清醒大鼠运动皮层的经颅电刺激

所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。

1.外科手术：胸部电极植入

：当对电极用背心从外部放置在剃光的胸部时，可以跳过此步骤。

1. 啮齿动物俯卧（在胸前）放在手术台上。
   注意：在吸入麻醉的情况下，将大鼠的鼻子保持在麻醉喷嘴中，进一步将异氟醚浓度降低至1.5-2%。
2. 用消毒喷雾或浸有防腐剂（例如乙醇 70%）的棉签对剃光的头皮进行消毒，然后风干。重复两次。
3. 用手术刀将皮肤从喙侧眼水平切成一条线到中耳水平。
   注意：这允许将连接电缆从植入的胸部电极向头顶隧道，也是直流刺激 （DCS） 电极插座放置所需的切口。
将
4. 大鼠转至仰卧位，使胸部暴露。
5. 按照步骤 1.2 中的描述对胸部皮肤进行消毒。
6. 用组织镊子抬高右胸外侧皮肤，用小剪刀在右腋窝内侧约0.5厘米处剪下扣眼。然后，用剪刀在颅骨方向上做一个笔直的矢状面切割。
7. 通过无创伤地断开皮肤与左侧胸大肌的连接，形成皮下袋。通过反复打开小剪刀（或用浸有盐水的棉签）来做到这一点。
将
8. 动物转动到右侧，从打开的头部皮肤的左枕角沿颈部穿过电缆路径，通过使用稳态镊子穿透浅筋膜进入胸袋。
9. 小心地打开稳态镊子，抓住连接到铂电极的电极电缆的末端，不要让锋利的电线散落。将电缆拉过隧道，直到电极进入袋子，焊接点朝向啮齿动物的左后肢。将啮齿动物转回俯卧位。
10. 用无菌合成编织、不可吸收的缝合线将铂板固定到两个相对角孔处的胸筋膜上（建议 4-5 节以保持稳定性）。
11. 同样，通过松散的结将电缆连接到筋膜上，在组织隧道入口处形成一个轻微的环。
12. 根据切口的大小，用 3-4 根皮肤缝合线闭合皮肤（电极和电缆可以使用相同的缝合材料）。

2. 外科手术：放置颅外经颅脑电刺激 （tES） 插座

1. 动物置于立体定向框架中。
   注意：如果使用吸入麻醉，请将麻醉剂浓度降低至 ~1.5-1% 的维持异氟醚流量，并根据脚趾捏反射和呼吸模式进行调整。
2. 按照步骤 1.2 中的说明对剃光的头皮进行消毒。
3. 用手术刀将皮肤从喙侧眼线切成一条线到中耳线。
   注意：如果进行了胸部电极放置，则已经执行了步骤 2.2 和 2.3。
4. 用手术刀刮掉骨膜（颅骨上的结缔组织）到两侧，然后用棉签彻底擦拭。用斗牛犬夹将结缔组织固定在切口的 4 个角处，并让它们横向悬挂以保持手术区域开放。
5. 用棉签涂抹 0.9% 的生理盐水清洁骨表面和组织。然后，用 3% H₂O_{2 清洁}骨表面。避免接触纸巾。这样可以更彻底地清洁骨头，骨头的轻微出血就会停止。此外，骨膜的残留物变得可见。用棉签施加适度的压力去除这些残留物。
   注意：去除骨膜残留物将增加粘在骨头上的 tES 插座的附着力和耐用性。
   1. 如果出血止不住，请使用骨钻轻轻按压骨头触摸 1-3 秒。在大多数情况下，这种机械程序可以在不显着加热的情况下止血。切勿在骨头上使用电灼术;即使是短暂的应用也会导致脑组织损伤（电灼术只能用于伤口组织出血）。
6. 由于固定螺钉会提高固定附着力，因此请选择适合螺钉尺寸的钻头。用手钻预钻，然后用骨钻轻轻垂直施加压力，在两个不同的骨板上放置两个钻孔。避免靠近 tES 插座的所需位置，因为它可能会阻碍电极的拧入（例如，对于左初级运动皮质 tES，选择右额和后顶叶螺钉位置）。
7. 如果是植入的对电极，则在右后顶骨上钻一个第三个孔，以便将来固定隧道电缆。
将
8. 塑料螺钉放入毛刺孔中并拧紧，直到感觉到第一次摩擦。然后再转三圈 180° 螺丝。用镊子检查螺钉的稳定性，如果不够紧，请再转一圈。
   注意：对于成年大鼠，这将确保螺钉的硬膜外放置而不会损坏硬脑膜或大脑（根据螺纹设计，圈数可能会有所不同）。使用不锈钢螺钉也应该是可行的，因为即使在 DCS 电流密度高于神经变性阈值时;螺钉放置不会扰乱螺钉下方的病变位置或范围。
打开烙
9. 铁并预热约 5 分钟。将离开组织隧道的电缆枕绕在右顶叶螺钉上，然后将其剪断，在绕组后面留下约 1 厘米的电缆。用手术刀小心地剥去电缆末端的绝缘层。
用
10. 氰基丙烯酸胶将缠绕的电缆固定在螺钉和骨头上。
将
11. 少量无铅锡焊料涂在连接器和对电极电缆的裸线上，并在触摸焊头的同时将两个预焊接部件短暂压在一起，直到锡焊料熔化（约 2-3 秒）来连接两者。立即取下烙铁头，以避免电缆金属过度加热并导致随后的组织损坏。
12. 用弯曲的锯齿状尖端镊子拿起定制的tES电极插座（图1B，红色），并在插座的底部边缘涂上一层薄薄的氰基丙烯酸胶。要放置在运动皮层上方并使用直径为 4 毫米的插座，请将中窝点放置在前束前 2 毫米和外侧 2 毫米处。对于这个位置，牙槽的内内侧边界应直接终止于矢状缝合线，尾部边界应终止于前裂的高度。将插座短暂压在骨头上（大多数氰基丙烯酸胶会因压力而变硬）。
    注意：在插座正上方放置光源可以更容易放置插座。
13. 确保插座区域内的骨头没有胶水（通过用光检查，因为胶水是反光的）。如果胶水溢出，请取下插座，用手术刀刮掉胶水，然后重复步骤 2.12。
在
14. 插座就位且未来的刺激区域没有胶水后，首先用一小滴氰基丙烯酸胶将插座的侧缘密封到邻近组织，以避免流体桥可能导致该位置的电流分流。不要涂太多胶水，因为它可能会流入刺激区域（如果发生这种情况，请返回步骤 2.12）。
    注意：保持刺激区域没有胶水至关重要，因为减少刺激区域可能会显着增加电流密度 （A/m²）。
用
15. 氰基丙烯酸胶覆盖所有螺丝。
将
16. 双组分牙科丙烯酸水泥混合在小硅管或玻璃中。一旦它变得粘稠，就用牙铲将其涂抹，将牙槽的剩余边界密封到骨头上。避免牙科丙烯酸水泥流入刺激区域。
17. 最后，用牙科丙烯酸水泥覆盖整个头骨、螺钉、对电极电缆和插座的 1/3。确保水泥具有正确的粘度：如果液体太大，它会流入周围组织;如果太硬，就很难均匀分布。
18. 当所有的骨头都被覆盖并且水泥硬化时，取下斗牛犬夹;皮肤应该刚好接触堆积的水泥，这样就不需要缝合了。（如果初始切口选择太长并且结缔组织或肌肉可见，请按照步骤 1.12 中的说明进行缝合）。
用
19. 棉签在切割皮肤的边缘涂抹一层碘，并皮下注射卡洛芬（5 mg/kg 体重溶解在 5-7.5 mL 0.9% 生理盐水中，用于疼痛治疗和补液）。
    注意：如果使用吸入麻醉，请立即将其关闭。
将
20. 啮齿动物放入加热箱中，以便从麻醉中恢复，直到啮齿动物清醒并恢复姿势稳定性。
    注意：根据机构的建议，每天检查动物的体重发育、伤口状态和一般健康标准。

3. 经颅电刺激程序

：由于麻醉会影响 tES 效果，因此建议尽可能对警觉的啮齿动物进行刺激。在开始实验之前，让啮齿动物恢复至少 5 天（头部和胸部伤口愈合）。使用用背心固定的外部对电极时，可以在手术后的较早时间点进行实验，因为胸部伤口最易激惹，但动物需要习惯电极背心数天，可能会干扰行为任务。

1. 0.9% 的盐水填充 tES 电极插座的一半并去除气泡。
2. 在阴极经颅直流电刺激 （tDCS） 疗程之前，请务必检查氯化情况，如果需要（例如闪亮的银色表面），重新氯化 Ag/AgCl 电极。在阳极 tDCS 会议之前，用砂纸去除先前刺激中可能多余的 AgCl 沉积物，以在刺激过程中保持良好的导电性。拧入tES电极螺旋盖（图1B，灰色部分）。
   注意：在阴极tDCS会话之间未能对电极重新氯化将导致刺激期间氯化耗尽，并通过电化学反应产生毒性。这将引起组织损伤。如果刺激持续时间短于 20 分钟，则不需要在单个疗程内重新氯化。
将
3. 电缆连接到头部的两个连接器（对于阳极刺激，阳极电缆连接到螺帽上的连接器，对于阴极刺激，则相反）。
   注意： 使用外部放置的对电极时，用导电凝胶覆盖对电极并将其放在啮齿动物的胸部。如果电极预先固定在小啮齿动物背心中，这是最简单的，啮齿动物可以在刺激过程中佩戴该背心。
将
4. 啮齿动物放入实验笼中，电缆连接到笼子上方的转环上，以便自由移动。
打开
5. 刺激器并调整刺激参数（刺激强度、持续时间、上升和下降时间）。
6. 当不使用带有安全关机和断开警报的市售刺激装置时，请在电路中包括一个仪表以检查恒流电流。
   注意： 通过此设置，可以在行为任务的执行或训练期间施加刺激。
7. 检查啮齿动物在刺激期间是否有压力或不适的迹象。
8. 刺激结束后，断开电缆，拧下头部的电极盖，用棉签清洁并擦干插座。如果需要，将啮齿动物送回家庭环境或进行行为程序。

图1：tES插座和电极帽单元的手术用品和技术方案。 （A） 1.棉签，2.消毒剂，3.立体定向框架，4.烙铁，5.镇痛药（例如卡洛芬），6.& 7.麻醉剂（例如甲苯噻嗪和氯胺酮），8.注射器，9。快船，10.打耳器，11.眼药膏（例如，山茛），12.无铅锡焊料，13.双组分牙科丙烯酸水泥 （DAC），14。碘，15.3% H2O2， 16.0.9%生理盐水， 17.合成编织不可吸收缝合线（例如，美西林 4-0），18。钻头，19.氰基丙烯酸胶，20。斗牛犬夹具 21.稳态镊子，22。弯曲的锯齿状尖端镊子，23。笔直、锋利的尖端镊子，24。直的，组织镊子，25。牙铲，26.手术刀，27。剪刀，28。手钻，29.螺丝刀，30。电钻，31。母连接器，32。tES 插座，33。连接到电缆上的方形铂电极，焊接接头覆盖有组织丙烯酸胶，34。塑料螺丝。（B） 用于固定在内径为 4 毫米的啮齿动物头骨上的 tES 插座（红色）;电极单元（灰色）由螺旋盖和带有中心孔的内印章构成，为粘在印章底部的 Ag/Cl 圆盘电极的电缆留出空间。这允许设置的最大稳定性，并避免在敏感的电极连接点处断线。