剪切载荷:一个有用​​的工具，用于检查视网膜神经细胞之间的缝隙连接示踪剂耦合程度

摘要

描述一个简单方便的方法，以确定视网膜神经细胞之间的缝隙连接示踪剂耦合程度。这种技术，使一个完整的视网膜中的神经元之间的电突触的功能，不同的光照条件下，在白天和晚上不同时间的调查。

摘要

除了化学突触传递，神经元缝隙连接连接也可以通过电突触传递迅速沟通。越来越多的证据表明，间隙连接不仅允许电流流动和细胞之间的相互关联或耦合的同步活动，但细胞之间的耦合强度或电气通信的有效性，可调制， ^在很大程度上1,2。此外，内径大，许多缝隙连接通道（〜1.2 nm的）不仅允许电流流动，而且细胞内信号分子和细胞之间的相互关联的小代谢产物的扩散，使缝隙连接，也可调解代谢及化学通讯。同时电气耦合细胞记录和决定吨的神经元之间的差距及其神经递质及其他因素的调制交界通信的实力，可以研究他示踪分子的扩散，这是缝隙连接透水程度，但没有膜透水后，成单个细胞iontophoretic注射。然而，这些程序可以是非常困难的小somata完好的神经组织的神经元执行的。

在脊椎动物视网膜电突触和电气通信调制大量的研究已经进行，因为每五个视网膜神经类型是电连接缝隙连接^3,4。越来越多的证据表明，昼夜（24小时）在光刺激视网膜和变化的时钟调节间隙连接^耦合 3-8 。例如，最近的工作表明视网膜生物钟，减少白天的交界处耦合杆和锥感光细胞之间的差距，通过增加多巴胺D2受体激活，并通过降低D2受体的激活显着增加夜间杆锥耦合在这里，我们提出了一个简单的方法确定不同的光照条件下，在白天和黑夜的不同时期的视网膜神经细胞之间的缝隙连接示踪剂耦合程度。这种切割加载技术是^9-12的修改刮加载，这是基于对染料的装载和扩散通过开放的间隙连接通道。刮装载工程以及在培养的细胞，但不厚片，如完整的视网膜。削减加载技术已用于研究在完整的鱼和哺乳动物^{视网膜7，8,13}的感光耦合，可以用来研究之间的耦合其他视网膜神经细胞，这里描述。

方案

1。完整的金鱼，老鼠和兔子的神经视网膜的准备

1. 在恒定的环境（背景）照明下执行包括以下步骤中所描述的，"2）剪切加载"。请注意，本协议的目的，程序为执行在不断的黑暗（即≤0.0001勒克斯）非常暗（即"暗"）的条件下使用夜视红外护目镜，但其他恒定的环境光照强度较高水平可以用来代替来确定的其他环境照明水平上的差距交界示踪耦合的影响。
2. 暗适应手术前至少1小时的实验动物（金鱼，老鼠或兔子）。
3. 正如先前所述^7，深受麻醉金鱼放置在tricaine磺酸（MS222; 150毫克/大号缓冲（碳酸氢钠含）的鱼缸水），并深深地麻醉小鼠氯胺酮（100毫克/公斤，IP）和rompun（10毫克/千克，IP）。深麻醉与聚氨酯兔（负荷剂量:2.0克/公斤，IP），还可以使用本地眶内麻醉（2％Xylocaine），描述以前^8。所有涉及护理和使用动物实验程序应按照联邦指导方针和本地大学动物护理和使用委员会进行审查和批准。 （注:在这里描述的实验，所有涉及鱼的关心和使用的实验程序，小鼠和家兔，按照NIH的指引，并进行了审查和美国俄亥俄州立大学的体制动物护理和使用委员会批准。）
4. 对于鱼，小鼠和家兔，眼球摘除后，删除每个眼球前部。然后，放置了一块滤纸上的眼睛后部的顶端和反转滤纸和眼睛，使滤纸，眼睛的后部是下方。然后，用细钳解剖从眼睛的后部轻轻地剥离了色素上皮/脉络膜/巩膜，视网膜的神经，这是附着在滤纸，这是连接到对方的完整的神经视网膜。这样做是用细弹簧加载剪刀，剪断视神经。视网膜神经，面向感光面朝上，现在应该可以连接到滤纸和眼睛休息分开。

2。切负荷

1. 淹没的视网膜在一个6孔钢板在恒定的环境（背景）照明（例如，在很暗（即"暗"）的条件）与下30分钟（〜5毫升/以及）或无含氧林格的解决方案（见表1）测试药物。保持密封的用封口膜6孔钢板鱼视网膜中含氧（5％的CO ₂ / 95％O _2）碳酸氢钠，基于林格的22 °彗星，并维持在36℃在一个5％的CO小鼠和兔_视网膜 2 / 95％的O
2. 溶解neurobiotin（0.5％），生物素化的分子，在林格氏液，立即通过切割视网膜前的准备示踪剂溶液（通常为100μL，）。请注意，0.5％罗丹明葡聚糖（高（> 10,000）兆瓦）可添加到解决方案。由于其分子量高，罗丹明葡聚糖不跨缝隙连接和唯一的标签切已受损的细胞。 如图。 3，这是一个有用的的方法来区分已经积累了neurobiotin，因为他们已经从那些已经积累了通过缝隙连接扩散的示踪剂，受伤细胞。
3. 放在玻璃（或塑料）培养皿neurobiotin解决方案，挖掘在纸巾上的滤纸上，视网膜连接，去除多余的林格氏液，浸在neurobiotin解决方案刀片（或其他锋利的刀刃）在n请通过放射状切开视网膜和滤纸。如果首选，垫片可用于削减通过视网膜，但不是滤纸。切口应面向垂直视网膜表面。浸在neurobiotin解决方案刀片再次削减视网膜第二次。重复此高达4％削减（ 见图1）视网膜。使用解剖显微镜时，通过鼠标和其他小的视网膜剃须刀削减。
4. 如图。 1，再次淹没在新鲜林格液的视网膜，或没有试药，用6板（5毫升林格氏液/孔） 。视网膜孵育15分钟，以便加载和扩散。
5. 5分钟，每个试药带或不带新鲜林格液洗三次。
6. 0.1 M磷酸缓冲液（PBS，pH值7.4）的4％多聚甲醛在室温下1小时修复视网膜。
7. 用0.1 M PBS清洗一夜之间4 ° C。
8. 翌日，反应瓦特第i个C. 2％链霉亲和Alexa的488（终浓度为10微克/毫升）在0.1M PBS + 0.3％Triton X - 100的的，并保持在4℃过夜
9. 0.1M PBS在室温下每10分钟洗三次
10. PBS中，视网膜脱离滤纸，然后，用细刷，放置在视网膜上，面向感光面朝上，到一个幻灯片。
11. 轻轻Vectashield安装媒介（媒介实验室，伯林格姆，CA）的安装。
12. 激光扫描共聚焦显微镜（例如蔡司510元），在每一个实验条件相同的放大倍率，分辨率和设置的图片，让你可以比较不同的实验条件（如测试药物;光照条件）的影响的程度缝隙连接示踪剂耦合（ 图2A - C和图4a - C的 ）。虽然单个图像可能包含所有的标记细胞，它是建议您收集感兴趣的领域的Z - Stack与它折叠成一个单一的形象。

3。定量示踪耦合使用ImageJ

1. 在LSM的图像浏览器，打开图像，单击"导出"，并保存为未压缩文​​件为TIF - 16位图片。比例尺应包括在本TIF图像。
2. 使用NIH ImageJ软件，测量荧光强度从低倍率的整个安装视网膜图像Alexa的- 488 -标记neurobiotin。使用ImageJ软件打开TIF文件，然后对应的比例尺绘制一条直线。转到分析，设置规模和输入已知的距离和长度单位，然后单击确定。现在，测量结果可以在校准的单位，如毫米，。
3. 选择使用矩形选择工具的利益区域。荧光峰应定位在您选择的左边框。确保有没有合适的边境附近的荧光信号。如果没有，活动图像（影像，然后将其旋转）旋转。
4. 点击分析和剧情简介。你应该看到从左边到右边的指数衰减曲线。
5. 在弹出窗口中单击"复制并粘贴在Excel中。现在你看到两列显示的距离，从切（左栏）和荧光强度作为距离的函数从削减（右列）。
6. 最大荧光值除以每个原始的荧光值，以获得相对荧光强度。
7. 复制两列对应切（X）和相对荧光强度（Y）的距离，然后粘贴到Origin软件。
8. 配合指数衰减＃1的功能（图2D和图4D。），形式:
   Y = Y + Y _最大 * ^{EXP（- X /λ）}
   其中Y是相对的荧光强度_{，Y o}为背景荧光_{，Y max}是最大的相对荧光，λ是SPACE（长）和X是从切的距离。
9. 比较不同实验条件下，采用t检验或方差分析（图2E和图 4E）的空间常数（λ）值。需要注意的是量化的替代技术已经由^他人 13,14描述。

4。代表性的成果

感光细胞示踪耦合削减负荷确定的有代表性的例子是在图2和图 3 和图 4（兔）（鱼） 。使用相同的设置进行比较（ 图2A - C和图4A - C）和荧光强度的共聚焦图像绘制的距离，从削减的功能和装配号3.8上面显示的指数函数（ 图2D和图4D）。每个条件的空间内恒定值显示在图2E和4E，说明缝隙连接示踪剂耦合的程度是可以量化的使用削减加载技术。此外，高度重复性的结果。使用量化缝隙连接示踪剂耦合的程度的一种手段削减加载技术研究也发现，从削减在所有情况下，荧光强度随距离^的函数指数验证7,8（见还图。 2D和4D），表明neurobiotin进入的光感受器，通过剃须刀切割和视网膜从其他网站不。此外，感光细胞示踪耦合的差异的定性类似的昼/夜观察金鱼示踪剂注射到单锥和^截装载7证实，作为衡量感光耦合程度一个比较准确的方法削减负荷。

切- Loading技术也可以用来研究其他类型的视网膜电突触。例如， 图 5表明，兔A型（ 图5A）和B型（ 图5B），水平细胞表现出同源示踪耦合，以下切装和暗适应条件下的neurobiotin扩散。

化合物	鱼	鼠标	兔
氯化钠	130	120	117
碳酸氢钠3	20	25	30
的NaH 2 PO 4	-	1	0.5
KCL	2.5	5	3.1
血糖	10	10	10
MgCl 2的	1	-	-
硫酸镁4 7H 2 O	-	1	1.2
谷氨酰胺	-	0.1	0.1
氯化钙	0.7	2	2

表1:林格氏液，金鱼，老鼠和兔视网膜的解决方案的组成。在MM的浓度。林格的解决方案是冒泡5％CO ₂ / O _2的 95％，并保持在29 ° C（鱼）或36℃（哺乳动物） 。 " - ":不包括在这一物种的林格氏液。

图1:显示削减装载过程的流程图。经过隔离Øf的完整的神经视网膜，几个径向削减作了一个是第一次在0.5％的neurobiotin溶液蘸刀片。视网膜孵育示踪装载和扩散，然后固定在0.1M磷酸盐缓冲液（PB）的4％多聚甲醛（PFA）前洗净。示踪耦合研究使用链霉亲和共轭Alexa的- 488。

图2日夜在感光示踪耦合的区别是金鱼透露削减加载技术。感光细胞间隙连接neurobiotin示踪耦合是在夜间（二）在当天的广泛spiperone（10μM），选择性的多巴胺_D 2受体拮抗剂（三）申请，但在当天没有在控制条件（一） 。四）规范化的相对荧光强度削减（在交流中的箭头表示）的距离的函数。 e）空间不断VALUES获得D和其他实验组（n = 4）的数据。 *** P <0.001。

图3一个代表性的例子，显示在一个暗适应的金鱼视网膜的感光细胞在夜间加载切层以下neurobiotin和罗丹明葡聚糖溶液的荧光。罗丹明葡聚糖（红色显示），不漫过开放的间隙连接通道，由于其分子量高（> 10,000 MW），只有标记细胞附近的切。 neurobiotin（以绿色显示）通过缝隙连接扩散，相比之下，可以看出，在感光细胞远离削减。切割的位置是在每个面板的箭头表示。比例尺:200微米。

图4。日夜不同ENCE兔视网膜感光示踪耦合透露削减加载技术。感光细胞间隙连接neurobiotin示踪耦合是在夜间（二）在当天的广泛spiperone（10μM）（三）申请，但在当天没有在控制条件（一）。在交流中，附近的切兔感光器的三维重建垂直意见。四）规范化的相对荧光强度作为削减的距离功能。五）获得D和其他实验组（n = 3）的数据空间内恒定值。 *** P <0.001。

图5。剪切加载显示，暗适应兔横向细胞示踪加上。 A型（A）和B型（二）在暗适应兔视网膜水平细胞同源neurobiotin示踪耦合。

讨论

这里描述的剪切加载方法是有用的和简单的技术来确定不同的光照条件下，在白天和黑夜的不同时期的视网膜神经细胞之间的缝隙连接示踪剂耦合的程度。这种技术的优点包括能够完整的视网膜组织中的神经元之间的缝隙连接示踪剂耦合程度量化各种光照条件下，白天和晚上的耦合神经元的小直径somata。在完整的组织分为两大类下降缝隙连接的研究技术的限制。首先，通过开放的缝隙连接示踪剂的扩散可能会比较难以观察到，由于A）小直径或与开放渠道和B），加上蜂窝车厢^的相对体积1,14,15相关的费用。也就是说，从一个小细胞示踪扩散到一个较大的细胞或组耦合细胞，比赛ared从一个较大的细胞，以较小的细胞示踪扩散，可能会更加难以发现由于示踪稀释。第二，某些生理条件下，通过缝隙连接在完整组织的示踪扩散的程度可能无法准确反映的缝隙连接电导的实力相比，比较大的示踪通透性由于在小电流携带离子电导的差异，分子^1,14,15。在一般情况下，示踪耦合的证据有力地表明运作，开放的间隙连接通道的存在，但某些生理条件下，示踪扩散可能不会发生或观察到，尽管电生理记录表明存在的运作，打开缺口路口。

这很可能削减加载技术还可以用于研究完整的组织从其他地区的中枢神经系统的神经元之间的缝隙连接示踪剂耦合程度TEM。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
Tricaine甲烷磺酸（MS222）	Sigma - Aldrich公司	A5040	150毫克/ L的缓冲鱼缸水
聚氨酯	Sigma - Aldrich公司	U2500	剂量为2 g / kgloading
双管夜视镜	美国之夜光学	D - 221
滤纸级4号	瓦特曼	1004-090
精细镊子，杜蒙，Biologie第5号，长11厘米	精细科学工具	11295-10
精细剪刀，弹簧加载，8毫米刀片，直	精细科学工具	15025-10
Neurobiotin	矢量	SP - 1120	0.5％
链霉亲和共轭Alexa的488	Invitrogen公司	S11223	2％
葡聚糖罗丹明（高（> 10,000）兆瓦）	Invitrogen公司	D1817	0.5％
Vectashield安装介质	矢量	H - 1000
蔡司510 META激光共聚焦显微镜	卡尔蔡司公司
LSM - 5图像浏览器3,2,0,115	卡尔蔡司公司
ImageJ软件	国立卫生研究院
OriginPro 8.0	OriginLab公司