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清醒非束缚小鼠的高胰岛素-正常血糖钳夹实验

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DOI：

10.3791/3188

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2011年11月16日

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1Diabetes and Obesity Research Center, Sanford-Burnham Medical Research Institute at Lake Nona, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Department of Pediatrics and Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

本文内容

摘要

高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术，或称胰岛素钳夹，是评估胰岛素作用的金标准 体内一种用于小鼠胰岛素钳夹实验的方法。该方法包括动脉插管技术，可使实验在清醒、无束缚的小鼠中进行，从而将应激反应降至最低。

摘要

2型糖尿病的特征是胰岛素作用缺陷。高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术，即胰岛素钳夹技术，被广泛认为是评估胰岛素作用的“金标准”方法。 体内在胰岛素钳夹实验中，通过持续输注胰岛素实现高胰岛素血症，同时通过可变速率的葡萄糖输注维持正常血糖水平。该可变葡萄糖输注速率（GIR）通过在实验过程中定期测定血糖水平并相应调整输注速率来确定。GIR可反映机体整体的胰岛素作用，胰岛素作用增强的小鼠需要更高的GIR。胰岛素钳夹实验可结合使用同位素2[14C]脱氧葡萄糖用于评估组织特异性葡萄糖摄取和[3-3使用[H]葡萄糖来评估胰岛素抑制内源性葡萄糖出现速率（endoRa，反映肝葡萄糖生成的指标）以及促进全身葡萄糖消失速率（Rd）的能力。

胰岛素钳夹技术的小型化使其可用于代谢性疾病的遗传性小鼠模型研究，从而推动了糖尿病研究的重要进展。不同实验室在实施胰岛素钳夹的方法上存在差异。值得注意的是，胰岛素钳夹的操作方式会显著影响所获得的实验结果。我们已发表了一项关于在清醒小鼠中实施胰岛素钳夹不同方法的全面评估1，以及利用多种钳夹技术对四种常用近交系小鼠代谢反应的评价2。本文介绍了一种由范德堡大学小鼠代谢表型分析中心（MMPC；网址：www.mc.vanderbilt.edu/mmpc）开发的、用于清醒且无束缚小鼠的胰岛素钳夹实验方案。该方案包括胰岛素钳夹过程中所用导管植入方法的详细描述。范德堡MMPC所采用的方案使用一种独特的双导管系统3。一根导管插入颈静脉用于药物输注；另一根导管插入颈动脉，以便在无需束缚或抓握小鼠的情况下进行采血。该技术相较于胰岛素钳夹中最常用的尾尖断端采血法具有显著优势。与后者相比，经动脉导管采血不会对小鼠造成应激1。我们还介绍了利用同位素示踪剂输注评估组织特异性胰岛素作用的方法，并提供了胰岛素钳夹实验结果报告的规范建议。

方案

1. 导管和小鼠采样接入天线（MASAtm）的制备

  1. 制备动脉导管：将一段长1.3 cm、内径为0.011英寸的PE-10管插入一段长6 cm、内径为0.012英寸的硅胶管中，如图1A所示。使用手术刀将PE-10管末端削成斜面，使硅胶管末端至斜面尖端的长度为0.9 cm。
  2. 制备静脉导管：将一段长1 mm、内径为0.020英寸的硅胶管套入一段长6 cm、内径为0.012英寸的硅胶管的斜面端，并使其距离斜面端1.1 cm，如图1B所示。该1 mm长的硅胶管用作限位珠。
  3. 制备MASAtm装置时，将两根长1.3 cm、25号规格的不锈钢连接管分别插入两根长3 cm、内径为0.015英寸的PE-20管中。
  4. 使用一段长5 mm、内径为0.040英寸的硅胶管套在不锈钢管与PE-20管的连接处，将PE-20管和不锈钢连接管固定在一起。
  5. 将不锈钢管弯曲成约120°角，并使两根管之间相隔约45°。
  6. 将组装完成的装置垂直放置于一团医用硅胶粘合剂中，确保PE-20管保持垂直，而不锈钢管的末端伸出粘合剂之外（图1C）。静置固化24小时。

2. 外科插管术

  1. 手术前，用70%乙醇对导管进行灭菌，用肝素化生理盐水（每毫升生理盐水含200 U肝素）填充导管，并插入不锈钢塞。
  2. 对小鼠实施麻醉，建议采用持续输送麻醉剂的方法（例如吸入式异氟烷）。
  3. 采用无菌操作技术，使用剪刀和/或脱毛膏去除切口部位的毛发，并先用酒精消毒皮肤，再用碘伏擦洗。在进行导管插入时，需去除从下颌至肋骨顶部以及锁骨之间的区域的毛发。若需将导管从头部后方引出，则需去除枕骨基底部至肩胛间区域的毛发，并先用酒精消毒皮肤，再用碘伏擦洗。
  4. 将小鼠仰卧于加热板上，并置于手术显微镜视野范围内。用手术胶带固定尾巴和四肢。将头部固定在输送麻醉气体的鼻罩中。
  5. 在胸骨上方约5 mm处做一垂直正中切口。使用镊子钝性分离组织，暴露左侧胸锁乳突肌。将该肌肉牵开以暴露左侧颈动脉。轻柔地剥离动脉周围的结缔组织。此时关键是要在不损伤动脉或神经的前提下，将迷走神经与动脉分离。
  6. 分离动脉后，用丝线结扎其头端；在暴露血管的尾端松松地打另一结。
  7. 在尾端使用微型止血夹夹闭血管，用弹簧剪在结扎端下方剪断血管。小心地将导管插入至止血夹处。轻轻松开微型止血夹，继续推进导管至硅胶-PE连接处。
  8. 将两根结扎线牢固地系在导管上，并通过将导管的自由端连接至取样注射器来确认导管通畅。
  9. 在正中线右侧约5 mm、第一切口尾侧约2 mm处做第二个切口。使用镊子钝性分离组织，暴露并分离右侧颈外静脉。
  10. 用丝线小心结扎其头端，并在尾端松松地系上另一根缝线。
  11. 用弹簧剪在头端结扎线下方剪断血管，将导管插入至限位珠处。在限位珠后方打结固定，并确认导管通畅。
  12. 将小鼠翻转为俯卧位，在肩胛骨之间做一小切口。
  13. 从腹侧动脉导管切口处开始，经皮下穿入14号针头，通向背部肩胛间切口。将动脉导管经针头引出至小鼠背部。对颈静脉导管重复此操作：从右侧腹侧切口开始，经皮下穿入14号针头，通向背部肩胛间切口，将颈静脉导管引出。
  14. 在肩胛间切口处用微型止血夹夹住动脉导管。在此夹上方约1 cm处剪断导管。将MASAtm装置放置到位，使其不锈钢连接头朝向小鼠头部方向。将动脉导管连接至指向小鼠左侧的不锈钢接头，注意确保导管无孔洞或折弯。对静脉导管重复相同操作，将其连接至指向小鼠右侧的不锈钢接头。
  15. 将MASAtm装置插入肩胛间的切口中。对应颈静脉导管的PE-20管应位于小鼠右侧，对应动脉导管的PE-20管应位于左侧。
  16. 用尼龙缝线缝合腹侧和背侧切口。在缝合背侧切口时，可将缝线穿过MASAtm的硬化硅胶部分以固定装置。使用含肝素化生理盐水和抗生素的冲洗液确认导管通畅，以降低感染风险。将小鼠置于温暖、洁净的笼中进行即刻恢复。图2展示了最终完成的装置。
  17. 让小鼠至少恢复5天，监测其体重和整体健康状况。根据机构动物护理与使用委员会批准的方案，实施适当的术后镇痛措施。

3. 高胰岛素-正常血糖钳夹技术

  1. 将小鼠禁食 5-6 小时。作为参考，时间 t = 0 分钟表示禁食结束，同时开始胰岛素和葡萄糖输注（即钳夹期）。
  2. 典型实验的设置与时间线如图 3所示。使用 Micro-Renathane 或同等材质的管路作为输注和采样管路。在小鼠上方悬挂一个双通道旋转连接器，作为小鼠与输注/采样注射器之间的连接枢纽。实验期间，小鼠保留在原有饲养笼或类似容器中，并通过导管与旋转连接器连接。
  3. 在连接小鼠之前，用肝素化生理盐水（10 U 肝素/mL 生理盐水）填充动脉采样管路，并在管路末端安装不锈钢连接器。将一支装有肝素化生理盐水的注射器（冲洗注射器）连接至采样管路顶端，用于后续吸取血液样本。
  4. 从旋转连接器的输注端口（图 3A 中的 A 段）开始，用非肝素化生理盐水填充静脉输注管路，直至管路末端。将管路顶端封闭，并在末端安装不锈钢连接器（若需给予推注剂量，则使用 Y 型连接器）。若需输注同位素标记的葡萄糖示踪剂（例如 [3-3H]葡萄糖），则将装有 1 mL 示踪剂的注射器固定在输注泵上，并用示踪剂替代生理盐水填充静脉输注管路（图 3B）。
  5. 禁食开始后 3 小时，称量小鼠体重，并将用于颈静脉和动脉插管的 PE-20 导管分别连接至输注和采样管路。
  6. 若使用 [3-3H]葡萄糖示踪剂，则在 t = -90 分钟开始进行预负荷-持续输注（图 3C）。典型的预负荷剂量为 1 μCi。用非肝素化生理盐水配制浓度为 0.05 μCi/μL 的 [3-3H]葡萄糖溶液。将该溶液装入 1 mL 注射器，并固定于输注泵中。以 20 μL/min 的速率输注 1 分钟完成预负荷剂量，随后以 0.05 μCi/min（1 μL/min）的速率持续输注 90 分钟，以达到平衡状态。
  7. 准备胰岛素和葡萄糖输注液。胰岛素用含 3% 血浆作为载体的非肝素化生理盐水配制（也可使用适当浓度的 BSA 作为替代）。葡萄糖输注液可从商业途径获得，具有多种浓度（5%、20% 和 50%）。
  8. 通过从供体小鼠（最好与实验小鼠为相同品系背景）采集全血，制备经生理盐水洗涤的红细胞输注液。通常每只实验小鼠需要约 1 mL 全血。离心分离红细胞，用含 10 U/mL 肝素的生理盐水洗涤红细胞，再次离心以去除生理盐水。测定红细胞体积，并用等体积的含 10 U/mL 肝素的生理盐水重悬。
  9. 将每种输注液分别吸入 1 mL 注射器中，并将各注射器固定于独立的输注泵上。将每支注射器连接至一个四通连接器（图 3）。
  10. 在 t = -15 分钟时，缓慢吸取 50–100 μL 血液至冲洗注射器中以采集血样。夹闭动脉采样管路，取下冲洗注射器。使用手持式血糖仪，打开动脉采样管路的夹子，使血液流入血糖试纸，测定血糖值。
  11. 完成血糖测定后，夹闭动脉采样管路，将一支钝针注射器（采样注射器）插入动脉采样管路。松开夹子，吸取一定体积的血液（见注释），然后夹闭管路并取下采样注射器。将冲洗注射器重新插入动脉采样管路，拉动活塞以排除任何气泡，并将最初采集的 50–100 μL 血液重新输回体内。

注意：采血量取决于所进行的分析类型。例如，测定[3-3H]葡萄糖浓度需要10 μl血浆，因此需采集50 μl血液。这样可获得20–30 μl血浆，足以满足分析需求，并可留有额外血浆以备所需。若需检测激素及其他代谢物（如胰岛素、游离脂肪酸），则需额外采集血液。

  1. 将采样注射器中的血液加入EDTA包被的微量离心管中。离心后收集血浆。在研究结束前将血浆置于冰上，或立即于-20°C.
  2. 在 t = -5 min 时重复步骤 3.10 至 3.12。采集额外血液50 μl用于测量基础血浆胰岛素水平。通过将血液吸入经肝素或EDTA处理的毛细管中，测定基础血细胞比容。t = -15 和 -5 min 时采集血浆样本所得测量值代表基础状态（即空腹）值。
  3. 在 t = -5 min 时采集样本后，将葡萄糖、胰岛素以及生理盐水洗涤的红细胞的输注管路填充至四通连接器。将四通连接器连接至与旋转输注端口相连的管路（若输注 [3-3H]葡萄糖）如图所示 图3.
  4. 首先开始输注经生理盐水洗涤的红细胞。设定输注速率，以替代研究期间采血的总体积（例如，若总共 500 μl 在研究的120分钟内采集血液样本，将输注速率设定为 4.2 μl/min）。与其他灌注液不同，红细胞溶液呈红色。先输注该溶液可识别并纠正输注管路中可能存在的阻力或阻塞。
  5. 当红细胞悬液到达小鼠体内后，开始胰岛素和葡萄糖输注。此时定义为 t = 0 min。胰岛素以预先设定的恒定速率输注。胰岛素输注速率为 4 mU•kg⁻¹•min⁻¹。在输注开始后的第 10、20 和 30 分钟采集血液样本，用于测定血糖浓度。此后，每 30 分钟采血一次，持续 120 分钟。当血糖浓度稳定至少 30 分钟时，即可认为达到了稳态。在稳态期间采集额外的血液样本，用于精确测定血糖和胰岛素浓度。实验结束后，处死动物并收集组织样本用于后续分析。-1•分钟-1 通常会抑制内源性葡萄糖生成80-100%，并使葡萄糖消除率增加2-3倍。初始葡萄糖输注速率（GIR）根据基础血糖水平及既往经验进行估算。
  6. 如果输注 [3-3[H]葡萄糖示踪剂，可选择提高示踪剂输注速率，以匹配估计的葡萄糖转化率增加（通常为2-3倍）。
  7. 考虑到小鼠体内葡萄糖转换速率较高，应在实验全程中通过动脉导管获取血样，且采样间隔不得超过10分钟，以监测葡萄糖浓度。调整葡萄糖输注速率（GIR），以达到并维持目标的正常血糖水平（图3C）。该目标值可根据模型或研究目的而变化。一个理想的血糖浓度目标为 150 mg•dL-1，因为这是饲喂普通饲料的 C57Bl/6J 小鼠在禁食 6 小时后的典型血糖水平。
  8. 目标是尽快实现血糖正常，理想情况下在前40-50分钟内达到，并在稳态期开始时（t = 80 min）使葡萄糖水平和葡萄糖输注速率（GIR）保持稳定。
  9. 如果输注 [3-3H]葡萄糖，在 t = 80、90、100、110 和 120 分钟时额外采集血液，用于测定血浆 [3-3H]葡萄糖特异性活性
  10. 在 t = 100 和 120 分钟时采集额外血样，用于测定血浆胰岛素及其他激素或代谢物。在 t = 110 分钟时，将血液采集至经肝素或EDTA处理的毛细管中，用于测定钳夹期间的血细胞比容。
  11. 在 t = 120 min 时取样后，2[14C]脱氧葡萄糖可用于测定组织特异性葡萄糖摄取。给予 12 μCi 通过连接至颈静脉采样管路的团注管路注入团注液图3B).
  12. 采集血样（50 μl) 于团注后 t = 2、15、25 和 35 分钟从动脉采样管采集血样，用于测定血浆中 2[14C]脱氧葡萄糖水平。
  13. 在最后一次采样后，通过动脉导管直接输注戊巴比妥麻醉小鼠。迅速解剖获取用于评估葡萄糖摄取所需的组织（如不同类型的骨骼肌、脂肪组织、心脏、脑）及其他任何所需组织（如肝脏、脾脏、肾脏）。将组织在液氮中速冻，并储存于-80 °C直至分析。80°C 直至分析前保存。通过测定磷酸化2[的累积量来分析组织葡萄糖14C]脱氧葡萄糖在冷冻组织中的分布及其2[14C]脱氧葡萄糖从血浆中

4. 典型结果

胰岛素钳夹实验所获结果的一个示例如下所示 图4。本示例展示了高脂饮食在小鼠中诱发胰岛素抵抗的能力。所有胰岛素钳夹实验结果的呈现必须包含以下内容方可被准确解读：血糖水平的时间过程曲线、葡萄糖输注率（GIR）的时间过程曲线以及血浆胰岛素水平（包括基础状态和钳夹状态）。如图所示，空腹血糖（图 4A）和胰岛素（图 4C)水平在喂食高脂饮食的小鼠中升高，提示存在胰岛素抵抗。展示在整个钳夹实验过程中葡萄糖水平的时间过程（图 4A) 可使读者评估血糖稳态维持的程度，这反映了钳夹实验的质量。同样，葡萄糖输注速率（GIR）的时间过程图 4B）可使读者判断稳态达到的速度。将这些数据以时间过程的形式呈现，远比小鼠胰岛素钳夹文献中常见的做法——即将2小时的实验表示为一个代表某段未明确界定的“钳夹期”平均值的单一数据点——更具信息量。4-13）。在本示例中，对照组与高脂饮食组的葡萄糖水平相等，但高脂饮食组的葡萄糖输注率（GIR）显著降低（图4B)。这表明整体胰岛素作用受损。高脂饮食组的钳夹胰岛素水平也较高（图4C），进一步支持这些小鼠存在胰岛素抵抗表型。使用同位素示踪剂输注可实现对特定组织中胰岛素作用的评估。[3-3[³H]葡萄糖用于估算内源性葡萄糖出现率（endoRa），该指标反映肝葡萄糖生成（HGP）以及全身葡萄糖消失率（Rd）。在对照组小鼠中，胰岛素可完全抑制HGP，而在高脂饮食喂养的小鼠中，这种抑制作用则受损。图 4D）。类似地，胰岛素刺激对照组小鼠 Rd 的能力在饲喂高脂饮食的小鼠中受到损害（图4E). 2[14C]脱氧葡萄糖用于评估葡萄糖代谢指数（Rg），即组织特异性葡萄糖摄取的测量指标。如本示例所示，高脂饮食喂养的小鼠骨骼肌中胰岛素刺激的葡萄糖摄取能力受损图4F).

显示硅胶管和PE管配置、尺寸及角度的导管组件示意图
图 1： 动脉（A）和（B）静脉导管以及（C）MASAtm 的制备。动脉导管的制备方法是将一段长1.3 cm的PE-10管以约3 mm的深度插入一段长6 cm、内径为0.012"的硅胶管中。PE-10管的尖端需斜面处理，使从斜面到硅胶管端部的长度为0.9 cm。静脉导管的制备是将一小段内径为0.020"的硅胶管从一段长6 cm、内径为0.012"的硅胶管的斜面端向内滑动1.1 cm。该内径为0.020"的硅胶管段作为限位珠，用于将导管固定于颈静脉。MASAtm 的组装方法是将两个1.3 cm长的25号规格连接头分别插入两段长3 cm的PE-20管中，并用一小段内径为0.040"的硅胶管将它们固定在一起。连接头弯曲成120°角，并以45°角分开。整个组件浸入医用硅胶粘合剂中。

小鼠插管示意图；侧面/顶面视图；不锈钢管/PE-20；动脉/静脉系统。
图 2： 已插管的小鼠。导管通过手术植入左侧颈动脉和右侧颈外静脉。导管的自由端从头部后方引出体外，并连接至 MASAtm。MASAtm 被植入肩胛骨之间的皮下组织，从而可在进行胰岛素钳夹实验时实现血管通路，而无需对小鼠进行束缚、抓握或麻醉。

胰岛素钳夹实验示意图，显示葡萄糖、胰岛素、红细胞输注泵及数据图表。
图3：胰岛素钳夹实验装置与时间线示意图。小鼠通过双通道旋转连接器固定，该连接器作为输注和采样注射器的枢纽。图中展示了不使用示踪剂输注（A）和同时使用[3-3H]葡萄糖与2[14C]脱氧葡萄糖（B）的典型实验设置。还展示了胰岛素钳夹实验的建立与操作流程时间线（C）。在钳夹过程中，每10分钟采集一次血样（色谱法；红色染料分离；示意图；化学分析技术；色谱系统。），用于测定血糖浓度，并相应调整葡萄糖输注速率（GIR），以维持血糖正常水平。在 t = -15 和 -5 分钟时采集基础血糖、血浆胰岛素及血浆[3-3H]葡萄糖样本。在 t = 80、90、100、110 和 120 分钟时采集钳夹期间的血浆[3-3H]葡萄糖样本，在 t = 100 和 120 分钟时采集钳夹期间的血浆胰岛素样本。在 t = 120 分钟采样后给予2[14C]脱氧葡萄糖，并在给药后 t = 2、15、25 和 35 分钟采集血液。组织样本在 t = 35 分钟采血后采集。

稳态平衡、葡萄糖-胰岛素钳夹实验结果；葡萄糖、胰岛素、Rd、Rg分析图表。
图 4： 比较正常饮食（Chow）小鼠与高脂饮食（HFD）小鼠的胰岛素钳夹实验结果。显示动脉血糖（A）和葡萄糖输注速率（GIR）（B）、基础及钳夹状态下胰岛素水平（C）、内源性葡萄糖生成率（EndoRa）（D）、全身葡萄糖摄取率（Rd）（E），以及骨骼肌（腓肠肌和股外侧肌）葡萄糖摄取率（Rg）（F）的时间过程。所有结果均表明高脂饮食可诱导胰岛素抵抗。

讨论

高胰岛素-正常血糖钳夹技术，或称胰岛素钳夹，被广泛视为评估胰岛素作用的“金标准”方法 体内该技术已应用于包括人类、犬、大鼠和小鼠在内的多个物种。鉴于代谢紊乱的转基因小鼠模型数量日益增加，将该技术微型化并应用于小鼠，为代谢研究带来了重要进展。

尽管胰岛素钳夹技术的原理很简单，但在实际操作中，进行胰岛素钳夹实验的方法存在多种不同方式。这一点并非无关紧要，因为实验操作方式会直接影响所获得的结果1。本文介绍了范德堡分子医学病理中心（Vanderbilt MMPC）所采用的实验方案。本方案与其他方案的关键区别在于，我们使用动脉导管采集血液样本。这与更常见的通过切断小鼠尾尖取血的方法形成对比4, 7, 11, 12, 14-17。使用动脉导管采样的优势在于，实验可在清醒且无束缚的小鼠身上进行。而尾部采血通常需要对小鼠进行固定，尤其在采集较大量的血液时，会显著增加应激反应指标1。应激激素会刺激内源性葡萄糖生成并抑制葡萄糖清除18, 19，可能导致出现类似胰岛素抵抗表型的假象。由于尾部切断采血具有较强的应激性，该方法可能需要特别的机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）批准。动脉插管技术的开发正是为了规避切断尾部给小鼠带来的应激。

进行胰岛素钳夹实验的一个关键方面是维持血糖正常的能力。目前尚无任何算法能够根据血糖读数准确预测葡萄糖输注速率（GIR）应如何调整。与手术操作类似，只有通过实践经验，操作胰岛素钳夹实验的人员才能熟练地维持合理的血糖稳态。需要注意的是，由于小鼠的基础代谢率较高，从小鼠实验中获得的数据本身可能存在较大波动。因此，完整地呈现数据至关重要，包括葡萄糖水平和葡萄糖输注速率的时间进程，以及血浆胰岛素、内源性葡萄糖生成率（endoRa）、葡萄糖消除率（Rd）和葡萄糖利用率（Rg）的绝对值，这些信息对于读者正确解读实验结果必不可少。小鼠体内较高的葡萄糖转换速率（约为人类的5倍）要求进行高频的葡萄糖采样。尽管小鼠的血容量有限，但至少每10分钟采样一次是必要的，以确保成功建立稳定的钳夹状态。

如图4所示，不同组之间的钳夹胰岛素水平可能存在差异。饮食干预、转基因操作或背景品系的差异等因素均可影响空腹胰岛素水平，进而影响钳夹过程中的胰岛素水平。当钳夹胰岛素水平不同时，结果的解读可能存在问题。这一问题可通过预实验加以解决，即选择合适的胰岛素输注速率，使各组之间的钳夹胰岛素水平达到一致。另一种方法是使用生长抑素抑制胰腺激素的分泌，并以实验可控的速率外源性补充胰岛素和胰高血糖素。后一种方法在大鼠的胰岛素钳夹实验中较常见，而在小鼠中较少使用。如果未采用上述实验方法，则可将稳态葡萄糖输注速率（GIR）标准化为钳夹胰岛素水平，或根据钳夹数据计算胰岛素敏感性指数（SI），公式为 SI=GIR/(G•ΔI)，其中G为稳态血糖浓度，ΔI为空腹与钳夹胰岛素浓度之差。无论采用哪种方法，其前提假设均为所达到的钳夹胰岛素水平处于胰岛素敏感性与胰岛素浓度呈线性关系的范围内，而该假设在比较胰岛素抵抗组与胰岛素敏感组时可能不成立。理想情况下，应通过建立胰岛素剂量-反应曲线来选择合适的胰岛素输注剂量。然而，由于需要额外的实验，这种方法在实际中很少被采用。

动脉插管技术的多功能性使其可应用于除正常血糖钳夹以外的多种实验方法。例如，高血糖钳夹通过以可变速率输注葡萄糖，使血糖水平相对于空腹血糖维持在较高状态，可用于评估胰腺的内源性功能 体内2, 20, 21在该检测过程中测量第一时相胰岛素分泌需要频繁采集血样（例如每2-5分钟一次），而从尾尖采样难以实现这一频率。此外，尾部采样引起的去甲肾上腺素水平升高可能抑制胰岛素分泌并增强胰高血糖素分泌。22胰岛素钳夹方案还可进行调整，使血糖水平降至相对低血糖状态，以评估机体的反向调节反应。2, 23, 24动脉插管也可用于评估运动期间葡萄糖代谢的动力学变化25-30这显著优于在运动前后单一时点进行或在分离肌肉中开展的传统方法。 离体本文介绍的技术还可用于评估脂肪酸代谢，而不仅仅是葡萄糖代谢。31.

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作由范德堡小鼠代谢表型中心资助，资助编号为 5-U24-DK059637-10。

参考文献

  1. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  2. Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains. Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).
  3. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).
  4. Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo. Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).
  5. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).
  6. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).
  7. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance. J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).
  8. Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).
  9. Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle. J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).
  10. Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance. Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).
  11. Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).
  12. Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle. J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).
  13. Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4. J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).
  14. Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies. Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).
  15. Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance. Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).
  16. Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels. Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).
  17. Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis. Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).
  18. Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. Epinephrine-induced insulin resistance in man. J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).
  19. Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man. J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).
  20. Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).
  21. Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo. Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).
  22. Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction. Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).
  23. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).
  24. Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).
  25. Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action. Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).
  26. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice. Diabetes. 53, 306-314 (2004).
  27. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).
  28. Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).
  29. Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse. J. Biol. Chem. , (2004).
  30. Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter. J. Physiol. 582, 801-812 (2007).
  31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

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清醒非束缚小鼠的高胰岛素-正常血糖钳夹实验
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