利用生物翻转芯片对胚胎干细胞进行图案化

摘要

我们展示了一种将细胞放置在基底特定位置的简单方法。该方法通过将含有填充细胞的微孔的硅胶芯片翻转至基底上来实现细胞图案化。该方法为调控细胞间的可扩散信号和邻近细胞信号提供了一种新途径。

摘要

由可扩散信号和细胞间接触（旁分泌信号）构成的细胞间相互作用在多种生物学过程中至关重要，例如肿瘤生长、干细胞分化以及干细胞自我更新。目前已有多种方法用于在体外调控细胞信号传导。其中一种调控可扩散信号总量的方法是在培养过程中改变细胞接种密度。然而由于细胞接种具有随机性，该方法会导致实际的细胞间距和细胞间接触数量存在较大差异，因而无法精确控制局部微环境。另一种更为特异性的调控细胞信号的方法是使用分子抑制剂或遗传学手段敲低特定的信号蛋白，但这些方法更适合调控少数几种分子。本文中，我们展示了一种新的调控细胞间信号传导的方法，该方法通过在基底上将不同数量的细胞置于指定位置，从而调控细胞簇的局部微环境。此方法为控制细胞间的局部可扩散信号和旁分泌信号提供了互补的手段。本方法利用了生物翻转芯片（Bio Flip Chip, BFC），这是一种微加工制成的硅胶芯片，包含数百至数千个微孔，每个微孔的尺寸可容纳单个细胞或少量细胞。我们仅需通过移液将细胞加入微孔阵列，并洗去未落入孔中的细胞即可完成装填。随后将芯片翻转贴附到基底上，细胞便从微孔中脱落并沉积到基底表面，同时保持其原有的空间排布。待细胞贴附后，芯片可被移除（或保留在原位）。这种细胞图案化方法具有以下独特优势：1）不改变基底的化学性质，从而允许细胞增殖和迁移；2）可在多种基底上实现图案化，包括组织培养级聚苯乙烯、玻璃、基质胶（matrigel）甚至饲养细胞层；3）与传统的微接触印刷技术兼容，可构建含有细胞的细胞外基质微岛。在本视频中，我们演示了利用BFC将小鼠胚胎干细胞图案化接种到组织培养级聚苯乙烯表面的过程。

方案

制备BFC

BFC 通过在 4 英寸硅主模板上模塑聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备而成。

制备主模板

1. 首先将硅片在130°C下脱水处理30分钟。
2. 将硅片置于匀胶机上，滴加SU8-2050光刻胶（Microchem），以300 rpm/s的加速度加速至3000–4000 rpm，并旋转30秒，分别获得40–30 mm的特征高度。
3. 旋转涂覆后，将硅片置于65°C的热板上，立即升温至95°C，保持5–6分钟，随后降温至65°C。
4. 使用暗场掩模，在接触式光刻对准仪上对硅片进行200 mJ/cm²的紫外光曝光。
5. 曝光后，将硅片再次置于65°C热板上，立即升温至95°C，保持4–5分钟，随后降温至65°C。
6. 使用丙二醇单甲醚乙酸酯（PM acetate）和异丙醇（Isopropanol）对硅片进行显影。
7. 使用六甲基二硅氧烷（Shin-Etsu MicroSi）或十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷（t2492-KG, UCT Specialities, Bristol, PA）对硅片进行30分钟的硅烷化处理，以防止PDMS粘附于硅母版上。

制备芯片

1. 按10:1的比例混合PDMS（Dow Corning，Sylgard 184），将其浇注在母模硅片上（每片约15 g），并在室温下静置过夜使其固化。
2. 将固化的PDMS从硅片上剥离，并使用剃刀片切割出每个芯片。
3. 将每个芯片键合到一块1 cm × 1 cm的显微镜载玻片上，以便于操作。

准备使用BFC

1. 将BFC在PBS中浸泡过夜，以防止实验过程中培养基被PDMS吸收。
2. 用无尘纸（Kimtech Science）将芯片干燥。
3. 在BFC的图案化表面滴加一滴7.5%牛血清白蛋白（BSA）（约200 µL），然后用移液器吸头刮涂以分散BSA并去除孔中的气泡。
4. 让BSA在BFC表面静置至少0.5小时。理想情况下每15分钟轻轻搅动一次，以防止表面结皮。
5. 为了将BFC适配于35×10 mm的TCPS培养皿（Falcon, 35-3001）内，将TCPS培养皿的边缘从中间切去一半，以便¾英寸文件夹夹（Office Depot）能够夹住培养皿边缘，将芯片与培养皿固定在一起。
6. 从PDMS片材（Silicone Specialty Products）或其他硅胶材料上裁剪一个垫片密封圈（外缘20×20 mm，内缘15×15 mm，厚度250–500 µm），并用镊子将其放置在培养皿上。

使用BFC对细胞进行图案化

1. 将培养皿、垫圈、BSA包被的芯片以及2个长尾夹在紫外线下灭菌1分钟。
2. 吸除BSA溶液，并用200 mL PBS将BFC清洗两次。
3. 如果您的细胞系需要，可在切割后的TCPS培养皿中加入明胶。否则，在将其贴附到芯片前，先用少量培养基润湿TCPS表面（见下文），以防止腔室内产生气泡。
4. 吸除PBS后，用移液器将200 mL细胞悬液（约1×10⁶ 个细胞/mL）加至BFC表面，静置5–10分钟使细胞沉降。
5. 将BFC倾斜约15°角至一个角落，用200 mL移液器缓慢吸除细胞悬液。然后将BFC放平，在对角的另一角落加入100 mL PBS或空白培养基。根据需要，以相同方式再冲洗2–4次，彻底清除孔间区域的细胞。
6. 向芯片表面加入200 mL培养基。吸除TCPS上的明胶或培养基，然后将预先润湿的培养皿翻转，缓慢将BFC推入培养皿中。
7. 在腔室两侧各使用一个长尾夹进行密封。移除长尾夹的金属卡扣，以便翻转后培养皿保持水平。
8. 最后，迅速将整个装置翻转，避免不必要的移动，并立即放入培养箱中。

讨论

尽管本文所述的实验方案及视频展示了使用BFC¹对小鼠胚胎干细胞（mESCs）进行图案化，但BFC实际上可用于图案化几乎所有感兴趣的细胞类型。可能需要做的唯一调整是改变微孔的尺寸。根据我们的经验，若要使用BFC对其他细胞类型的单个细胞进行图案化，微孔的直径和高度比未贴壁细胞的直径大10微米时效果最佳。

BFC 还可用于在其他基底（包括其他细胞）上进行细胞图案化，且无需对实验方案进行显著修改。与传统的细胞图案化方法相比，BFC 方法的一个优势在于能够在已有细胞层上进行图案化，因为某些细胞类型（包括小鼠胚胎干细胞和人类胚胎干细胞）在培养中需要支持细胞或饲养层细胞来维持其正确的表型。

我们正在探索BFC的一个应用是利用BFC研究小鼠胚胎干细胞之间的信号传导。通过在具有不同网格间距的方形晶格中接种单个细胞，我们可以调控细胞间信号分子的交换速率。通过制造更大的微孔（直径为40微米），我们还可以在特定位置聚集较多数量的细胞（约2–10个），从而局部改变细胞密度。此外，我们可以将多个小孔紧密排列，形成一种局部细胞密度...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
硅胶母模
细胞培养皿	Falcon BD	35-3001	35 mm
3/4" 文件夹夹
PBS
六甲基二硅氧烷	Shin-Etsu MicroSi
新项目	MicroChem Corp.	SU8-2050
PM 醋酸酯
异丙醇
BSA			7.5% 牛血清白蛋白