本文介绍了一种从小鼠脑皮层制备具有翻译活性且结构完整的突触体（SNs）的方法。该方法采用不连续的Percoll-蔗糖密度梯度，可快速制备出具有活性的突触体。
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本文内容
摘要
摘要
突触体（SNs）是通过小鼠脑皮层的匀浆和分级分离获得的。它们是重新封闭的小泡或在皮层组织匀浆时从轴突末梢脱离的孤立末梢结构。SNs 保留了突触前和突触后的特性，因此在突触传递研究中具有重要用途。它们保留了神经元信号传导所需的分子机制，并能够摄取、储存和释放神经递质。
使用Ficoll等介质生产与分离有活性的核糖核蛋白体（SNs）可能存在困难，因为这类介质具有细胞毒性，且由于密度较高，需要长时间离心；而过滤和离心方法则可能因对SNs造成机械损伤而导致活性降低。然而，采用不连续的Percoll-蔗糖密度梯度法分离SNs，可快速获得产量较高且具有翻译活性的SNs。Percoll-蔗糖梯度法快速温和，因其采用等渗条件，离心步骤更少且时间更短，并避免了将SNs沉淀下来的离心过程，从而减少了机械损伤。
方案
1. 准备工作1-4
- 通过将50 mL 2.5 M蔗糖悬液、2.5 mL 1 M Tris-HCl（pH 7.5）储备液和0.1 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0）储备液加入milli-Q水中定容至500 mL，配制梯度介质（GM）缓冲液。过滤除菌后分装并冷冻保存。
- 用milli-Q H2O配制1 mM的河豚毒素（TTX）溶液，制成1000倍储备液。TTX分装后可于-20°C保存。
- 用milli-Q水配制10倍刺激缓冲液，其中含100 mM Tris（pH 7.5）、5 mM Na2HPO4、4 mM KH2PO4、40 mM NaHCO3和800 mM NaCl。该储备液可在4°C保存。
- 将离心机预冷至4°C。
- 在milli-Q水中，将9体积的Percoll（18 mL）加入1体积的2.5 M蔗糖（2 mL）中，充分混匀，配制成等渗Percoll（SIP）储备液。
- 通过将相应体积的SIP加入GM缓冲液中并充分混匀，分别配制3%、10%、15%和23%的梯度层：
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讨论
本文所述的不连续Percoll-蔗糖梯度制备方法是一种快速、可靠的分离活性突触体（SNs）的方法，可用于多种突触传递实验。该梯度方法基于Dunkley等人开发的方法。3,4 是一种分离相互关联的突触前和突触后膜来源囊泡的亚细胞脑组织分级分离方法。无需进一步纯化，这些突触复合体即可用于多种分子生物学技术，包括免疫沉淀、蛋白质印迹、流式细胞术检测 从头合成 通过[35S]-Met掺入法检测蛋白质合成、透射电子显微镜观察以及多种酶活性测定，包括异构酶和激酶活性测定。
不连续 Percoll-蔗糖梯度法操作相对简单；然而，整个制备过程中必须始终保持溶液和脑组织处于 4°C，并且梯度介质需预先冷却。尽管匀浆物始终需保持冰浴以最大限度减少蛋白水解，但为了获得更高的产量和活性，在加入 GM 缓冲液后不宜将皮质组织在冰上放置过久再进行匀浆。当皮质组织经快速冲洗后立即进行匀浆时，突触体（SNs）的形成效果最佳。不过，匀浆物在初次离心前可暂时置于冰上，不会产生不良影响。一旦皮质组织被收获，操作速度就成为关键因素，因此突触体的分离应尽快完成。尽管突触体可在 1–.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢威斯康星大学麦迪逊分校电子显微镜中心的 B. K. August 提供电子显微镜技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 R01-DA026067 和 P30-HD03352（授予 J.S.M.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂名称 | 公司 | 货号 | 评论（可选） |
| Micro BCA 蛋白检测试剂盒 | 皮尔斯 | 23235 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| CO2 气体 | Airgas（UW-MDS） | CD50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Fisher | A407SK-4 | |
| HCl | Fisher | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
| Pierce SDS-PAGE 样品制备试剂盒 | 皮尔斯 | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO₃3 | Fisher | BP328-500 | |
| Na2PHO4 | Fisher | S381-500 | |
| 蔗糖 | RPI | S24060 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| 河豚毒素 | Sigma | T5651 | |
| Express Pro Label Mix S35 Easy Tag | Perkin Elmer | NEG772 | |
| 仪器设备 | 公司 | 货号 | 评论（可选） |
| 解剖工具 | |||
| Dounce 匀浆器，7 mL（配有两支标有字母的玻璃研杵） " A" 和 "B") | Wheaton | ||
| P1000 Gilson 移液器 | Gilson | F123602 | |
| Allegra 6KR 离心机 | 贝克曼库尔特 | 366830 | |
| GH 3.8 转子，摆桶式转子 | 贝克曼库尔特 | 360581 | |
| Beckman J2-21 离心机 | 贝克曼 | ||
| 带盖的Beckman离心管 | 贝克曼 | 355672 | |
| 白色壁适配器 | 贝克曼 | 342327 | |
| 蓝色壁面适配器 | 贝克曼 | ||
| JA-17 转子，固定角转子 | 贝克曼 | 369691 | |
用于蛋白质印迹的抗体列表： | |||
| 抗体名称 | 公司 | 货号 | 宿主物种 |
| β-肌动蛋白 | Sigma | A5441 | 小鼠 |
| GFAP | 圣克鲁斯 | sc-65343 | 小鼠 |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | 兔 |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | 小鼠 |
| 层粘连蛋白β | Santa Cruz | Sc-6261 | 山羊 |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | 兔 |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | 小鼠 |
| SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | 兔 |
| 突触素 | Millipore | MAB368 | 小鼠 |
| β-3-微管蛋白 | Santa Cruz | sc-80016 | 小鼠 |
|
参考文献
- Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic pr....
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