清醒大鼠运动皮层的经颅电刺激

摘要

来源：Fritsch, B. 等．清醒啮齿类动物经颅电脑刺激．J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了在清醒大鼠的运动皮层植入电极并应用经颅电刺激（tES）的方法。概述了电极放置、刺激递送以及由此引发的神经元和小胶质细胞激活等步骤，强调了其在神经治疗领域的潜在应用价值。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 手术步骤：胸部电极植入

注意：当对电极通过背心放置在剃毛的胸部外部时，可跳过此步骤。

1. 将啮齿类动物俯卧（胸部朝下）放置于手术台上。
   注意： 若采用吸入麻醉，应将大鼠的鼻部置于麻醉喷嘴中，并将异氟烷浓度进一步降低至1.5%-2%。
2. 用消毒喷雾或浸有抗菌剂的棉签对剃净的头皮进行消毒（例如， 70% 乙醇中清洗，晾干。重复两次。
3. 用手术刀从吻侧眼水平位置至耳中线水平位置沿一条直线切开皮肤。
   注意： 这允许将连接导线从植入胸部的电极处穿隧道至头部顶部，同时也适用于直流电刺激（DCS）电极插座的切口位置。
4. 将大鼠转为仰卧位，暴露胸部。
5. 按照步骤1.2所述对胸部皮肤进行消毒。
6. 用组织镊提起右侧胸部外侧皮肤，于右侧腋窝内侧约0.5 cm处用小剪刀剪出一个纽孔状切口。然后，将剪刀朝头侧方向作一直线矢状切口。
7. 通过小剪刀反复张开（或使用生理盐水浸湿的棉签）将皮肤与左侧胸大肌无创性分离，形成皮下囊袋。
8. 将动物置于右侧卧位，使用止血钳穿过浅筋膜，从头部皮肤切口的左枕角沿颈部向下行进，建立导线通路，最终通向胸部皮下袋并穿出。
9. 小心打开止血钳，夹住连接至铂电极的电极导线末端，注意避免尖锐的金属丝外露。将导线穿过隧道，直至电极进入囊袋，电极的焊点朝向啮齿类动物的左后肢。将动物恢复至俯卧位。
10. 使用无菌合成编织的不可吸收缝线，将铂板固定于胸筋膜上两个对角的孔洞处（建议打4-5个结以确保稳固）。
11. 类似地，用松散的结将电缆固定在筋膜上，在组织隧道入口前形成一个轻微的环。
12. 根据切口大小，使用3-4针皮肤缝线闭合皮肤（电极和电缆可使用相同的缝合材料）。

2. 手术步骤：颅顶经颅电刺激（tES）插座的放置

1. 将动物置于立体定位仪中。
   注意： 若使用吸入麻醉，将麻醉剂浓度降低至维持异氟烷气流浓度约1.5%-1%，并根据脚趾夹捏反射和呼吸模式进行调整。
2. 按照步骤1.2所述消毒剃净的头皮。
3. 用手术刀从吻侧眼水平位置至中耳水平位置沿一条直线切开皮肤。
   注意： 如果已进行胸部电极放置，则步骤 2.2 和 2.3 已完成。
4. 用手术刀将颅骨上的骨膜（颅骨表面的结缔组织）向两侧刮除，并用棉签彻底擦拭干净。用鳄鱼夹在切口的四个角固定结缔组织，并使其向侧方悬垂，以保持手术视野开放。
5. 用棉签蘸取0.9%生理盐水清洁骨面及组织，随后用3% H₂O₂避免接触组织。这样可更彻底地清洁骨骼，并止住骨骼的轻微出血。同时，骨膜残余物会变得可见。用棉签施加适度压力，清除这些残余物。
   注意： 去除残留的骨膜可增强经颅电刺激（tES）装置与骨表面粘接的粘附性和耐久性。
   1. 若出现无法控制的出血，可使用骨钻，以轻微压力在骨面上接触1-3秒。该机械操作在大多数情况下可止血，且不会引起明显发热。切勿在骨组织上使用电凝术，即使短暂应用也会导致脑组织损伤（电凝术仅可用于伤口组织出血的处理）。
6. 由于固定螺钉可提高装置的稳定性，应选择与螺钉尺寸匹配的钻头。使用手钻预钻孔，再配合骨钻施加轻微垂直压力，在两块不同的骨板上各钻一个克氏孔。钻孔位置应避免过于靠近经颅电刺激（tES）电极插座的预定位置，以免影响电极的安装。例如， 对于左侧初级运动皮层的经颅电刺激（tES），选择右侧额部和后顶叶的螺钉位置。
7. 若植入对电极，则在右侧顶骨后部钻第三个孔，用于将来固定穿隧道电缆。
8. 将塑料螺钉放入钻孔中并旋紧，直至感觉到第一道摩擦阻力，然后继续旋转额外三圈半（3个180°） ° 螺钉旋转。用镊子检查螺钉的稳定性，若不够牢固，则再拧紧一圈。
   注意： 对于成年大鼠，这将确保螺钉置于硬膜外而不损伤硬脑膜或脑组织（根据螺钉螺纹设计的不同，旋转圈数可能有所差异）。使用不锈钢螺钉也是可行的，因为即使在超过神经变性阈值的直流电密度下，螺钉的放置也不会影响其下方病灶的位置或范围。
9. 打开电烙铁，预热约5分钟。将从枕部组织隧道穿出的电缆缠绕在右侧顶骨螺钉上，然后剪断电缆，保留绕线后端约1厘米的电缆长度。用手术刀小心剥离电缆末端的绝缘层。
10. 用氰基丙烯酸酯胶将盘绕的电缆固定在螺钉和骨头上。
11. 将少量无铅锡焊料涂于连接器及对电极电缆的裸露导线上，然后将两者预先上好焊料的部分短暂压在一起，同时用焊笔接触连接处，直至锡焊料熔化（约2-3秒）。立即移开焊笔，以避免电缆金属部分过热，导致后续组织损伤。
12. 拿起定制的经颅电刺激（tES）电极插座（图 1B，用红色弯曲锯齿尖镊子夹住套管，在其底部边缘涂上一层氰基丙烯酸酯胶水。当套管置于运动皮层上方且直径为4 mm时，将套管中心点定位在前囟前2 mm、外侧2 mm处。在此位置，套管内侧内缘应恰好位于矢状缝处，尾侧边缘应与前囟高度齐平。将套管短暂按压在骨面上（大多数氰基丙烯酸胶水通过压力固化）。
    注意： 将光源直接置于插座上方，有助于更方便地安装插座。
13. 确保牙槽窝区域内的骨组织无胶水残留（可通过光照检查，因为胶水具有反光性）。若发生胶水溢出，需取出牙槽窝，用手术刀刮除胶水，并重复步骤 2.12。
14. 在套管就位且未来的刺激区域无胶水残留后，首先用少量氰基丙烯酸盐胶水将套管的侧缘与邻近组织密封，以防止形成液体桥，避免在此处发生电流分流。注意不要使用过多胶水，以免流入刺激区域（若发生此情况，返回步骤2.12）。
    注意： 保持刺激区域无胶水至关重要，因为刺激面积的减小可能会显著增加电流密度（A/m²).
15. 用氰基丙烯酸酯胶水覆盖所有螺丝。
16. 将双组分牙科丙烯酸树脂水泥在小型硅胶管或玻璃器皿中混合。一旦混合物变得黏稠，立即使用牙科刮刀将其涂抹于骨窝剩余边缘处，以实现密封。注意避免丙烯酸树脂水泥流入刺激区域。
17. 最后，将整个颅骨、螺钉、参考电极导线以及插座直至 ⅓ 用牙科丙烯酸树脂水门汀填充牙槽窝。确保水门汀具有适当的黏稠度：若过于稀薄，会流入周围组织；若过于坚硬，则难以均匀分布。
18. 当所有骨骼被覆盖且骨水泥完全硬化后，移除血管夹；此时皮肤应恰好与增高的骨水泥表面接触，无需缝合。（如果初始切口过长，导致结缔组织或肌肉暴露，则按照步骤1.12所述进行缝合。）
19. 用棉签在切口皮肤边缘周围涂抹一层碘液，并在皮下注射卡洛芬（5 mg/kg体重，溶于5-7.5 mL 0.9%生理盐水中，用于镇痛和补液）。
    注意： 如果使用吸入麻醉，现在请关闭。
20. 将啮齿类动物置于保温箱中，使其从麻醉状态中恢复，直至动物苏醒并恢复姿势稳定性。
    注意： 根据机构的建议，每天检查动物的体重变化、伤口状况及一般健康状况。

3. 经颅电刺激操作步骤

注意：由于麻醉会影响经颅电刺激（tES）的效果，建议尽可能在清醒的啮齿类动物中进行刺激。在开始实验前，应让动物至少恢复5天（以愈合头部和胸部伤口）。当使用固定在背心上的外部对电极时，可在术后较早的时间点进行实验，因为胸部伤口最为敏感，但动物需要数天时间适应电极背心，且可能会干扰行为学任务的执行。

1. 用0.9%生理盐水填充tES电极插座的一半，并去除气泡。
2. 在进行阴极经颅直流电刺激（tDCS）之前，始终检查氯化层；如果需要（例如银表面呈现光亮），应重新氯化Ag/AgCl电极。在进行阳极tDCS之前，使用砂纸去除之前刺激可能残留的过量AgCl沉积物，以确保刺激期间良好的导电性。旋紧tES电极的螺帽（图1B，灰色部件）。
   注意：若在阴极tDCS会话之间未重新氯化电极，将导致刺激过程中氯化层耗尽，并因电化学反应产生有毒物质积聚，从而引起组织损伤。若单次刺激持续时间少于20分钟，则无需在同一次会话中重新氯化。
3. 将导线连接到头部的两个连接器上（进行阳极刺激时，阳极导线连接至螺帽上的连接器；进行阴极刺激时则相反）。
   注意：当使用体外放置的参考电极时，用导电凝胶覆盖该电极，并将其置于啮齿类动物胸部。若将电极预先固定在小型啮齿类背心内，使动物在刺激期间可穿戴，则操作更为简便。
4. 将啮齿类动物放入实验笼中，导线连接至笼子上方的旋转连接器，以允许其自由活动。
5. 打开刺激器并调节刺激参数（刺激强度、持续时间、上升和下降时间）。
6. 若未使用具备安全关断和断开警报功能的商用刺激设备，应在电路中加入电流表以监测恒定电流的流动。
   注意：使用此装置时，可在动物执行或训练行为任务期间施加刺激。
7. 在刺激过程中观察啮齿类动物是否有应激或不适的迹象。
8. 刺激结束后，断开导线，旋下头部的电极帽，用棉签清洁并干燥插座。将啮齿类动物送回饲养环境，或根据需要继续进行行为学实验操作。

结果

图1：手术用品及经颅电刺激（tES）插座与电极帽单元的技术方案。（A）1. 棉签，2. 消毒剂，3. 立体定位仪，4. 电烙铁，5. 镇痛药（e.g.，卡洛芬），6. & 7. 麻醉剂（e.g.，赛拉嗪 & 氯胺酮），8. 注射器，9. 毛...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Softasept N	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国	3887138	消毒剂
70% 乙醇	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, 德国	T913.1
弯头镊子	FST Fine science tools, Heidelberg, 德国	11071-10
虹膜镊，10 cm，直型，带齿	World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, 美国	15914
手术刀柄 #3，13 cm	World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, 美国	500236
标准手术刀片 #10	World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, 美国	500239
纤维素棉签（Zelletten）	Lohmann und Rauscher, Neuwied, 德国	13349	5 × 4 cm
异氟烷	AbbVie Deutschland GmbH & Co	N01AB06
虹膜剪，11.5 cm，直型	World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, 美国	501758	小型剪刀
棉签/棉棒	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, 德国	EH12.1	Rotilabo
Kelly 止血钳，14 cm，直型	World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, 美国	501241	手术钳
电极板（铂金）	定制	Wissenschaftliche Werkstatt Neurozentrum Uniklinik Freiburg, 德国	10 × 6 mm，厚度 0.15 mm
绝缘铜丝（直径约 1 mm）	Reichelt elektronik GmbH & Co. KG, Sande, 德国	LITZE BL	电极导线
Weller EC 2002 M 焊接站	Weller Tools GmbH, Besigheim, 德国	EC2002M1D
Iso-Core EL 0.5 mm	FELDER GMBH Löttechnik, Oberhausen, 德国	20970510	无铅焊料
MERSILENE 聚酯纤维缝线	Johnson & Johnson Medical GmbH, Ethicon 德国, Norderstedt, 德国	R871H	不可吸收编织缝线，4-0
Histoacryl	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国	9381104	氰基丙烯酸酯
氯胺酮 10%	Medistar GmbH, 德国	n/a	麻醉剂
Rompun 2%（赛拉嗪）	Bayer GmbH, 德国	n/a	麻醉剂