Hsp104蛋白解聚酶的纯化

摘要

本文介绍一种纯化高活性Hsp104的方案，Hsp104是一种来自酵母的六聚体AAA+蛋白，可将ATP水解与蛋白质去聚集功能相偶联。该方案利用带有His6标签的重组蛋白，从大肠杆菌（E. coli）中进行亲和层析纯化，随后依次进行阴离子交换层析、TEV蛋白酶切除His6标签以及尺寸排阻层析。

摘要

Hsp104 是一种来自酵母的六聚体 AAA+ 蛋白¹，可通过水解 ATP 驱动蛋白质去聚集^2-10（图 1）。该活性赋予酵母两种关键的选择优势。首先，Hsp104 对无序聚集体的重折叠能力使其在多种蛋白质错误折叠应激（包括热休克）后仍能存活^3,5,11,12。其次，Hsp104 对交叉β淀粉样纤维的重塑能力使酵母能够利用多种朊病毒（传染性淀粉样蛋白）作为有益且可遗传的表型变异的储备库^13-22。值得注意的是，Hsp104 可直接重塑前淀粉样寡聚体和淀粉样纤维，包括由酵母朊病毒蛋白 Sup35 和 Ure2 组成的纤维^23-30。这种淀粉样蛋白重塑功能是酵母 Hsp104 的特有功能。E. coli 的同源蛋白 ClpB 无法重塑前淀粉样寡聚体或淀粉样纤维^26,31,32。

除动物外，Hsp104 的直系同源物存在于所有生命界中，这一点令人费解。事实上，目前尚不清楚动物细胞是否拥有任何将蛋白质去聚集与复性（而非降解）相偶联的酶系统^33-35。因此，我们及其他研究者提出，Hsp104 或可被开发为治疗多种神经退行性疾病的治疗剂，这些疾病与特定蛋白质错误折叠形成毒性前淀粉样寡聚体及淀粉样纤维密切相关^4,7,23,36-38。目前尚无直接靶向这些疾病相关聚集物的治疗方法。然而，Hsp104 能够溶解由α-突触核蛋白（alpha-synuclein）组成的毒性寡聚体和淀粉样纤维，而这些聚集物与帕金森病相关²³，同时也可溶解朊病毒蛋白（PrP）的淀粉样形式³⁹。重要的是，Hsp104 在帕金森病²³和亨廷顿病³⁸的啮齿类动物模型中可减少蛋白质聚集并改善神经退行性病变。理想情况下，为优化治疗效果并最小化副作用，可对 Hsp104 进行工程化改造并增强其活性，以选择性地重塑特定疾病中起核心作用的聚集物^4,7。然而，目前对 Hsp104 如何去聚集如此多样化的聚集结构及不相关蛋白质的结构与机制理解仍有限，这阻碍了上述努力^30,40-42。

为了理解Hsp104的结构与作用机制，有必要对纯化的蛋白进行研究，并以最少的组分重建其解聚酶活性。Hsp104是一种分子量为102 kDa、等电点约为5.3的蛋白质，在ADP或ATP存在下，或在无核苷酸条件下高蛋白浓度时，可形成六聚体。^43-46. 此处，我们描述了一种优化的纯化方案，用于获得高活性、高稳定性的 Hsp104 E. coli. 的使用 E. coli 可实现简化的规模化生产，且该方法可快速、可靠地用于大量 Hsp104 变体。我们的方案提高了 Hsp104 的纯度，并简化了 His₆与之前的一种纯化方法相比的标签去除 E. coli⁴⁷此外，我们的方案比另外两种较新的方案更为简便和便捷^26,48.

方案

1. Hsp104 的表达

1. 用于纯化的质粒 E. coli，pPROEX-HTb-Hsp104，包含在可诱导启动子控制下的Hsp104开放阅读框 trc 启动子²⁶质粒表达带有N端His标签的Hsp104₆-tag，可通过TEV蛋白酶切割去除。将pPROEX-HTb-Hsp104转化至密码子优化的 E. coli BL21-CodonPlus-RIL 细胞（Stratagene，Agilent Technologies），采用常规的细菌转化方法（例如按照制造商说明书操作）。重要的是使用一种密码子优化的 E. coli 由于Hsp104具有异常的密码子偏好性，因此该菌株存在这一特性。
2. 接种100 mL添加有 100μg/mL 氨苄青霉素和 34μg/mL 氯霉素与新鲜转化子共同培养，37°C过夜培养 37°C 以200 rpm振荡培养。
3. 将10 mL过夜培养物接种至6 X 1 L 2XYT培养基中 100μg/mL 氨苄青霉素和 34μg/mL 2L 锥形瓶中加入氯霉素，250 rpm 振荡培养 37°C 直到OD₆₀₀ = 0.4–0.6。停止振荡，将温度降低至 15°C. 将细胞置于培养箱中静置孵育30分钟，使其充分平衡，直至达到 15°C。一旦 15°C 当达到所需条件时，通过加入IPTG至终浓度1 mM来诱导蛋白表达。于250 rp....

讨论

时间线： 为获得最大 Hsp104 活性，建议尽可能快速完成整个纯化流程。然而，由于纯化步骤较多，所需时间安排较为紧张，可能并不总是具备可操作性。若尽可能快速地进行各步骤，从过夜表达结束到在 30°C 下与 TEV 蛋白酶孵育 2–4 小时为止，总耗时约为 9–11 小时。一个可行的暂停点是在 TEV 切割步骤之后。如有绝对必要，可按照上述方法（步骤 5.2）在此步骤后将 Hsp104 迅速冷冻。随后在解冻后立即进行尺寸排阻色谱（步骤 3.9），且纯化后的 Hsp104 必须立即用于生化检测。此外，诱导步骤也可简化为在 37°C 下进行 2 小时，尽管这会降低总体产量。

可能的并发症： 该纯化方案是直接的。然而，以下讨论了一些关键步骤和替代方案。

替代性细胞裂解：若无法国压菌器（French Press），可采用溶菌酶处理结合超声破碎的方法进行有效细胞裂解。将裂解缓冲液重悬的细胞与溶菌酶（Sigma，鸡蛋清来源）在冰上孵育30分钟，每1 L细胞沉淀加入20 mg溶菌酶，使终浓度达到2 mg/mL。随后使用M.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BL21-CodonPlus-RIL 感受态细胞	Stratagene, Agilent Technologies	230255
2XYT 肉汤	USB Corp., Affymetrix	75864
Complete, mini, 无 EDTA 蛋白酶抑制剂片剂	Roche Group	1836170
胃蛋白酶抑制剂 A	Sigma-Aldrich	P4265
Ni-Sepharose 6 快流介质	GE Healthcare	17-5318-02
Amicon Ultra-15 离心滤过装置（截留分子量 30,000）	EMD Millipore	UFC903008
Resource Q - 6 ml 柱	GE Healthcare	17-1179-01
proTEV 蛋白酶	Promega Corp.	V6052
AcTEV 蛋白酶	Invitrogen	12575015
Superose 6 10/300 GL 柱	GE Healthcare	17-5172-01
Hsp40	Assay Designs	SPP-400
Hsp72	Assay Designs	ADI-NSP-555