. 将细胞置于CO₂培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育，不摇动。24小时后，使用连接真空泵的带塑料头的无菌巴斯德吸管轻轻移除标记培养基。用6 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞单层2次，以去除未被细胞摄取的残留SPIO。
   1. 为确定细胞是否成功标记，若SPIO带有荧光标记物（例如此处使用的SPIO），可在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察标记后的细胞（图1B, C）。
3. 用3 mL胰蛋白酶处理贴壁细胞以收获细胞，并在37 °C孵育。孵育5分钟后，加入7 mL预热的含10% FBS（v/v）的DMEM培养基以灭活胰蛋白酶。用移液器将细胞悬液收集至15 mL锥形管中。
4. 将细胞悬液以300 x g离心5分钟。弃去上清液，用PBS重悬细胞沉淀。使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞。
   注意：由于铁的负载，标记后细胞沉淀呈现深色（图1D）。本方案适用于MSC的标记及磁共振成像（MRI）。MSC标记步骤此前已优化，此处仅包括为体内追踪而制备标记MSC的步骤，因本研究重点为体内追踪。其他细胞类型的培养与标记方案应由研究人员自行优化。
5. 用PBS调节细胞浓度，使18 µL PBS中含150,000个细胞（或达到足够MRI信号的细胞数量）（或根据鼻内递送实验所需的总体积进行调整）。
   注意：观察到当PBS中细胞浓度超过150,000个/18 µL时，会导致细胞聚集，可能影响鼻内递送效率。若鼻内递送需要更多细胞，可增加细胞悬液的总体积并增加鼻内给药次数，因鼻内给药为非侵入性操作，允许多次给药。

2. 控制性皮层撞击（CCI）损伤

注意： 在本实验方案中，雄性 C57 BL/6 小鼠（7–8 周龄）饲养在 12/12 小时明暗循环条件下，可自由摄食和饮水。

1. 为每只小鼠进行CCI损伤造模前，通过腹腔（i.p.）注射给予唑拉西泮（50 mg/kg）和赛拉嗪（20 mg/kg）麻醉混合物（1 mL/kg）。通过夹捏足趾无反应来确认麻醉深度是否充分。 alternatively，可将小鼠置于充满2%–4%异氟烷的麻醉舱中60秒.
2. 使用电动理发剪剃除耳间颅骨背侧表面的毛发。用浸有碘液的无菌棉签多次擦拭剃毛区域进行消毒。再用浸有70%乙醇的棉签擦去碘液。
3. 将麻醉后的小鼠置于立体定位仪中，使用耳杆和鼻杆固定小鼠。用无菌剪刀在剃毛后的皮肤上做正中矢状切口（约2.5 cm），暴露颅骨表面。
4. 用棉垫去除骨骼上的组织以暴露颅骨。使用浸有3%过氧化氢（H₂O₂）的棉签清洁颅骨表面。₂O₂）10 秒，然后用干燥的棉垫擦拭干净。
   注意： 颅骨缝以及前囟和后囟现在均可轻松辨认。
5. 在颅骨表面确定CCI损伤的目标坐标，并使用铅笔或适当的标记工具在坐标周围画出一个直径为4 mm的圆。
   注意： 在此方案中，采用前后方向（AP）-2.0 mm 和内外侧方向（ML）+1.5 mm 的坐标进行CCI诱导。
6. 使用微型钻和圆钻头（直径0.5 mm）对标记的圆形区域颅骨进行减薄。钻孔时避免施加压力，以防穿透骨质损伤脑实质。用干净干燥的棉签清除骨屑。
7. 使用无菌精细镊子轻轻移除颅骨瓣，暴露硬脑膜并保持其完整。将小鼠从用于伤前准备的立体定位仪架上取出，放入CCI装置的立体定位仪架中。
8. 使用耳杆和鼻杆固定小鼠头部。确保小鼠头部在头尾方向上保持水平，必要时调整鼻杆。
9. 根据控制盒上的说明，将撞击头调零至暴露的皮层表面。使用撞击器底座上的X轴和Y轴控制旋钮，确保撞击头精确对准目标皮层坐标的正上方。
10. 使用控制箱设置实验参数，速度为5 m/s，停留时间为250 ms，损伤深度为1 mm，以在小鼠中诱导轻度损伤。
11. 通过按控制盒上的“impact”按钮诱导损伤。若发生出血，使用无菌棉签擦拭。
12. 将小鼠从立体定位仪中取出，使用丝线手术缝合线缝合切口。禁止使用金属夹闭合手术部位，因为小鼠后续将接受磁共振成像（MRI），会暴露于磁场中。
13. 在手术部位涂抹局部抗生素（杆菌肽新霉素）以预防感染。将小鼠置于加热垫上，并在恢复期间密切监测。
14. 术后每日腹腔注射酮洛芬（2.5 mg/kg）持续3天，除非研究目标明确禁止使用酮洛芬。

3. 鼻内给药

1. 在CCI造模后第1天，通过腹腔注射给予唑拉西泮（50 mg/kg）和赛拉嗪（20 mg/kg）麻醉混合液。通过检测脚趾夹捏反应缺失，确认小鼠已进入深度麻醉状态。
2. 通过透明质酸酶处理，为小鼠准备间充质干细胞（MSCs）的鼻内递送。
   1. 抓握小鼠颈背部皮肤，将其稳固地翻转至仰卧位，固定头部。将含有透明质酸酶的无菌PBS溶液（4 U/µL）装入移液器，以45°角将移液器尖端置于小鼠鼻孔附近。
   2. 每侧鼻孔给予3 µL透明质酸酶悬液。将小鼠保持仰卧、固定状态，在洁净垫上静置5分钟。重复透明质酸酶处理4次（共给予100 U透明质酸酶悬液）。
3. 透明质酸酶处理后，将处理过的小鼠仰卧置于洁净垫上静置30分钟。
4. 为将MSCs递送至脑部，按照步骤3.2.1所述方法牢固固定小鼠。每侧鼻孔给予3 µL MSC悬液，间隔3 秒。保持小鼠体位不变，持续30秒，直至液滴完全消失。
   注意：给药过程中应避免产生气泡。
5. 以2分钟间隔重复给药，最多3次。
   注意：需递送的细胞总数为150,000个，因此可通过每侧鼻孔每次3 µL、共3次的方式，递送总计18 µL细胞悬液。
6. 将小鼠放回笼中，并密切观察，直至其从麻醉中完全恢复。

结果

图1：实验方案的示意图流程及SPIO被MSCs体外摄取的验证。 （A）将MSCs与SPIO共孵育24小时以进行标记，随后通过经鼻（IN）途径将标记后的MSCs递送至TBI小鼠模型中。在不同时间点进行MRI检测以追踪标记的MSCs。通过（B）荧光显微镜和（C）共聚焦显微镜（使用FITC通道）对SPIO标记MSCs的效果进行验证，因为SPIO纳米...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养耗材（塑料制品）	ThermoFisher Scientific	Varies	可替换为任意来源
一次性切片刀片	VWR	95057-832
含GlutaMAX的D-MEM/F-12（1X）	GIBCO	10565-018
冷冻组织标本包埋介质（O.C.T.）	Sakura Finetek	4583
胎牛血清（FBS）	GIBCO	12662-029
荧光宽场显微镜	Olympus	Olympus BX43
镊子	Fine Science Tools	11293-00	手术用
庆大霉素（10 mg/mL）	GIBCO	15710-064
毛发剪刀	Pet Club	PC-400
头部创伤挫伤装置	Precision Systems and Instrumentation	Model TBI-0310
牛睾丸来源透明质酸酶	MilliporeSigma	H3506
氯胺酮（Ketavet）	Pfizer	778-551
小鼠	中国台湾国家实验动物中心	C57BL6	本研究中使用的野生型小鼠品系
微型钻机	Nakanishi	NE50	与钻头配合使用以制备颅骨窗
切片机	Leica	RM2265
小鼠（C57BL/6）间充质干细胞	GIBCO	S1502-100
MRI扫描仪	Bruker Biospec
磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
聚维酮碘 7.5%	Purdue product L.P.		外科刷洗剂
剪刀	Fine Science Tools	14084-08	手术用
立体定位仪	Kopf Instruments	Model 900
超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒	BioPAL	Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51	用于MRI体内追踪的干细胞标记
单丝缝合线	Ethicon	G697	缝合用
计时器	Wisewind		可替换为任意来源
TrypLE	GIBCO	12604-013
赛拉嗪（Rompun）	Bayer	QN05 cm92