尾蚴转化与 体外 培养 曼氏血吸虫 童虫

摘要

我们描述了一种体外培养扁形寄生虫曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）幼虫（schistosomula）的方法，该方法通过从淡水螺类中间宿主光滑双脐螺（Biomphalaria glabrata）中收集并转化具有感染性的尾蚴来实现。

摘要

血吸虫寄生虫是血吸虫病的病原体，该病是一种慢性消耗性疾病，全球感染人数超过2亿，在公共卫生和经济社会影响方面仅次于疟疾，居寄生虫病第二位（1-4）。血吸虫属于吸虫类蠕虫，其生活史复杂，需在软体动物和哺乳动物宿主之间交替寄生，并经历若干自由游动的发育阶段。简言之，自由游动的尾蚴借助分泌的蛋白酶穿透哺乳动物宿主的皮肤而实现感染；在此过程中，尾蚴脱去尾部，转变为童虫。童虫必须逃避宿主免疫系统的攻击，发育出可消化红细胞的肠道，并经肺部和门脉循环迁移，最终抵达肝门静脉系统，以及肠系膜静脉（对于 S. mansoni）在此处雌雄成虫配对交配，每天产下数百个虫卵。部分虫卵随宿主排泄物排出体外进入淡水，在水中孵化出自由游动的毛蚴（5-10）。毛蚴感染特定种类的螺类，相继发育为母胞蚴和子胞蚴，进而产生具有感染性的尾蚴，从而完成生活史循环。遗憾的是，目前尚无法在体外培养曼氏血吸虫的完整生活史 体外，但感染性尾蚴可转化为童虫，且童虫可培养数周，用于分析血吸虫的发育过程 体外 或微阵列分析。在本方案中，我们提供了尾蚴转化过程的可视化描述及 体外 培养童虫。我们从螺类宿主Biomphalaria glabrata中逸出具有感染性的尾蚴，并使用双端乳化针手工剥离其尾部，从而将其人工转化为童虫。 体外 避免使用哺乳动物宿主的尾蚴转化和童虫培养技术，简化了血吸虫的观察，并便于收集寄生虫用于实验分析。 体外 血吸虫的转化与培养技术已应用多年（11, 12），但迄今尚未建立可供整个科研社区使用的可视化实验方案。

方案

安全措施：

血吸虫尾蚴可直接穿透皮肤，无需借助伤口或毛孔，从而引起慢性疾病血吸病。S. mansoni 属生物安全二级生物体，因此在操作感染性尾蚴时，必须遵循适当的个人防护装备要求和安全措施。培养和转化血吸虫所需的大部分设备均为常规设备，少数关键例外情况已在本方案末尾的表格中注明。所有尾蚴操作应在独立的房间内进行。转化后的童虫（schistosomules）应在无菌且经批准的生物安全柜中培养。操作时应佩戴两层丁腈或乳胶手套，同时穿戴实验服、防水鞋、无破损或孔洞的长裤，以及覆盖手腕和前臂的防水袖套。若发生意外溢出，应立即用70%乙醇或10%次氯酸钠溶液喷洒污染区域，若污染到身体表面，应用力擦拭。此处理足以灭活寄生虫，但任何可能的感染均应上报并严肃对待。尽管童虫本身不具有天然感染性，但各机构的指导方针有所不同，应咨询相关规定以确定在非感染性生活阶段是否仍需采取生物安全二级（BSL2）防护措施。实验结束后，应对所有接触过潜在感染性物质的表面进行消毒，并将废弃物丢弃至经批准的生物危害容器中。

注意：在排泄前1至2天用盖子遮住螺类宿主容器，并避免光照

1. 从螺类宿主中收集尾蚴

1. 取一个洁净、无洗涤剂残留的 500 mL 烧杯，加入约半杯已平衡至室温的蒸馏水。若处理在不同日期感染尾蚴的宿主螺类，请为每个感染日期使用单独的烧杯（如果螺类将被重复用于后续实验，则此步骤尤为重要）。烧杯的尺寸也可根据操作者的经验适当减小。
2. 收集需要释放尾蚴的感染宿主螺类，必要时使用标准水族鱼网和通用镊子小心地将其放入烧杯中。
3. 将烧杯置于白炽光源下方约 8 至 12 英寸处的应急防溢托盘上。在光照下静置 1–2 小时。尾蚴在暴露于强光时会从螺类宿主体内逸出。
4. 小心地将螺类从尾蚴混合液中过滤除去。需采取额外的安全防护措施，因为该混合液具有高度传染性。请注意，尾蚴可直接穿透人类皮肤！
5. 将混合液重新置于光源下约 15 分钟，使任何颗粒状废物沉淀到底部。
6. 使用移液管将尾蚴转移至洁净的锥形烧瓶中，避免吸入烧杯底部的残渣。将烧瓶置于冰上并倾斜约 45° 角，在避光条件下静置 45–60 分钟，使尾蚴聚集于烧瓶的一角。
7. 使用 50 mL 移液管移除上清液的 75% 至 90%，并将其注入含有 10% 次氯酸钠或 70% 乙醇的烧杯中，注意防止含有尾蚴的液滴从移液管滴落。
8. 轻轻旋摇含有尾蚴的锥形烧瓶，使尾蚴重新悬浮于溶液中。使用移液管将样品转移至无菌的 50 mL 圆底离心管中。再次将离心管置于冰上，在避光条件下静置 20 分钟。尾蚴将在避光条件下沉降至管底。

2. 尾蚴人工转化为童虫

开始前：配制 RPMI 1640 完全培养基（RPMI、5% 胎牛血清、1× 青霉素/链霉素），并预热至 37°C。（必须使用经 56°C 孵育 1 小时灭活的胎牛血清，因为血吸虫对补体敏感）。

1. 在生物安全柜中，使用移液器或真空装置将每个 50 ml 离心管中的上清液移除，保留 5 至 10 ml 溶液。
2. 将一个 22 号双头鲁尔锁扣乳化针连接至适当尺寸的注射器上。
3. 缓慢将混合液吸入注射器中。用同一注射器收集所有 50 ml 管中的尾蚴。注意防止滴漏。
4. 小心将注射器翻转，使未连接的一端朝上。将另一个注射器连接至乳化针的这一端。
5. 使混合液在针头中往复通过共 40 次（来回各 20 次），以转化尾蚴为童虫。
6. 将两个注射器垂直放置，使混合液保留在下方注射器中，上方注射器为空。取下上方注射器，并用 70% 乙醇消毒。
7. 将混合液逐滴加入洁净的高壁 100 mm × 50 mm 玻璃培养皿或结晶皿中。用 70% 乙醇对针头和注射器进行消毒。
8. 加入 37°C 预温的 RPMI 1640 完全培养基，使培养皿底部完全覆盖，如同倾注 LB 琼脂平板。
9. 轻轻旋转培养皿，使童虫聚集于中央。避免溅出。
   注意：此步骤中关闭生物安全柜的照明灯可能有助于更清晰地观察中央区域的童虫。
10. 立即使用无菌滴管将浓缩的童虫转移至新的 12 孔细胞培养板中的一个孔中。
11. 重复步骤 2.9 和 2.10，直至培养皿中央不再可见童虫（约重复 10 次）。每次收集均置于新的孔中。
12. 向每个孔中加入预温的完全 RPMI 培养基至半满（约 1.5 mL）。
13. 在倒置显微镜下观察，确认童虫存在且无尾蚴残留。
14. 将童虫置于设定为 37°C 和 5% CO₂ 的 CO₂ 培养箱中培养。

3. 典型结果：

在将转化后的童虫转移至培养基之前，应在倒置明场显微镜下进行观察（参见设备表中的示例），所得图像应与图1相似，即孔中仅含有已转化的童虫。可能存在的污染物包括完整的尾蚴、断裂的尾部或其他碎片。若无倒置显微镜，使用普通显微镜或解剖显微镜亦足以观察童虫。需要注意的是，该方法并非总能实现尾蚴100%转化。

图1： 转化的血吸虫童虫

图 2： 尾蚴与脱落的尾部

讨论

转化过程中可能会出现若干潜在问题；然而，本方案旨在避免其中大多数问题。一个潜在风险是乳化针头堵塞，这通常是由于步骤1.3中收获时残留的碎片所致。务必在步骤1.5中让所有颗粒物质充分沉降，并在步骤1.6中小心转移尾蚴，以避免此问题。此外，如前所述，应在生物安全柜内操作，使用个人防护装备（甚至面罩），并避免对注射器施加过大的压力。

培养基中可见脱离的尾蚴尾部，这表明在步骤2.9中分离效果不佳。这些尾部呈现痉挛样运动，并具有明显的形态特征（见图2），因此很容易与童虫区分开来。通过使用过量的完全RPMI培养基洗涤童虫，使童虫沉降，即可去除尾部。尾部将保持漂浮状态，可用真空法吸除。

如果培养基中存在完整的尾蚴，说明步骤 2.5 中的转化操作未正确执行。图 3b 展示了完整尾蚴的示意图，可供参考。若出现此问题，请确保所使用的乳化针头尺寸合适。此外，可增加尾蚴混合液通过针头的次数，尽管通常经过 40 次穿刺已远超过实现近 100% 尾部剪切所需的次数。

尾蚴转化为血吸虫童虫最早由 Colley 和 Wikel 于 1974 年描述（13）。此后，血吸虫童虫的制备通常采用本方案中所述的针头和注射器剪切法，或采用涡旋法结合 Percoll 梯度分离（14, 15），或如本文所示的旋转法。Fred Lewis 对这两种制备血吸虫童虫的技术进行了详尽的描述（16），有关血吸虫童虫长期培养的更多信息可参见美国国家过敏与传染病研究所血吸虫资源中心（www.schisto-resource.org）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
22g x 2-7/8" 乳化针	费舍科学公司	14-825-17G
RPMI 1640 培养基 1X (500ml)	英维特罗根公司	11835030
胎牛血清 (FBS)，热灭活	英维特罗根公司	10082139
青霉素/链霉素 (100X)	英维特罗根公司	15070063
结晶皿 (100mm)	费舍科学公司	08-741D
通用镊子	费舍科学公司	10-316C
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