表达GFP-肌动蛋白的活内皮细胞中肌动蛋白细胞骨架的研究

摘要

表达GFP-肌动蛋白的活内皮细胞的显微成像可用来表征细胞骨架结构的动态变化。与使用固定样本的技术不同，该方法可在同一细胞中详细评估在不同物理、药物或炎症刺激之前、期间和之后肌动蛋白细胞骨架随时间发生的变化。

摘要

微血管内皮在调控液体和溶质通透性方面发挥着重要的选择性屏障作用。内皮细胞之间的黏附连接调节内皮通透性，许多研究表明，肌动蛋白细胞骨架在维持连接完整性方面具有重要作用^1-5。皮层肌动蛋白环被认为对维持稳定的细胞连接至关重要^{1, 2, 4, 5}。相反，肌动蛋白应力纤维被认为在内皮细胞内产生向心张力，从而削弱细胞连接^2-5。这些理论大多基于以下研究：用已知可增加内皮通透性的炎性介质处理内皮细胞，随后固定细胞并标记F-肌动蛋白以进行显微观察。然而，这些研究对肌动蛋白细胞骨架作用的理解非常有限，因为固定细胞的图像仅提供某一时间点的静态画面，无法反映肌动蛋白结构的动态变化过程⁵。

活细胞成像技术可将肌动蛋白细胞骨架的动态特性纳入内皮屏障完整性的机制研究中。该方法的主要优势在于，可在同一组活细胞中分别于处理前后评估各种炎症刺激对内皮细胞中肌动蛋白结构的影响，从而避免在观察固定样本时可能产生的偏差。将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）转染表达GFP-β-actin的质粒，并在玻璃盖玻片上培养至完全汇合。在加入可诱导内皮屏障完整性发生时序性变化的炎症介质前后，分别采集汇合HUEVC中GFP-肌动蛋白的时间序列图像。这些研究可实现对肌动蛋白细胞骨架在内皮屏障破坏与恢复过程中所发生的一系列动态变化的直观观察。

我们的结果一致显示内皮细胞中局部富含肌动蛋白的片状伪足的形成与周转。同时可观察到肌动蛋白应力纤维的形成与运动。通过明场图像分析，可记录炎症刺激处理前后局部片状伪足形成与周转频率的变化。这些研究为内皮细胞中肌动蛋白细胞骨架的动态特性提供了重要信息，有助于发现此前未知的、对维持内皮屏障完整性至关重要的分子机制。

方案

1. 用 GFP-肌动蛋白转染 HUVEC

1. 可采用多种方法转染 HUVEC。本实验室使用下述 Nucleofector 系统（Lonza，瑞士巴塞尔）。通常应快速操作以提高细胞存活率和转染效率。每次转染需要 5 × 10⁵ 个 HUVEC，接种于两张玻璃盖玻片（Corning No. 1，22 × 50 mm）上。Nucleofector 系统结合了电穿孔与化学试剂以转染质粒 DNA，通常可实现 >50% 的表达效率。化学转染试剂也是一种替代方法。有研究团队曾使用 GenePORTER 试剂成功将 GFP-肌动蛋白转染至牛内皮细胞⁶。我们所用的 Nucleofector 操作步骤如下所述。
2. 根据培养腔室类型，可使用预灭菌的培养器皿或普通盖玻片。对于玻璃盖玻片，需在生物安全柜中将其放入含约 5 ml 70% 乙醇的 10 cm 培养皿中，浸泡 2 分钟进行灭菌。用无菌镊子取出后，靠置于另一个培养皿侧壁晾干。
3. 待盖玻片干燥后，将其分别放入各自的 10 cm 培养皿中。在盖玻片中央滴加 300 μL 温热的明胶溶液（1.5% 溶于 0.9% NaCl），静置 5 分钟，随后吸除。保持该基质涂层位于中央且不接触边缘，可确保细胞密集接种并快速达到汇合状态。
4. 为每次转染准备一个 1.5 mL 微离心管，加入 500 μL EGM2MV 培养基（Lonza），并置于 37°C、5% CO₂ 培养箱中备用。
5. 使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 HUVEC 并收集至 15 mL 圆底离心管中，计数细胞。每次转染需 5 × 10⁵ 个细胞。根据拟进行的转染次数，调整细胞悬液体积，使最终获得的细胞沉淀数量为每次 5 × 10⁵ 个细胞乘以转染次数。
6. 将细胞悬液在临床离心机中以 5000 rpm 室温离心 3 分钟。倾斜离心管，尽可能吸除上清液。
7. 用 HUVEC 或原代内皮细胞 Nucleofector 试剂盒（Lonza）中的基础 Nucleofector 溶液重悬细胞沉淀。每 5 × 10⁵ 个细胞使用 100 μL。由于该溶液具有毒性，细胞悬浮于其中时应尽快操作。
8. 向转染样品中加入 GFP-β-肌动蛋白载体质粒（每 100 μL Nucleofector 悬液加入 0.2–2 μg）。每次转染每 5 × 10⁵ 个细胞加入 0.2–2 μg 的 GFP-肌动蛋白质粒 DNA。
9. 将 100 μL 细胞悬液转移至 Nucleofector 电转杯中。盖上杯盖，轻弹数次以确保细胞悬液完全沉降至底部。
10. 将电转杯插入 Nucleofector II 仪器的电转杯插槽中，运行所需的电穿孔程序。我们对 HUVEC 使用程序 A-034。
11. 将电转杯放回生物安全柜中。从 37°C 培养箱中取出一支含有 500 μL EGM2MV 的微离心管，置于柜内。使用 Nucleofector 试剂盒提供的转移移液管，将温热的 500 μL 培养基轻柔加入电转杯中的细胞悬液中。将电转杯中全部内容物转移回微离心管，并放回培养箱中孵育 15 分钟，使细胞恢复。
12. 若需转染更多细胞，可重复步骤 9–11。
13. 一个含 600 μL 转染后 HUVEC 悬液的微离心管可用于接种两张盖玻片。在生物安全柜中，使用 1000 μL 移液器轻轻吹打悬液一次以混匀，随后将 300 μL 悬液直接滴加至经明胶包被的盖玻片上。注意避免悬液接触盖玻片边缘。将盖玻片置于 37°C/5% CO₂ 培养箱中孵育 1–4 小时，以促进细胞贴壁。
14. 孵育 1–4 小时后，检查转染细胞以确认其已贴附于盖玻片。随后加入 10 mL EGM2MV 培养基，并将培养皿放回 37°C/5% CO₂ 培养箱。通常在 4–8 小时内可观察到 GFP-肌动蛋白的表达。实验通常在转染后 24–48 小时内进行。

2. 设置活细胞成像室和载台加热器

1. 在大多数研究中，我们使用 Warner Instruments 的开放式金刚石浴槽（RC22），将其置于 PH-1 载物台加热器中，并通过重力流动系统供液。然而，活细胞成像载物台有多种可选方案，包括适配玻璃底培养皿的腔室、开放式与封闭式腔室，以及各种微型培养箱/物镜加热器组合和大型培养系统。最终的腔室选择将取决于多个因素，例如是否需要进入浴槽添加测试试剂或药物、培养基是静态还是流动状态，以及实验持续时间。此外，有时温度不稳定会导致焦距漂移，可通过能够维持浴槽和物镜温度稳定的控制系统将其影响降至最低。
2. 为实验分装足量的培养基。我们根据实验持续的每小时，分装 50 ml 白蛋白生理盐溶液（APSS；表 1）。
3. 可使用泵或重力流动系统将培养基输送至腔室。在我们的系统中，将 APSS 加入由静脉输液管路构建的简单重力流动系统，并连接至串联加热器（Warner Instruments 型号 SH-27A）。我们以约 40 mL/h 的流速施加流动。
4. 若使用如我们所用的开放式浴槽腔室，需用棉签蘸取真空润滑脂涂抹于金刚石浴槽底面外缘。随后，从培养箱中取出一张带有细胞的盖玻片，用镊子轻轻夹起，并用 Kimwipe 轻触其背面以吸除多余培养基，同时保持细胞面湿润。将细胞面朝上放置，再将金刚石浴槽覆盖于盖玻片上形成腔室。
5. 迅速将腔室放入载物台加热器中，并手动拧紧夹具固定。此步骤需特别注意细胞干燥的风险，因此操作应迅速完成，并在安装后立即用移液器向腔室内加入约 _˜1 mL 培养基，以防细胞干燥。
6. 我们的腔室允许培养基在细胞表面持续流动。在开启流动前，必须将真空管连接至腔室上的支架，以便排出多余的培养基（APSS）。同时应开启串联加热器和浴槽加热器（设定为 37 °C）。我们的系统还配有热敏电阻探头用于监测温度，应将其置于浴槽边缘。
7. 用浸有 70% 乙醇的 Kimwipe 小心擦拭盖玻片底面，以去除残留的 EGM2MV 培养基及盐结晶，随后再用干燥的 Kimwipe 或镜头纸擦拭一次。
8. 待腔室安装完毕、流动开启且温度稳定在 37 °C 后，需让细胞至少适应和稳定 30 分钟，方可开始实验。
9. 等待期间，开启活细胞成像显微镜的所有组件（光源、滤光轮控制器、相机、计算机）。

3. 使用活细胞成像显微镜获取数据

1. • 有多种活细胞显微成像系统可供使用。我们的系统为尼康Eclipse TE-2000U，包含以下组件：
   • Sutter Instruments Lambda LS 300 W 氙灯
   • Sutter Instruments Lambda 10-3 激发滤光片轮，配备SmartShutter和S492滤光片（也可使用D350和S572激发滤光片，分别用于紫外和RFP应用）
   • 二向色镜2002bs发射器（Nikon 61002m）
   • CI Plan Fluor 10X DLL 物镜，NA 0.30（Nikon MRH10100）
   • Plan Fluor ELWD 40X DM 物镜，NA 0.60（Nikon MRH08420）
   • Plan Apo VC 100X 油镜，NA 1.40（Nikon MRD01901）
   • Photometrics CoolSNAP HQ2 相机，成像阵列为1392 x 1040，像素尺寸为6.45 x 6.45 μm
     （Roper Scientific）
   • 我们还配备两种可用于图像采集的软件包：Nikon Elements-AR 3.0 和 Metamorph 6.1。
2. 观察细胞并找到合适的研究区域后，锁定粗调焦旋钮，并检查软件采集设置，确保：
   1. 滤光片轮设置为S492滤光片（在我们的配置中标识为“FITC”）
   2. 在采集软件中，物镜设置应与所需放大倍数匹配（我们的显微镜未配备电动驱动，但此设置可确定μm/像素比）。同时确保显微镜上的Optivar透镜设置为1.0X放大倍数。将Optivar设置为1.5X虽可提高放大倍数，但会降低信号强度。
      所用放大倍数取决于研究目的。为获得最佳细节，建议使用高数值孔径的100X物镜，以实现最佳空间分辨率和信号透过率。我们的显微镜还配备了一个长工作距离的40X物镜，适用于需要额外工作距离的其他应用。然而，当需要同时观察多个细胞时，该物镜也可用于观察细胞器大小的结构，但会牺牲空间分辨率和信号强度。对于以信号强度为终点指标的研究，或更高级的成像技术（如荧光斑点显微术），推荐使用100X物镜。
   3. 相机曝光时间设置为0.5–2 s之间。具体时间取决于细胞中GFP-肌动蛋白的荧光强度。我们通常采用尽可能低的曝光时间，以避免GFP-肌动蛋白的光漂白及对细胞的潜在毒性。
   4. 为获得最佳分辨率，应将Bin值设为1×1，增益设为1。在某些情况下，可将Bin值设为2×2以缩短曝光时间，但这会降低在延时实验中对运动物体测量的精确度。
   5. 配置延时成像参数：
      1. 选择用于保存采集图像的文件夹并输入文件名。
      2. 设置实验所需的图像数量和时间间隔。我们通常采用15秒至1分钟的图像间隔，总时长可达2小时。
      3. 确保在图像采集之间关闭活动快门。
3. 开始延时图像采集前，关闭室内灯光，并采集单张图像以检查设置。
4. 同时采集一张明场图像。确保聚光镜设置为合适的相差或微分干涉（DIC）滤光片。打开卤素灯并采集图像，随后关闭卤素灯。
5. 恢复至“FITC”设置以进行延时成像，并采集一张测试图像。
6. 开始采集延时图像序列。
   实验过程中，需密切监控图像采集情况。在某些情况下，培养腔内微小的温度变化可能导致焦距漂移。可通过优化进气和真空管路，使气流在细胞上方保持稳定，从而避免此问题。此外，减少显微镜室内的人员走动，并将天花板通风口的气流引导远离显微镜，也有助于稳定成像。根据我们的经验，另一种有效的方法是使用可完全包裹载物台和物镜的37 °C/5% CO₂ 培养箱腔体。这种方法便于对细胞进行过夜或更长时间的监测，但对细胞的操作通路受限。
   如有必要，可暂停延时采集并重新对焦。应尽快完成对焦操作，以避免改变图像间的时间间隔。
7. 典型的实验方案包括：在加入测试试剂前采集20–30分钟的基线图像，随后继续采集0.5至4小时的图像。实验时长可能受限于GFP随时间推移发生的光漂白，因此选择尽可能短的曝光时间至关重要。若需进行更长时间的实验，也可考虑将延时图像间的间隔调整为30–60秒。

4. 数据分析

1. 可以使用多种软件包来分析图像集，例如 NIS Elements、Metamorph、Slidebook 等。我们通常使用 NIH ImageJ 进行图像分析，以便在实验室或家中任何计算机上进行操作。我们使用的版本包括：
   MBF ImageJ (http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ )
   FIJI (http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji)。
2. ImageJ 可用于分析多种动态过程，包括：
   • 片状伪足突出的频率
   • 突出的距离、时间和速度
   • 随时间变化的肌动蛋白纤维运动
   Nikon Elements 将延时图像保存为“ND”文件。要在 ImageJ 中打开，需使用“导出 ND 文档”功能将其转换为 TIF 序列。Metamorph 图像堆栈无需修改即可在 ImageJ 中直接打开。我们在 ImageJ 中打开 TIF 序列时的一个选择是将其转换为 8 位灰度图像。这有助于更方便地查看图像，因为亮度和对比度的调整将应用于整个图像序列，而不仅仅是当前查看的单张图像。
3. 在 ImageJ 中，当图像集打开后，窗口左上角会显示切片编号/总切片数，以及文件名、像素数量、文件类型和大小。底部的 Z 滚动条对应时间。此外，将鼠标指针悬停在图像上时，ImageJ 工具栏底部将显示 x、y 和 z 方向的像素位置。
4. 通过确定随时间出现的新突出数量，可研究片状伪足的突出行为。该分析可在整个细胞周长或选定区域进行。此类分析也可在非融合、未转染的细胞中通过相差显微镜或微分干涉差（DIC）显微镜完成。然而，使用表达 GFP-actin 的细胞可实现对融合单层细胞的分析，尤其是在表达与不表达 GFP-actin 的细胞彼此相邻时。
5. 片状伪足突出的距离、持续时间（时间）和速度可通过条带图（线扫描）分析进行评估。绘制一条垂直于细胞边缘的直线（若无相邻细胞，或相邻细胞不表达 GFP-actin，则操作更为简便）。在 ImageJ 中按下“/”键即可生成条带图，其中 x 轴表示距离，y 轴表示时间（根据上述时间间隔指南，每像素对应 15 秒至 1 分钟）。可在突出的片状伪足上绘制线条，并通过按下 ImageJ 中的 M 键测量框的尺寸，进而计算距离、时间和速度。
6. 应力纤维的运动也可采用类似方法通过条带图分析进行测量。

5. 代表性结果：

采用我们的转染方案，通常可在至少50%的转染HUVEC细胞中观察到GFP-肌动蛋白的表达，且经常能在盖玻片上找到 >90%的该区域HUVEC表达GFP-actin。Movie 1展示了一项表达GFP-actin的亚融合状态HUVEC的活细胞成像实验示例。在本实验中，每分钟采集一次图像。从视频中可见，HUVEC中的GFP-actin可在整个细胞质中观察到，同时可见于丝状结构以及沿细胞边缘局部伸出的片状伪足中。视频还显示，不同细胞间的GFP-actin表达水平并不均一。用于研究的细胞通常需表达足够量的GFP-actin，以便可视化含有丝状肌动蛋白的各种结构。然而，GFP-actin表达水平过高的细胞可能不利于研究，因为在这些细胞中，通常难以区分F-actin结构与大量存在的G-actin。

视频2展示了表达GFP-肌动蛋白的汇合HUEVC细胞行为的一个示例。与未完全汇合的HUEVC细胞类似，细胞边缘明显存在活跃的片状伪足形成和动态更新。然而，这些片状伪足常演变为膜皱褶，表明其突出效率较低⁷。这可能是由于邻近细胞的存在阻碍了其下方的基质。肌动蛋白皮层纤维和应力纤维在视频1和视频2中也清晰可见。尽管我们观察到的细胞保持静止状态，但其应力纤维类似于迁移细胞中的横向弓状纤维，它们在细胞边缘附近形成，并向细胞中心横向移动，最终在中心区域解聚^{8, 9}。在这些细胞中观察到的另一个动态特征是肌动蛋白环状结构的形成，该结构呈同心圆方式扩展，此前被称为肌动蛋白云（actin clouds）¹⁰。

图1展示了如何利用延时成像序列通过线扫描分析（kymograph analysis）对细胞突起的距离、持续性和速度进行量化。在图1A中，沿大致垂直于细胞边缘的方向画出一条单像素线，用于生成线扫描图（图1B）。在此线扫描图中，该线所定义的区域被垂直放置，而延时成像中的各时间点图像则沿水平方向依次堆叠。从左至右观察线扫描图，细胞边缘的向上移动代表了突起的形成。在图1C中，将一条线叠加在其中一个突起的边缘上，并采集该线对应的像素数据，结果如面板底部的“结果”窗口所示。该分析方法可实现对突起动态行为的定量表征，同时亦可用于估算该细胞区域的突起频率（即单位时间内突起发生的次数）。

应力纤维运动分析的一个示例如图2所示。我们观察到的大多数应力纤维在细胞周边附近形成，并向细胞中心移动，最终在该处解聚。这一过程也可通过线扫描分析进行量化。在图2A中，画一条垂直于细胞边缘和应力纤维的线，由此生成线扫描图像（图2B）。在线扫描图像中，应力纤维表现为细胞质区域内的连续线条，通常向下并向右移动（朝向细胞中心）。有时在原始的线扫描图像中难以看清纤维，此时我们使用反锐化掩模滤镜来增强图像清晰度（图2C）。在应力纤维上绘制线条，并利用测量功能收集像素数据（图2D）。另一种收集数据的方法是，沿所识别的应力纤维起点至终点画一条线，以获得该纤维被观察期间的平均斜率（图2E）。该分析方法可对应力纤维的侧向运动进行量化，也可用于量化在细胞该区域中观察到的应力纤维数量。

图 1. 细胞边缘的线扫描分析，用于确定局部伪足的突出距离、持续时间和速度。A. 沿大致垂直于细胞边缘的路径绘制一条单像素线。从延时成像序列的每幅图像中提取该区域，生成该区域随时间变化的拼接图像。B. 在生成的线扫描图中，x 轴表示时间，从左向右推进，y 轴表示距离。细胞边缘随时间的移动可在该线扫描图中进行评估，伪足表现为细胞边缘向右移动时向上延伸的区域。C. 在识别出伪足突出的细胞边缘处绘制一条线，然后获取所画线对应边界矩形的尺寸（如叠加窗口所示）。宽度用于计算突出时间或持续时间，高度用于计算突出距离。突出速度通过高度除以宽度计算得出。在本例中，向上移动的距离为 96 像素 × 0.16125 μm/像素 = 15.5 μm，时间为 11 像素 × 1 min./像素 = 11 min。速度计算为 15.5 μm / 11 min. = 1.4 μm/min。

图2. 肌动蛋白应力纤维运动的线扫分析。A. 在细胞边缘垂直处绘制一条单像素线，以生成线扫图。B. 如图1所示，在生成的线扫图中，x轴表示时间，y轴表示距离。应力纤维在细胞中呈现为连续的线条，通常向右下方延伸（箭头所示）。C. 为了更清晰地观察应力纤维，可使用反锐化掩模滤波器。在此示例中，使用了3像素的半径和0.60的掩模权重。D. 随后在已识别的应力纤维上绘制单像素线并收集数据。本图中绘制了三条线，每次测量后按下“delete”键，以在其位置留下永久性标注（白色线）。E. 或者，若需获取应力纤维的平均距离、时间和速度，可从起始点到终点绘制一条线（黄色线），并获取相应的数据（在结果窗口中高亮显示）。本示例中，对该应力纤维共采集37帧数据，采样频率为1帧/分钟，总时长为37分钟。在此时间段内移动的距离为75帧 × 0.16125 μm/像素 = 12.1 μm。因此，该应力纤维的侧向速度为12.1 μm / 37 min = +0.33 μm/min。速度值为正表示纤维向细胞中心移动，为负则表示向细胞周边移动。

视频 1. 表达 GFP-actin 的活 HUVEC 细胞的延时图像。图像间的时间间隔为 1 min。局部片状伪足沿细胞整个周边突出。此外，横向弓形应力纤维向细胞中心侧向移动。当向浴液中加入凝血酶（1 U/ml）后，细胞轻微收缩，片状伪足的向外突出暂停约 10 min。细胞收缩后，片状伪足的形成与更新重新恢复。点击此处观看视频。

视频 2. 表达 GFP-肌动蛋白的融合 HUVEC 细胞，在凝血酶处理前和处理后的变化。右下角显示经过的时间，格式为 分钟:秒。图像间的时间间隔为 30 秒。在 45 分钟的基础观测期后加入凝血酶（1 U/ml）。标注的事件包括局部片状伪足的形成与解聚（细胞边缘附近的箭头，0:59 - 37:29）、肌动蛋白云状结构（箭头，1:59 - 21:29），以及在加入凝血酶后于三细胞连接处扩大的缝隙（箭头，62:30 - 70:00）。多个细胞中还可明显观察到横向弓形应力纤维。这些细胞在其周边持续活跃地形成并解聚局部片状伪足，其中许多进一步发展为膜皱褶。凝血酶导致片状伪足的形成与解聚暂时停止，并短暂出现一些细胞间的微小间隙。点击此处观看视频。

讨论

在活的内皮细胞中对GFP-肌动蛋白进行成像，可详细分析肌动蛋白细胞骨架在炎症刺激下的动态变化。该方法还可用于进一步研究既往发现的细胞骨架在剪切应力等物理力作用下的重构现象¹¹。此外，该方法能够详细评估肌动蛋白细胞骨架动态变化对多种内皮细胞活动的贡献，包括细胞迁移、有丝分裂、细胞间连接的形成与连接成熟，以及屏障功能的维持。

在所示数据中，可以观察到内皮细胞肌动蛋白细胞骨架在凝血酶处理前后的变化。在非融合和融合的内皮细胞单层中，均可观察到细胞边缘各处的局部片状伪足随时间推移而形成并回缩。凝血酶处理短暂中断了片状伪足的形成与动态更新。凝血酶还导致细胞发生轻微收缩，这与先前报道一致，即凝血酶可诱导内皮细胞中肌动蛋白应力纤维的形成，并增加向心性张力^12-14。然而，通过此类活细胞成像研究，现在可以确定应力纤维的来源。在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中，大多数应力纤维起源于细胞周边区域，形态类似于迁移细胞中的横向弓状纤维^{8, 9}。与使用固定细胞的方法相比，该方法的另一优势在于可在同一细胞中定量分析凝血酶处理前后应力纤维的数量，从而消除实验组之间的选择偏倚。

通过本方案，我们评估细胞边缘和肌动蛋白应力纤维的动态运动。为了理解内皮细胞中肌动蛋白单体的动力学，可采用更先进的技术，如光漂白后荧光恢复（FRAP）或荧光斑点显微技术（FSM）^{15, 16}。此外，由于微血管内皮细胞可能更能代表微血管屏障功能的理想模型，因此优化转染方案以在微血管内皮细胞中高效表达GFP-肌动蛋白，是未来合理的研究方向。

总之，对表达GFP-肌动蛋白的活内皮细胞进行成像，是研究内皮细胞肌动蛋白细胞骨架如何响应各种刺激的有力工具。利用紧密融合的内皮单层细胞开展的研究，将有助于阐明富含肌动蛋白的片状伪足和横向弧状应力纤维等动态结构在内皮屏障功能中的作用。此外，对表达GFP-肌动蛋白或其他可标记其他亚细胞结构的融合蛋白的内皮细胞进行活细胞成像，将提供详细的时间-空间信息，有助于理解决定屏障完整性的信号转导和结构机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1. Ringer 5x 储备液
氯化钠	EMD Millipore	SX0420-3	35 g
氯化钾	JT Baker	3040	1.75 g
氯化钙	Sigma-Aldrich	C-3881	1.47 g
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M-9397	1.44 g
无菌过滤水	N/A	N/A	加至 1 L
经无菌过滤后分装至已灭菌的瓶中，于 4°C 保存
2. MOPS 缓冲液
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183	125.6 g
无菌过滤水	N/A	N/A	加至 1 L
经无菌过滤后分装至已灭菌的瓶中，于 4°C 保存
3. 白蛋白生理盐溶液（APSS）
Ringer 储备液（5x）	N/A	N/A	200 mL
MOPS 缓冲液	N/A	N/A	5 mL
磷酸钠	Sigma-Aldrich	S-9638	0.168 g
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P5280	0.22 g
EDTA 钠盐	Sigma-Aldrich	ED2SS	0.0074 g
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528	0.901 g
牛血清白蛋白	USB Corp., Affymetrix	10856	10 g
无菌过滤水	N/A	N/A	加至 1 L
在 37°C 下调节 pH 至 7.4，然后经无菌过滤后分装至已灭菌的瓶中，于 4°C 保存。
4. 0.9% 生理盐水
氯化钠	EMD Millipore	SX0420-3	9 g
无菌过滤水	N/A	N/A	加至 1 L
经无菌过滤后分装至已灭菌的瓶中，于 4°C 保存
5. 1.5% 明胶溶液
猪皮来源明胶	Sigma-Aldrich	G2500	15 g
0.9% 生理盐水	N/A	N/A	加至 1 L
将溶液加热至 37°C 以充分溶解明胶。保持温热状态下经无菌过滤后分装至已灭菌的瓶中，于 4°C 保存