本文介绍了一种从人类毛囊中分离和培养神经嵴干细胞的可靠方案。
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摘要
摘要
毛囊经历终生生长，毛发周期是一个由干细胞增殖与静息精确调控的过程。毛囊隆突是成体干细胞特征明确的微环境。1外根鞘的这一区段含有多种不同类型的干细胞，包括表皮干细胞2，黑色素细胞干细胞3 以及类似神经嵴的干细胞4-7毛囊是获取多种人类干细胞的便捷且丰富的来源。我们及其他研究者已从人类胎儿和成体毛囊中分离出神经嵴干细胞（NCSCs）。4,5这些人类干细胞是标记保留细胞，能够通过不对称细胞分裂进行自我更新 体外表达未成熟神经嵴细胞标志物，但不表达分化标志物。我们的表达谱分析研究表明，它们与小鼠皮肤未成熟神经嵴细胞具有相似的基因表达模式。它们具有克隆多能性，可分化为肌源性、黑色素细胞和神经元细胞系 体外 单克隆单细胞培养。分化后的细胞不仅获得谱系特异性标志物，还表现出相应的功能 离体 条件下。此外，这些神经嵴干细胞（NCSCs）具有向间充质谱系分化的潜能。分化得到的神经元细胞可在小鼠脑内长期存活，并维持神经元分化标志物的表达。已有研究表明，毛囊来源的NCSCs可促进神经再生，在脊髓横断损伤后移植这些干细胞可改善小鼠的运动功能。8此外，外周神经已通过干细胞移植进行修复9，并在坐骨神经受压部位附近植入皮肤来源的前体细胞已实现再髓鞘化10因此，毛囊/皮肤来源的神经嵴干细胞在临床前模型中已展现出用于再生治疗的良好前景。
体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）在再生医学领域展现出巨大潜力。然而，iPS细胞仍存在诸多问题，尤其是原癌基因/病毒整合的长期影响以及多能干细胞潜在的致瘤性尚未得到充分解决。在iPS细胞能够应用于再生医学之前，仍需克服许多障碍。相比之下，成体干细胞已被证实具有良好的安全性，并已在临床上应用多年，例如骨髓移植，已有众多患者从中获益。自体成体干细胞仍是移植治疗的首选细胞类型。因此，人体皮肤/毛囊中易于获取且可扩增的成体干细胞是再生医学的重要细胞来源。
方案
1. 组织培养板的准备
- 用足量的多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine, PDL）包被每个孔，确保覆盖孔底。将培养板置于超净台中晾干。
- 待孔内完全干燥后，用无菌水冲洗并吸除液体，再次将培养板置于超净台中晾干。
- 干燥后，加入纤连蛋白（fibronectin）进行包被（该溶液为纤连蛋白在Biowhittaker水中于37 °C过夜溶解，浓度为6 ml溶液中含1 mg纤连蛋白）。
- 在纤连蛋白干燥前，向孔中加入NCSC培养基[95 ml DMEM/F12、1 ml 青霉素/链霉素（P/S）、1 ml N2、2 ml B27、100 μl 巯基乙醇（2ME；50 mM 储液）、bFGF（20 ng/ml 培养基）、IGF-1（20 ng/ml 培养基）和 EGF（20 ng/ml 培养基）]。
2. 从人头皮中提取毛囊细胞
- 在开始分离神经嵴干细胞（NCSCs）的操作之前，需要准备好相应的培养基和试剂（参见 表1).
- 从面部拉皮手术获取的新鲜成年活体人头皮皮肤或胎儿头皮组织，用含青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液冲洗。
- 皮肤随后被转移至50 ml离心管中，加入含Dispase（10 mg/ml）的DMEM，4℃过夜孵育 4 °C孵育2-4小时于 37 °C 同样有效。皮肤组织的宽度应不超过1 cm，以利于酶的渗透。
- 将皮肤转移至无菌培养皿中；通过夹住靠近皮肤表面的毛干，用力且平稳地拔除皮肤上的每一根毛发。毛囊呈现生长期（anagen）形态，图1A) 或休止期（telogen）图1B).
- 将分离的卵泡片段在含0.05%胰蛋白酶-EDTA（Invitrogen）的溶液中于室温下振荡孵育15–20分钟，期间定期摇动；加入4 ml含10%胎牛血清的DMEM终止反应。卵泡上皮经胰蛋白酶消化后，过滤 40 μm 过滤以获得含有不同大小和形状细胞的单细胞悬液。
- 200 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，用含 2% 血清（FBS）的 1 ml PBS 重悬。
- 或者，拔下的毛囊可不经胰蛋白酶消化直接进行培养，以生成毛囊球 原位.
3. 使用流式细胞术分选分离毛囊神经嵴干细胞
- 通过胰蛋白酶消化获得毛囊单细胞悬液，并在冰上避光条件下与抗CD271（APC标记）/HNK1（FITC标记）或CD271/α4整合素（PE标记）抗体孵育40分钟。
- 在室温下以200 × g离心5分钟，吸除上清液。
- 用含2%血清（FBS）的PBS重悬细胞，分选前加入碘化丙啶（PI）以排除死细胞。
- 通过流式细胞术（FACS）进行细胞分选。收集CD271+、HNK1+双阳性细胞或CD271+、α4整合素+双阳性细胞（图2）。
- 分选后，将CD271+、HNK1+双阳性细胞或CD271+、α4整合素+双阳性细胞接种于超低吸附培养板中，在NCSC培养基中进行培养。
4. 原代神经嵴干细胞的培养
- 在超低吸附培养板中用NCSC培养基培养解离的卵泡细胞或FACS分选的细胞，每天更换培养基。
- 每天在显微镜下观察细胞培养情况。根据供体年龄的不同，神经嵴干细胞（NCSCs）在培养数天后开始形成悬浮的小细胞团，并在2至5周内发育成结构良好的细胞球。图3A几天后，隆起区域将出现外延生长，形成结构良好的球体 原位 数周内图3B当整个毛囊在NCSC培养基中培养时。
5. 神经嵴干细胞的扩增
- 用 PBS 洗涤细胞一次。
- 加入预热至 37 °C（关键）的 accutase，于 37 °C 孵育 5–10 分钟，并定期振荡，以确保神经干细胞球体解离为单细胞（对于贴壁培养的 NCSC，将细胞与 accutase 在 37 °C 孵育 5 分钟，以确保毛囊干细胞脱落）。
- 用 DMEM/F12 培养基在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，洗涤并离心细胞两次，以去除残留的 accutase 溶液。
- 用 NCSC 培养基重悬细胞。
- 对于悬浮培养，将细胞接种至超低吸附培养板中；对于贴壁培养，将细胞接种至预处理的组织培养板中。
6. 代表性结果
NCSC培养基足以在无需饲养层细胞的情况下维持hNCSCs处于未分化状态。角质形成细胞在此培养基中无法增殖并逐渐死亡。某些小的圆形细胞将在3至5天后开始增殖，并在悬浮状态下形成小的细胞聚集体。这些漂浮的聚集体逐渐增大，形成三维球状结构，我们称之为毛囊球（图3A）。若将NCSCs培养在包被的培养皿中，则细胞会贴壁生长，不会形成任何球状结构。贴壁生长的NCSCs增殖速度比悬浮培养的细胞更快。形成球状结构或贴壁生长的干细胞均表达NCSCs标志物。当完整毛囊进行培养时，球状结构会在对应于隆突区的区域形成（图3B）。
图1. 拔取的生长期（A）和休止期（B）毛囊。
图2. NCSCs 的 FACS 分析代表性图像。 左图：使用抗 CD271 和抗 α4 整合素抗体对细胞进行分选。右图：使用抗 CD271 和抗 HNK1 抗体对细胞进行分选。
图3. 毛囊球的形态学特征。 （A） 漂浮毛发球体的形态，左图：低倍镜，右图：高倍镜。 （B） 毛球的形态学 原位 在隆突区域，左图：处于休止期隆突的毛囊球；右图：处于生长期毛囊隆突区域的毛囊球。
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讨论
所述的细胞分离与培养方法具有良好的可重复性和稳健性。我们已从数十名不同年龄段的个体中成功分离出神经嵴干细胞（NCSCs）。尽管最好在组织获取后立即进行处理，但我们发现头皮组织可在冰上用培养基保存过夜运输，对细胞活力的影响极小。
在毛囊分离过程中，必须使用抗生素处理头皮组织，并采用无菌技术，以避免潜在的微生物污染。废弃的面部拉皮手术皮肤或胎儿头皮组织可获得数百个有活力的毛囊，通常仅需数天即可获得足够的组织用于流式细胞分选（FACS）或其他后续实验。头皮组织穿刺活检通常获得的细胞数量有限，需要额外培养组织以获得足够数量的细胞用于后续实验。
胚胎期神经嵴干细胞（NCSCs）可分化为体内多种不同类型的细胞11，而毛囊来源的神经嵴干细胞似乎也具有广泛的分化潜能。毛囊隆突是多种类型干细胞的微环境3,12。Lyle 及其同事已证实可从毛囊隆突中分离出人类上皮干细胞，这些细胞在上皮细胞谱系中具有多向分化潜能13。黑色素细胞前体细胞也存在于毛囊隆突中3。因此...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 R01AR054593 和 R01AR054593-S1，授予 Xu。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 | |
| 热灭活胎牛血清 | Hyclone | SH30071.03 | |
| B27添加剂 | Invitrogen | 17504044 | |
| N2 补充剂 | Invitrogen | 17502048 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 | |
| EGF | R&D 系统 | 236-EG-01M | |
| IGF-I | R&D 系统 | 291-G1-050 | |
| 0.05% 胰蛋白酶/EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15070063 | |
<强>表1. |
参考文献
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