该解剖技术展示了为进行高通量筛选中的表型分析而对小鼠眼球进行摘除以固定组织的方法。
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摘要
摘要
小鼠眼睛是研究人类眼病转化医学的重要遗传学模型。人类致盲性疾病，如黄斑变性、感光细胞退化、白内障、青光眼、视网膜母细胞瘤和糖尿病视网膜病变，已在转基因小鼠中成功模拟。1-5 大多数转基因和基因敲除小鼠最初由实验室为研究非眼科疾病而构建，但由于不同器官系统间存在基因保守性，许多相同基因也可能在眼部发育和疾病中发挥作用。因此，这些小鼠为发现新的眼表型与基因型相关性提供了重要资源。由于这些小鼠分布于全球各地，高效且经济地获取、维持并进行表型分析存在困难。因此，大多数高通量眼科表型筛选仅限于少数具备现场眼科专业技术的机构，以对活体小鼠的眼睛进行检查。6-9 我们实验室开发了一种替代方法，即远程组织获取技术，可用于大规模或小规模的转基因小鼠眼组织调查。通过标准化的视频化手术技能传递、组织固定和运输流程，任何实验室均可从突变动物中采集完整眼球，并送至专业机构进行分子和形态学表型分析。在本视频文章中，我们展示了摘除并转运未经固定及灌注固定的鼠眼以进行远程表型分析的技术方法。
方案
1. 钝性解剖：小鼠眼球在未固定标本中的摘除
- 拉开眼睑，以更好地暴露并接触到眼球后部表面。
- 将一把弯头敷料钳置于眼眶（眼窝）内眼球的后方（下方）。Mahajan Sharptip 敷料钳是一种定制器械，其尖端较细，可使此步骤更简便（参见材料与试剂表）。
- 闭合敷料钳，夹住眼球后方的眶内结缔组织和视神经，注意避免挤压眼球本身。
- 轻柔向上牵拉敷料钳，将眼球从眼眶中摘出。白色线状组织即为视神经。
- 将眼球放入 PBS 中。使用 30 号针头，在角膜缘后方立即刺入眼球 1–2 mm，形成单个穿刺孔。此操作可使原本难以穿透眼组织的固定剂（如戊二醛）直接进入眼内。若使用能够扩散进入目标眼组织的固定剂（如多聚甲醛或乙醇），则可能无需制作此穿刺孔。
- 立即将整个眼球浸入固定剂中进行浸没固定。
2. 锐性解剖：灌注固定后小鼠眼球的摘除
- 使用弯头蜂鸟镊将眼睑与眼球分离。
- 将弯曲的威斯科特解剖剪与眼球平行放置，方向朝向眼眶后部。
- 从下方、内侧、上方和外侧切断环绕眼球的固定结缔组织。
- 将弯曲镊子置于眼球后方，夹住结缔组织但避免压迫眼球，向前牵拉以摘除眼球。由于灌注固定使眼眶结缔组织变硬，可能需要进一步剪切眼眶组织，才能完全松解眼球。
3. 固定与包装
固定组织的运输必须遵守您所在机构及邮政服务的相关要求，包括适当的标签和包装。以下方案是运输非感染性生物样本（室温条件下）的一个示例。该运输方式需要三层包装，但无需粘贴A类/B类生物物质或液氮标签。
- 将眼球放入一个5 mL的玻璃闪烁瓶中，加入至少3 mL固定液；若固定时间较短，则使用后固定缓冲液。在瓶盖上写明追踪编号，并用Parafilm密封。
- 将闪烁瓶放入经生物样本运输认证的运输容器中。例如，在我们研究所，认证容器需具备三层结构：最内层为密封容器，用于放置样本；中间层为吸水材料；外层为保护性外壳。
- 将该容器用气泡膜包裹后，放入经认证的实验室运输箱中，并附上相应的文件资料。
4. 代表性结果
眼睛的组织学检查可通过多种方法进行，包括苏木精和伊红染色、酶表达检测、透射电子显微镜观察以及免疫组织化学。组织经4%多聚甲醛浸没固定后，包埋于石蜡中，并使用切片机进行切片。在高通量表型分析中，我们分析包含眼球内所有组织类型的瞳孔-视神经切面（图1）。此外，还对组织切片进行了lacZ表达检测（图2）、细胞器的透射电子显微镜观察（图3），以及利用抗体检测特定分子的表达（图4）。
在我们的表型筛选方法中，无需保持眼睛相对于鼻侧（内眦）和颞侧（外眦）的方向。如果需要确定眼睛的方向，至少有两种选择。摘除眼球后，我们曾使用手持电灼装置在角膜颞侧三点钟位置进行轻微电灼处理。该灼伤在组织学上清晰可见，且在后续处理过程中不会像组织学染料那样丢失。缺点是电灼会损伤角膜，而角膜可能是检查所需的关键组织。另一种方法则需要具备识别眼外肌止点能力的熟练解剖学者。在体视显微镜下，通过识别下斜肌和上斜肌的止点，可标记出眼球的下部和上部方位。3 无论采用哪种定向方法，都必须记录标本为右眼或左眼。结合这些信息，可在切片前实现眼球方位的精确定位。
图1. 远程采集后的小鼠眼球组织学图像。 小鼠眼球经4%多聚甲醛灌注固定后，通过锐性解剖摘除。A. 瞳孔-视神经切面经苏木精和伊红染色，显示所有组织亚结构均得到良好保存。ON，视神经。（绿色标尺 = 500 微米）B. 正常视网膜的高倍放大图像显示其层状结构：RGC，视网膜神经节细胞；IPL，内丛状层；INL，内核层；OPL，外丛状层；ONL，外核层（光感受器细胞）（箭头）；IS，光感受器内节（箭头）；OS，光感受器外节；RPE，视网膜色素上皮；C，脉络膜。（绿色标尺 = 50 微米）C. 与正常视网膜相比，该样本因光感受器变性而变薄。ONL、IS 和 OS 完全缺失（箭头）。（绿色标尺 = 50 微米）
图2. 转基因小鼠中的lacZ表达。 通过钝性解剖摘除眼球，并在1 mg/ml X-gal溶液（5 mM K3Fe(CN)6、5 mM K4Fe(CN)6、2 mM MgCl2、0.02% NP40和0.1%脱氧胆酸钠）中37°C孵育过夜。眼球用2%甲醛/0.2%戊二醛固定30分钟，随后用切片机切片。X-gal反应产物（蓝色）标记：A. 睫状体上皮，B. 角膜上皮，以及C. 视网膜中的视网膜神经节细胞（RGC）层。INL，内核层；ONL，外核层。
图3. 视网膜色素上皮（RPE）的透射电子显微镜观察。 经钝性分离并制造穿刺伤口后，眼球组织在含2.5%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1 M磷酸钠缓冲液中浸没固定。随后用1%四氧化锇进行二次固定，逐步脱水后包埋于Spurr树脂中。组织切片厚度为90 nm，置于覆盖有Formvar膜的铜载网上，使用透射电子显微镜成像。电镜图像显示了神经感觉视网膜的光感受器外节、视网膜色素上皮细胞内的黑色素体（M）以及布鲁赫膜。
图4. 小鼠玻璃体中超氧化物歧化酶-3（绿色）的免疫组织化学标记。 通过钝性解剖摘除眼球，并在4%多聚甲醛中进行浸没固定。样品包埋于石蜡中，使用切片机进行切片。组织切片与兔多克隆SOD3抗血清（1:50稀释）孵育。采用 goat anti-rabbit IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 标记的二抗检测SOD3表达。SOD3的标记显示为绿色。
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讨论
大多数转基因小鼠存在于并不研究眼睛的实验室中。我们的视频技术展示了一种简单、标准化的方法，用于远程传递手术技能，以优化从缺乏眼部研究经验的实验室获取组织样本的过程。该视频技术有助于克服高通量表型分析中的一个主要缺陷，即由于组织采集和固定方法缺乏标准化，导致只能依赖少数专家中心，从而阻碍了有意义的比较性表型和分子研究。为了在任何新的远程实验室及技术人员中建立并维持质量控制，重要的是在研究开始时以及研究过程中定期纳入野生型眼睛样本。我们还发现，当从多种基因型转移多个眼睛样本时，追踪系统至关重要，例如采用基于网络的系统为每只眼睛分配唯一的识别编号。尽管灌注固定的动物能获得更高质量的固定效果及后续组织切片，但我们发现，从未固定动物摘除的眼球样本对于大多数形态学和分子研究已足够适用。此外，在来自不同来源的高通量研究中，获取未固定动物的眼睛样本可能显著更易于处理。转基因小鼠是研究人类眼病的重要工具10, 11，而通过远程组织获取实现本地化表型分析，可最大限度地利用这一宝贵资源。类似策略在组织解剖与共享中的应用，可能对非眼科组织的高通量表型分析产生重要影响。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
预防失明研究基金会；加州大学洛杉矶分校朱尔斯·斯坦因眼科研究所所长 Bartly J. Mondino 医学博士；以及桑格研究所惠康基金会基因组园区的 Ramiro Ramirez-Solis、Jacqui White 和 Jeanne Estabel。本研究符合 ARVO 关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 弯型敷料镊 | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan 尖头敷料镊 | Storz Ophthalmics | E1406 (货号 SP7-64520) | |
| 弯型 Westcott 剪刀 | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver 显微手术刀片 | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 细型 Castroviejo 缝合镊 | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri 镊 | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30 号针头 | BD Biosciences | 305128 | |
| 生物危害品邮寄容器 | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm 封口膜 | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 玻璃闪烁瓶 | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS，pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% 多聚甲醛 / 2.5% 戊二醛溶于 0.1 M 磷酸钠缓冲液 | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | 实验室配制 |
| 50% 戊二醛 | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar 溶液 | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| 铜网载网（Slot Grid） | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% 四氧化锇 | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| 抗 SOD3 抗体 | Abcam | Ab21974 | |
| 山羊抗兔 Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s 包埋树脂 | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
参考文献
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