本文介绍了一种简便且实用的方法，用于测定视网膜神经元之间缝隙连接示踪剂耦合的程度。该技术可用来研究在不同光照条件下以及一天中不同时段，完整视网膜内神经元间电突触的功能。
本文内容
摘要
摘要
除了化学性突触传递外，通过缝隙连接相连的神经元还可通过电突触传递进行快速通信。越来越多的证据表明，缝隙连接不仅允许电流在相互连接或耦合的细胞之间流动并产生同步活动，而且耦合细胞间电通信的强度或有效性在很大程度上可被调节1,2。此外，许多缝隙连接通道具有较大的内径（约1.2 nm），不仅允许电流通过，还允许细胞内信号分子和小分子代谢物在相互连接的细胞间扩散，因此缝隙连接也可能介导代谢性和化学性通信。神经元之间缝隙连接通信的强度及其受神经递质和其他因素的调节作用，可通过同时对耦合细胞进行电生理记录，并在将示踪分子电泳注入单个细胞后，测定这些可透过缝隙连接但不可透过细胞膜的示踪分子在细胞间的扩散程度来研究。然而，对于完整神经组织中胞体较小的神经元，这些操作可能极为困难。
由于五种视网膜神经元类型均通过缝隙连接（gap junctions）形成电耦合，因此在脊椎动物视网膜中已开展了大量关于电突触及电通讯调控的研究3,4。越来越多的证据表明，视网膜内的昼夜（24小时）节律钟以及光刺激的变化可调控缝隙连接的耦合状态3-8。例如，近期研究发现，视网膜昼夜节律钟通过增强多巴胺D2受体的激活，在白天降低视杆细胞与视锥细胞之间的缝隙连接耦合；而在夜间则通过减弱D2受体的激活，显著增强视杆-视锥细胞间的耦合7,8。然而，不仅在完整神经视网膜组织中对胞体较小的神经元开展此类研究极为困难，而且在对单个视网膜神经元进行电生理记录时，也难以充分控制光照条件，以避免光照诱导的缝隙连接电导变化。
在此，我们介绍一种简单的方法，用于测定在不同光照条件下以及一天中不同昼夜时段视网膜神经元之间缝隙连接示踪剂偶联的程度。该切口加载技术是刮擦加载法的一种改良。9-12，该技术基于染料加载及通过开放的缝隙连接通道进行扩散。刮擦加载法在培养细胞中效果良好，但在完整视网膜等较厚组织切片中不适用。剪切加载技术已被用于研究完整鱼类和哺乳类视网膜中感光细胞的耦合情况7, 8,13，可用于研究此处所述的其他视网膜神经元之间的耦合。
方案
1. 用于金鱼、小鼠和兔的完整神经视网膜制备
- 在恒定环境光照（背景光照）条件下执行以下所有步骤，包括“2）切割加载”中所述的步骤。请注意，本方案中所述操作是在完全黑暗（即极暗（“暗视”）条件，≤ 0.0001 勒克斯）下使用夜视红外护目镜进行的，但也可改用其他强度的恒定环境光照，以确定不同环境光照水平对缝隙连接示踪剂偶联的影响。
- 在手术前，将实验动物（金鱼、小鼠或兔）暗适应至少 1 小时。
- 如先前所述7，通过将金鱼置于含三卡因甲磺酸盐（MS222；150 mg/L，溶于含碳酸氢钠的缓冲鱼缸水中）来实现深度麻醉；对小鼠使用氯胺酮（100 mg/kg，腹腔注射）和隆朋（10 mg/kg，腹腔注射）进行深度麻醉；对兔则使用氨基甲酸乙酯（负荷剂量：2.0 g/kg，腹腔注射），并辅以局部眶内麻醉（2% 利多卡因），如先前所述8。所有涉及动物护理与使用的实验操作均应遵循联邦指南，并经当地大学动物护理与使用委员会审查和批准。（注：在本研究所描述的实验中，所有涉及鱼类、小鼠和兔的护理与使用操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，并经俄亥俄州立大学机构动物护理与使用委员会审查和批准。）
- 对于鱼、小鼠和兔，在摘除眼球后，移除每个眼球的前部结构。然后将一片滤纸放置在眼球后部结构的上方，并将滤纸与眼球翻转，使滤纸位于眼球后部结构的下方。接着使用精细镊子，通过轻轻剥离与色素上皮/脉络膜/巩膜（三者相互粘连）相连的部分，将完整的神经视网膜从眼球后部结构上分离，此时神经视网膜附着于滤纸上。在此过程中，使用精细弹簧剪刀剪断视神经。此时，神经视网膜应以感光细胞面朝上的方向附着于滤纸上，并与眼球其余部分完全分离。
2. 切割负载法
- 将视网膜浸入盛有氧合Ringer溶液（表1）的6孔板中（约5 mL/孔），在持续环境光照（背景光照）下孵育30分钟（例如在极暗即“暗视”条件下），可选择性加入待测药物。鱼类视网膜置于含碳酸氢盐的氧合Ringer溶液（5% CO2 /95% O2）中，用封口膜密封6孔板，在22°C条件下维持；小鼠和兔视网膜则置于5% CO2 /95% O2培养箱中，于36°C维持。若使用待测药物，应从本步骤起至固定前所有后续步骤中持续存在。
- 在切割视网膜前，立即用Ringer溶液配制示踪剂溶液（通常为100 μL），溶解0.5%的神经生物素（一种生物素化分子）。注意：可在溶液中添加0.5%的罗丹明葡聚糖（高分子量，>10,000）。由于其分子量较大，罗丹明葡聚糖无法通过缝隙连接，仅标记因切割而受损的细胞。如图3所示，此方法可有效区分因损伤而积累神经生物素的细胞与通过缝隙连接扩散而积累示踪剂的细胞。
- 将神经生物素溶液滴加至玻璃（或塑料）培养皿中，将附着视网膜的滤纸轻轻在纸巾上轻拍以去除多余Ringer溶液，将剃刀刀片（或其他锋利刀片）浸入神经生物素溶液后，在视网膜及滤纸上做放射状切割。如需要，可使用垫片使切割仅穿过视网膜而不损伤滤纸。切割方向应垂直于视网膜表面。再次将刀片浸入神经生物素溶液，并进行第二次切割。每片视网膜最多可重复切割4次（见图1）。对小鼠及其他小型视网膜进行切割时，应使用解剖显微镜辅助操作。
- 如图1所示，将视网膜再次浸入新鲜Ringer溶液（含或不含待测药物）中，使用6孔板（每孔5 mL Ringer溶液），于室温孵育15分钟，以允许示踪剂加载与扩散。
- 用新鲜Ringer溶液（含或不含待测药物）洗涤三次，每次5分钟。
- 用含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）在室温固定视网膜1小时。
- 用0.1 M PBS在4°C条件下过夜洗涤。
- 次日，在0.1 M PBS + 0.3% Triton X-100中加入2%链霉亲和素-Alexa 488（终浓度10 μg/mL），4°C避光孵育过夜。
- 在室温下用0.1 M PBS洗涤三次，每次10分钟。
- 在PBS中将视网膜从滤纸上剥离，使用细毛刷将视网膜（感光细胞面朝上）转移至载玻片上。
- 用Vectashield封片剂（Vector Laboratories, Burlingame, CA）轻轻封片。
- 使用激光共聚焦显微镜（例如Zeiss 510 META）在相同放大倍数、分辨率和成像参数下拍摄图像，以便比较不同实验条件（如待测药物、光照条件）对缝隙连接示踪剂偶联范围的影响（图2A-C和图4A-C）。尽管单张图像可能已包含所有标记细胞，但仍建议采集感兴趣区域的z轴层扫图像，并将其投影合并为单张图像。
3. 使用 ImageJ 定量分析示踪剂偶联
- 在 LSM 图像浏览器中打开图像，点击“导出”并将其保存为未压缩的 16 位 TIF 文件。该 TIF 图像中应包含比例尺。
- 使用 NIH ImageJ 软件，测量整体视网膜低倍镜图像中 Alexa-488 标记的神经生物素的荧光强度。在 ImageJ 软件中打开 TIF 文件，然后绘制一条与比例尺对应的直线。进入“分析”菜单，选择“设定比例尺”，输入已知距离和长度单位，然后点击“确定”。此后测量结果将以校准后的单位（如毫米）显示。
- 使用矩形选区工具选择感兴趣区域。荧光峰值应位于选区的左边界。确保右边界附近无荧光信号。若不符合要求，请旋转当前图像（“图像”→“旋转”）。
- 点击“分析”→“轮廓分析”。您应看到一条从左至右呈指数衰减的曲线。
- 在弹出窗口中点击“复制”，并将数据粘贴至 EXCEL。此时您将看到两列数据：左列为距切割处的距离，右列为作为距切割处距离函数的荧光强度。
- 将每个原始荧光值除以最大荧光值，以获得相对荧光强度。
- 复制对应于距切割处距离（X）和相对荧光强度（Y）的两列数据，并将其粘贴至 Origin 软件中。
- 使用指数衰减 #1 函数进行拟合（图 2D 和 图 4D），其形式为：
Y = Y0 + Ymax*exp(-x/λ)
其中 Y 为相对荧光强度，Y0 为背景荧光，Ymax 为最大相对荧光强度，λ 为空间（长度）常数，x 为距切割处的距离。 - 使用 t 检验或方差分析（ANOVA）比较不同实验条件下空间常数（λ）的数值（图 2E 和 图 4E）。请注意，其他研究者已描述过不同的定量技术13,14。
4. 代表性结果
通过切口加载法（cut-loading）确定的感光细胞示踪剂偶联的代表性结果如图2和图3（鱼类）以及图4（兔）所示。为便于比较，共聚焦图像均采用相同的成像参数采集（图2A-C和图4A-C），并将荧光强度随距切口距离的变化进行作图，并用上述第3.8条中的指数函数进行拟合（图2D和图4D）。各实验条件下的空间常数（space constant）值分别显示在图2E和图4E中，表明切口加载技术可用于量化缝隙连接示踪剂偶联的程度。此外，实验结果具有高度可重复性。切口加载技术作为量化缝隙连接示踪剂偶联程度的方法，其有效性也得到了验证：在所有检测情况下，荧光强度均随距切口距离呈指数衰减7,8（参见本文图2D和图4D），说明神经生物素（neurobiotin）是通过刀片切口进入感光细胞，而非来自视网膜其他部位。此外，在金鱼中通过单个视锥细胞注射示踪剂与切口加载法均观察到相似的昼夜差异7，进一步证实切口加载法是测量感光细胞偶联程度的一种相对准确的方法。
划痕加载技术也可用于研究视网膜中其他类型的电突触。例如，图5显示，在暗适应条件下，通过划痕加载并扩散神经生物素后，兔A型（图5A）和B型（图5B）水平细胞均表现出同源示踪剂偶联。
| 化合物 | 鱼类 | 小鼠 | 兔 |
| NaCl | 130 | 120 | 117 |
| NaHCO3 | 20 | 25 | 30 |
| NaH2PO4 | - | 1 | 0.5 |
| KCl | 2.5 | 5 | 3.1 |
| 葡萄糖 | 10 | 10 | 10 |
| MgCl2 | 1 | - | - |
| MgSO4-7H2O | - | 1 | 1.2 |
| 谷氨酰胺 | - | 0.1 | 0.1 |
| CaCl2 | 0.7 | 2 | 2 |
表1：金鱼、小鼠和兔视网膜所用任氏液的成分。浓度以 mM 表示。任氏液用 5% CO2 /95% O2 混合气体饱和，并维持在 22 °C（鱼类）或 36 °C（哺乳类）。"-"：该物种的任氏液中未包含此成分。
图1.：显示切割加载步骤的流程图。在分离出完整的神经视网膜后，将刀片先浸入0.5%神经生物素溶液中，然后在视网膜上进行数条放射状切割。视网膜在示踪剂中孵育以实现加载和扩散，随后用0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）配制的4%多聚甲醛（PFA）固定前进行漂洗。使用链霉亲和素偶联的Alexa-488检测示踪剂耦合情况。
图2. 通过切口加样技术揭示了金鱼感光细胞示踪剂偶联的昼夜差异。感光细胞间隙连接的神经生物素示踪剂偶联在夜间（B）以及白天应用选择性多巴胺D2受体拮抗剂螺哌隆（10 μM）后（C）非常广泛，但在白天的对照条件下则不明显（A）。D）相对于切口距离（A-C中箭头所示）的归一化相对荧光强度。E）由D图数据及其他实验（n = 4）获得的空间常数。***P < 0.001。
图3. 一个代表性示例，显示在夜间将暗适应的金鱼视网膜用含神经生物素和罗丹明葡聚糖的溶液进行切口加载后，感光细胞层中的荧光情况。罗丹明葡聚糖（显示为红色）由于分子量较高（>10,000 MW），无法通过开放的缝隙连接通道扩散，因此仅标记了靠近切口的细胞。相比之下，神经生物素（显示为绿色）可通过缝隙连接扩散，在远离切口的感光细胞中也可观察到荧光。各图中箭头指示切口位置。比例尺：200 μm。
图4. 通过切口加样技术揭示兔视网膜感光细胞示踪剂偶联的昼夜差异。在夜间（B）以及白天应用螺哌隆（10 μM）后（C），感光细胞间隙连接的神经生物素示踪剂偶联广泛存在，但在白天的对照条件下则不存在（A）。在A-C中，显示了靠近切口处兔感光细胞三维重建的垂直视图。D）归一化的相对荧光强度随距离切口位置的变化。E）由D图数据及其他实验（n = 3）获得的空间常数数值。***P < 0.001。
图5. 切割加载法显示，暗适应的兔水平细胞具有示踪剂偶联。在暗适应的兔视网膜中，A型（A）和B型（B）水平细胞均表现出同源的神经生物素示踪剂偶联。
讨论
本文所述的切割加载法是一种有用且简便的技术，可用于测定在不同光照条件下以及昼夜不同时段视网膜神经元之间缝隙连接示踪剂耦合的程度。该技术的优点包括能够在昼夜不同光照条件下，对完整视网膜组织中神经元之间的缝隙连接示踪剂耦合程度进行量化，并适用于胞体直径较小的耦合神经元。然而，该技术在研究完整组织中缝隙连接时存在两方面的局限性。首先，由于以下原因，通过开放缝隙连接的示踪剂扩散可能较难观察：a）开放通道的直径较小或带有电荷；b）耦合细胞区室之间的相对体积差异1,14,15。也就是说，与示踪剂从较大细胞向较小细胞扩散相比，从小细胞向较大细胞或一组耦合细胞扩散时，由于示踪剂被稀释，可能更难以检测。其次，在某些生理条件下，由于小的带电离子的电导性与相对较大的示踪分子的通透性之间存在差异，完整组织中通过缝隙连接的示踪剂扩散程度可能无法准确反映缝隙连接电导的强度1,14,15。通常情况下，示踪剂耦合的证据强烈提示存在功能性的开放缝隙连接通道；但在某些生理条件下，即使电生理记录提示存在功能性开放的缝隙连接，示踪剂扩散仍可能不发生或无法被观察到。
采用切片染料加载技术来研究中枢神经系统其他区域完整组织中神经元间缝隙连接示踪剂偶联程度似乎是可行的。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号分别为 EY005102（S.C.M.）和 EY018640（C.P.R.）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三卡因甲烷磺酸盐（MS222） | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L 缓冲鱼缸水 |
| 尿烷 | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kg 负荷剂量 |
| 双筒夜视镜 | Night Optics USA | D-221 | |
| 滤纸，4号规格 | Whatman, GE Healthcare | 1004-090 | |
| 精细镊子，Dumont 5号，生物学用，11 cm长 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| 精细剪刀，弹簧式，8 mm刀片，直头 | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| 神经生物素（Neurobiotin） | Vector Laboratories | SP-1120 | 0.5% |
| 链霉亲和素偶联Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
| 罗丹明葡聚糖（高分子量（> 10,000）） | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
| Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 蔡司510 META激光扫描共聚焦显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| LSM-5 图像浏览器 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（National Institutes of Health） | ||
| OriginPro 8.0 | OriginLab |
参考文献
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