方法文章

准备使用一个不连续Percoll蔗糖密度梯度的从小鼠皮质Synaptoneurosomes

DOI：

10.3791/3196

⸱

2011年9月17日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一个准备从小鼠大脑皮质翻译活跃，完好synaptoneurosomes（SNS）的方法来描述。该方法采用一个不连续Percoll蔗糖密度梯度，允许快速制备活跃的SNS。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synaptoneurosomes（SNS）小鼠大脑皮质的同质化和分馏后获得的。他们再封好，水疱或离开时，皮层组织匀浆脱离的轴突终端的隔离终端。 SNS的保留前和突触后的特点，这使得它们在突触传递的研究非常有用。他们保留用于神经信号的分子机制，并能够吸收，储存和释放神经递质。

积极SNS的生产和隔离可能会出现问题的使用聚蔗糖，可细胞毒性，并要求延长离心由于密度高，过滤和离心的方法，它可以在低活动导致机械损伤的SNS等媒体。然而，使用不连续Percoll蔗糖密度梯度分离SNS提供了一种快速的方法来产生良好收益的翻译活跃的SNS。 Percoll蔗糖梯度法快速，温和的，因为它采用等渗条件下，有越来越短的离心旋转，并避免离心步骤，颗粒SNS和造成机械损伤。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。准备工作1-4

  1. 准备一个2.5米的蔗糖浆混合50毫升，500毫升（GM），梯度介质的缓冲，2.5毫升的一个1M的Tris -盐酸，PH7.5股票，0.1毫升0.5 M EDTA，pH值8.0股毫Q水体积。过滤消毒的解决方案，分装和储存冷冻。
  2. 准备的河豚毒素（TTX）的1000倍的股票，由1毫米的解决方案中的 Milli - Q H 2 O TTX的等分可以储存在-20 ° C
  3. 准备由Milli - Q水解决了100毫米的Tris（pH值7.5），5毫米的Na 2 HPO 4，4毫米的KH 2 PO 4， 碳酸氢钠 3 40毫米，800毫米氯化钠10X刺激缓冲区。股票可以储存于4 ° C。
  4. 预冷离心机到4 ° C。
  5. 股票的等渗Percoll（SIP）解决方案，并准备加入Percoll（18毫升）的9卷1体积为2.5米的蔗糖（2毫升）在Milli - Q水拌匀。
  6. SIP的款额加入到通用汽车缓冲和混合每个准备3，10，15和23％的梯度层：

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

不连续Percoll蔗糖梯度准备此处所描述的是一个快速，可靠的方法来隔离活跃的SNS，它可以用于各种突触传递的实验。此渐变的方法，它是根据Dunkley等人，3,4开发的方法是一种细胞内的脑分馏过程分离前和突触后膜囊泡与另一个相关的衍生。没有进一步纯化这些SNS兼容多种分子生物学技术，包括免疫，免疫印迹，流式细胞仪，监测从头蛋白质的合成，通过[35S] - MET注册成立后，电子显微镜，以及多种酶的活性检测，包括异构酶激酶活性检测。

不连续Percoll蔗糖梯度程序是比较直截了当，但是，它的关键是解决方案和大脑物质保持在4 °整个筹备和前寒意梯度彗星。虽然匀浆始终保持冰冷，以尽量减少蛋白水解，更大的活动更好的良率，这是最好不要让皮层上坐太久之前同质化冰在通用缓冲。 SNS的形成是最好的皮质冲洗，然后尽快匀浆。然而，匀浆，可保持在冰上前无不良影响的初步离心。速度是一个问题，一旦皮层已收获，所以SNS的隔离应尽快完成。虽然SNS可以保留1-2个小时的高活性，步骤之间的时间长时间会导致活性下降。为SN准备使用的小鼠的年龄也是一个关键问题。此前它已被.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

没有利益冲突的声明。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢来自威斯康星大学麦迪逊分校电子显微镜设施电子显微镜的大学BK八月。这项工作是由NIH资助R01 - DA026067和P30 - HD03352（JSM）的支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂名称公司目录编号评论（可选）
微BCA蛋白检测试剂盒刺穿 23235
氯化钙 费舍尔 C79 - 500
CO 2气体公司Airgas（UW - MDS） 光盘50
EDTA的零售物价指数 E57020
乙醇费舍尔 A407SK - 4
盐酸费舍尔 A142 - 212
Percoll GE医疗集团 17-0891-01
KH 2 PO 4 费舍尔 P285 - 500
PierceSDS - PAGE样品制备试剂盒刺穿 89888
氯化钠零售物价指数 S23020
碳酸氢钠3 费舍尔 BP328 - 500
娜2保护海港条例“4 费舍尔 S381 - 500
蔗糖零售物价指数 S24060
Tris碱零售物价指数 T60040
河豚毒素西格玛 T5651
快临标签混合S35简易标签 Perkin Elmer公司 NEG772
设备公司目录编号评论（可选）
解剖工具
Dounce匀浆，7毫升（带有两个玻璃杵标记为“A”和“B”） 惠顿
P1000的吉尔森Pipetman 吉尔森 F123602
Allegra的6KR离心机 Beckman Coulter公司 366830
生长激素3.8转子，水平转子 Beckman Coulter公司 360581
贝克曼J2 - 21型离心机贝克曼
贝克曼管与帽贝克曼 355672
白色围墙适配器贝克曼 342327
蓝壁适配器贝克曼
JA - 17转子，固定角转子贝克曼 369691

用于免疫印迹抗体表：

抗体名称公司目录编号宿主物种稀释倍数
β-肌动蛋白西格玛 A5441 小鼠 1:2000
GFAP 圣克鲁斯 SC - 65343 小鼠 1:200
GP73 圣克鲁斯 SC - 134509 兔 1:200
HSC70 圣克鲁斯 SC - 7298 小鼠 1:200
Laminβ 圣克鲁斯 SC - 6261 山羊 1:200
Prohibitin 圣克鲁斯 SC - 28259 兔 1:200
PSD95 Millipore公司 MAB1596 小鼠 5微克/μL
SNAP25 Abcam公司 ab5666 - 100 兔 1:2000
突触 Millipore公司 MAB368 小鼠 1:500
β- 3 -微管蛋白圣克鲁斯 SC - 80016 小鼠 1:200

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic pr....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Percoll S35

相关文章