$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 刺激与记录用微电极的制备（图1a）
- 测量套管和探针（在本示例中为纳米传感器）的长度。探针必须比套管长出其从套管尖端伸出的长度（根据探针设计而定），并额外预留约 2 cm。
- 在放大镜或显微镜下（约 10 倍放大）将探针装入套管；若可能，建议采用后装方式，以保护探针尖端。
注意： 此步骤需手动完成，操作难度较高。建议先在放大镜下使用微电极进行练习，再尝试使用实际实验探针。 - 将套管（内含探针）依次穿过顶部卡套、T 型接头和底部卡套。
- 若探针仅为无任何附属结构的单根导线，则从后端装入套管，并从底部卡套将组件插入 T 型接头。套管顶部（平端侧）应位于 T 型接头中部，处于底部卡套内，但不在顶部卡套内。实验探针或生物传感器应从卡套顶部伸出。
注意： 可使用微型钻头在卡套塞上钻孔以自制定制卡套，钻孔尺寸应根据固定套管至 T 型接头所需的直径确定。
- 使用卡套扳手拧紧 T 型接头顶部和底部的卡套。切勿过度拧紧。可在顶部卡套内添加一小段管材以增强电极的支撑。
- 根据探针的规格，将金针焊接到探针的各个端子（信号、接地等）上。
- 调整探针与套管的相对位置。在放大条件下测量探针从套管伸出的距离，并从顶部手动调节（探针可在卡套内自由滑动）。
- 在金针与顶部卡套之间添加环氧胶，将探针固定至卡套。
- 拧松顶部卡套，将探针缩回套管内部。在放大条件下目视确认探针已完全进入套管内。
- 将注射电极连接至微驱动装置。
2. 药物输注用微注射电极的构建（图1b）
- 使用卡套将套管的“无斜面”或平头端连接到 T 型接头底部。使用卡套扳手拧紧卡套。
- 将一小段毛细管（约 1.5 cm）穿过标准卡套，连接到 T 型接头顶部。用卡套扳手拧紧。
- 从毛细管、T 型接头、套管及相应卡套的后端装入微电极。
- 确保电极后端从毛细管后部伸出的长度小于 1 cm，电极尖端从底部套管端按所需距离伸出。可通过顶部端口手动调节电极位置。
- 将金针焊接到微电极的终端上。
- 在金针与顶部卡套之间添加环氧胶，以将微电极固定在卡套上。
- 拧松顶部卡套，将探针缩回套管内部。目视确认微电极已完全缩入套管内。
3. 微流控电路的构建（图2）
- 将面包板放置在稳定的表面上。将两个三通阀平行于面包板的最长边放置，相距约15厘米，使其中一个端口（始终开启的端口）彼此相对。使用螺丝将阀门固定在面包板上。
- 将一把直尺放置在阀门旁边（用于测量和追踪毛细管内液体的移动）。
- 将1:1的低黏度油与食用色素（标记物）混合液装入气密注射器中，并将其安装到标记泵上。截取一段毛细管，使用标准卡套和鲁尔锁接头将注射器连接至输入阀的一个端口。此为“标记管线”。
- 截取一段较短的毛细管作为“标尺管线”。使用标准卡套将该管连接至阀门相对的端口。
- 截取两段较长的毛细管，分别用于连接输出阀与微注射电极，以及连接药物泵与输入阀（使用标准卡套）。
注意：这两段管线的长度取决于实验装置，其中一段必须足够长以从输注装置延伸至动物体内，另一段则需从药物泵延伸至输入阀。使用切割石切割毛细管。
4. 将微电极安装到微驱动装置上（图3）
- 安装前，确保微电极/实验探针已缩回套管内。
注意：引导管应位于微驱动装置的适当位置。 - 将定制的适配器连接到微注射电极上。
- 通过引导管从上方装入微注射电极，并使用螺丝将其固定在适配器上。
- 测量微驱动装置的位置（深度），使微注射电极从引导管中伸出，然后将其回缩约 1 cm，以准备插入。
- 进行微输注实验时，将“脑部导管”连接至微电极的未使用的T形接头开口处。使用标准卡套并用卡套扳手拧紧。
5. 微流控系统的冲洗与准备
- 将带有微注射电极的微驱动装置置于废液杯上方。
- 将氯己定（例如诺瓦森，溶解浓度为 20 g/L）吸入 1 mL 气密注射器中，并将其放入药物泵。调节阀门流向，使液体从药物泵经阀门流向阀管路，并从“脑部管路”端流出。
- 以低流速（50–200 µL/min）用氯己定冲洗管路至少 10 分钟。随后用无菌生理盐水重复步骤 5.2 至 5.3，再用空气冲洗。
注意：此阶段必须检查是否存在泄漏。可在接头处轻轻使用无尘擦拭纸，以帮助发现套管接口处的液体渗漏。 - 将药物装入 500 µL 气密注射器，压缩其中的空气后，放入药物泵。以 50 µL/min 流速推动，直至微注射电极末端有数滴液体流出。
- 将导管浸入氯己定溶液（溶解浓度为 20 g/L）中浸泡 15 分钟。
- 将输出阀的流向转向“冲洗管路”。推动标记物泵，直至在标尺管路上观察到清晰的颜色与油相界面。确保药物与染料之间始终存在油相，以防止两种水溶性物质混合，并保持二者之间的清晰边界。标记该油/染料界面的起始位置（可用胶带或记号笔标记）。
- 将输出阀的流向转向“脑部管路”。
6. 进行记录或输注实验
注意：动物操作步骤将根据实验室和实验的不同而有所差异。以下步骤应在完成必要的手术设置和准备以暴露硬脑膜后进行。实验结束后，必须按照机构批准的方案执行所有必要的术后操作步骤。
- 将微型驱动装置连接到记录腔室。降低导管使其穿透硬脑膜。
注意：导管不应穿透超过硬脑膜的深度，以避免损伤皮层。 - 将微注射电极下降至距离脑内记录/注射位点约 2 mm 的上方位置。
- 拧紧顶部卡箍（微电极/生物传感器突出部分），并将金针连接至记录系统。继续推进微注射电极至目标位点。
注意：计算时需计入微电极超出套管的部分长度。 - 进行灌注实验时，使用手动微量注射泵，每 3 分钟推动油柱前进 1 cm（约 60 nL/min）。当完成目标体积灌注后，将输出阀切换至冲洗管路。
注意：灌注体积将根据实验动物模型和目标脑区的不同而变化。过快的流速可能损伤神经组织。 - 实验完成后，将微注射电极收回至导管内（保持探针部分伸出）。随后取下微型驱动装置进行冲洗。冲洗微流控系统以备再次使用。注意：根据我们的经验，若操作得当，微注射电极可多次重复使用。电生理记录质量的下降速度通常快于注射功能的退化。
