本文介绍了一种从人类毛囊中分离和培养神经嵴干细胞的可靠方案。
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摘要
摘要
毛囊经历终生生长，毛发周期是一个由干细胞增殖与静息精确调控的过程。毛囊隆突是成体干细胞特征明确的微环境。1外根鞘的这一区段含有多种不同类型的干细胞，包括表皮干细胞2，黑色素细胞干细胞3 以及类似神经嵴的干细胞4-7毛囊是获取多种人类干细胞的便捷且丰富的来源。我们及其他研究者已从人类胎儿和成体毛囊中分离出神经嵴干细胞（NCSCs）。4,5这些人类干细胞是标记保留细胞，能够通过不对称细胞分裂进行自我更新 体外表达未成熟神经嵴细胞标志物，但不表达分化标志物。我们的表达谱分析研究表明，它们与小鼠皮肤未成熟神经嵴细胞具有相似的基因表达模式。它们具有克隆多能性，可分化为肌源性、黑色素细胞和神经元细胞系 体外 单克隆单细胞培养。分化后的细胞不仅获得谱系特异性标志物，还表现出相应的功能 离体 条件下。此外，这些神经嵴干细胞（NCSCs）具有向间充质谱系分化的潜能。分化得到的神经元细胞可在小鼠脑内长期存活，并维持神经元分化标志物的表达。已有研究表明，毛囊来源的NCSCs可促进神经再生，在脊髓横断损伤后移植这些干细胞可改善小鼠的运动功能。8此外，外周神经已通过干细胞移植进行修复9，并在坐骨神经受压部位附近植入皮肤来源的前体细胞已实现再髓鞘化10因此，毛囊/皮肤来源的神经嵴干细胞在临床前模型中已展现出用于再生治疗的良好前景。
体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）在再生医学领域展现出巨大潜力。然而，iPS细胞仍存在诸多问题，尤其是原癌基因/病毒整合的长期影响以及多能干细胞潜在的致瘤性尚未得到充分解决。在iPS细胞能够应用于再生医学之前，仍需克服许多障碍。相比之下，成体干细胞已被证实具有良好的安全性，并已在临床上应用多年，例如骨髓移植，已有众多患者从中获益。自体成体干细胞仍是移植治疗的首选细胞类型。因此，人体皮肤/毛囊中易于获取且可扩增的成体干细胞是再生医学的重要细胞来源。
方案
1. 组织培养板的准备
- 用足量的多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine, PDL）包被每个孔，确保覆盖孔底。将培养板置于超净台中晾干。
- 待孔内完全干燥后，用无菌水冲洗并吸除液体，再次将培养板置于超净台中晾干。
- 干燥后，加入纤连蛋白（fibronectin）进行包被（该溶液为纤连蛋白在Biowhittaker水中于37 °C过夜溶解，浓度为6 ml溶液中含1 mg纤连蛋白）。
- 在纤连蛋白干燥前，向孔中加入NCSC培养基[95 ml DMEM/F12、1 ml 青霉素/链霉素（P/S）、1 ml N2、2 ml B27、100 μl 巯基乙醇（2ME；50 mM 储液）、bFGF（20 ng/ml 培养基）、IGF-1（20 ng/ml 培养基）和 EGF（20 ng/ml 培养基）]。
2. 从人头皮中提取毛囊细胞
- 在开始分离神经嵴干细胞（NCSCs）的操作之前，需要准备好相应的培养基和试剂（参见 表1).
- 从面部拉皮手术获取的新鲜成年活体人头皮皮肤或胎儿头皮组织，用含青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液冲洗。
- 皮肤随后被转移至50 ml离心管中，加入含Dispase（10 mg/ml）的DMEM，4℃过夜孵育 4 °C孵育2-4小时于 37 °C 同样有效。皮肤组织的宽度应不超过1 cm，以....
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讨论
所述的细胞分离与培养方法具有良好的可重复性和稳健性。我们已从数十名不同年龄段的个体中成功分离出神经嵴干细胞（NCSCs）。尽管最好在组织获取后立即进行处理，但我们发现头皮组织可在冰上用培养基保存过夜运输，对细胞活力的影响极小。
在毛囊分离过程中，必须使用抗生素处理头皮组织，并采用无菌技术，以避免潜在的微生物污染。废弃的面部拉皮手术皮肤或胎儿头皮组织可获得数百个有活力的毛囊，通常仅需数天即可获得足够的组织用于流式细胞分选（FACS）或其他后续实验。头皮组织穿刺活检通常获得的细胞数量有限，需要额外培养组织以获得足够数量的细胞用于后续实验。
胚胎期神经嵴干细胞（NCSCs）可分化为体内多种不同类型的细胞11，而毛囊来源的神经嵴干细胞似乎也具有广泛的分化潜能。毛囊隆突是多种类型干细胞的微环境3,12。Lyle 及其同事已证实可从毛囊隆突中分离出人类上皮干细胞，这些细胞在上皮细胞谱系中具有多向分化潜能13。黑色素细胞前体细胞也存在于毛囊隆突中3。因此.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 R01AR054593 和 R01AR054593-S1，授予 Xu。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 | |
| 热灭活胎牛血清 | Hyclone | SH30071.03 | |
| B27添加剂 | Invitrogen | 17504044 | |
| N2 补充剂 | Invitrogen | 17502048 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 | |
| EGF | R&D 系统 | 236-EG-01M | |
| IGF-I | R&D 系统 | 291-G1-050 | |
| 0.05% 胰蛋白酶/EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15070063 | |
<强>表1. |
参考文献
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M.
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