本文介绍了一种从小鼠脑皮层制备具有翻译活性且结构完整的突触体（SNs）的方法。该方法采用不连续的Percoll-蔗糖密度梯度，可快速制备出具有活性的突触体。
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本文内容
摘要
摘要
突触体（SNs）是通过小鼠脑皮层的匀浆和分级分离获得的。它们是重新封闭的小泡或在皮层组织匀浆时从轴突末梢脱离的孤立末梢结构。SNs 保留了突触前和突触后的特性，因此在突触传递研究中具有重要用途。它们保留了神经元信号传导所需的分子机制，并能够摄取、储存和释放神经递质。
使用Ficoll等介质生产与分离有活性的核糖核蛋白体（SNs）可能存在困难，因为这类介质具有细胞毒性，且由于密度较高，需要长时间离心；而过滤和离心方法则可能因对SNs造成机械损伤而导致活性降低。然而，采用不连续的Percoll-蔗糖密度梯度法分离SNs，可快速获得产量较高且具有翻译活性的SNs。Percoll-蔗糖梯度法快速温和，因其采用等渗条件，离心步骤更少且时间更短，并避免了将SNs沉淀下来的离心过程，从而减少了机械损伤。
方案
1. 准备工作1-4
- 通过将50 mL 2.5 M蔗糖悬液、2.5 mL 1 M Tris-HCl（pH 7.5）储备液和0.1 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0）储备液加入milli-Q水中定容至500 mL，配制梯度介质（GM）缓冲液。过滤除菌后分装并冷冻保存。
- 用milli-Q H2O配制1 mM的河豚毒素（TTX）溶液，制成1000倍储备液。TTX分装后可于-20°C保存。
- 用milli-Q水配制10倍刺激缓冲液，其中含100 mM Tris（pH 7.5）、5 mM Na2HPO4、4 mM KH2PO4、40 mM NaHCO3和800 mM NaCl。该储备液可在4°C保存。
- 将离心机预冷至4°C。
- 在milli-Q水中，将9体积的Percoll（18 mL）加入1体积的2.5 M蔗糖（2 mL）中，充分混匀，配制成等渗Percoll（SIP）储备液。
- 通过将相应体积的SIP加入GM缓冲液中并充分混匀，分别配制3%、10%、15%和23%的梯度层：
- 使用 P1000 Gilson 移液器将 23%、15%、10% 和 3% 的等渗 Percoll 溶液各 2 ml 依次加入带盖的 Beckman 离心管中，形成梯度层。各层之间的界面应清晰可辨，不得发生混合。梯度液制备后需在 4°C 下保存至少 20 分钟方可使用。梯度液可在 24 小时内使用，但建议当日制备当日使用。[无经验的操作人员可在等渗 Percoll 溶液中加入蓝色染料以观察各层界面，用于练习梯度液的制备。]
2. 小鼠解剖 1
- 确保所有小鼠饲养和处死操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）和大学的指导原则进行。通过二氧化碳窒息法或动物实验方案中批准的其他方法处死幼鼠（P13至P21日龄）。
- 将小鼠固定于解剖板上，用乙醇喷洒其颈部背面和头部。使用锋利的剪刀在颅底处剪断脊髓，去除颅顶部皮肤，于顶骨与间顶骨之间或大脑半球与皮层区域之间横向剪开颅骨，再沿矢状缝从颅底向鼻部纵向剪开颅骨。轻轻将两侧半球拉开，小心取下柔软的顶骨，用解剖铲剥离皮层。将解剖铲插入小脑上方的脑组织中，挖出皮层组织并置于冰上预冷的GM缓冲液中。立即进行后续匀浆步骤。皮层组织在冰上缓冲液中不宜放置过久，以免影响突触体（SNs）的形成。
3. 匀浆液与上清液的制备1-4
- 用冰冻的 GM 缓冲液冲洗皮层组织，然后将两个皮层组织转移至含有 5 mL 冷 GM 缓冲液的玻璃 Dounce 匀浆器中。
- 先用松散研杵（研杵“A”）轻轻匀浆 5–10 次，再用紧密研杵（研杵“B”）匀浆 5–10 次。操作时研磨速度应快速，但需缓慢到不产生气泡为止。方案 1展示了匀浆完成后的匀浆液外观。具体研磨次数取决于所用匀浆器及其配套研杵的个体差异。若最终梯度离心后未能获得清晰的 SN 条带，应调整研磨次数以优化结果。
- 将匀浆液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 4°C 条件下，使用摆桶转子（Allegra 6KR 离心机）以 1000×g 离心 10 分钟，以沉淀细胞碎片和细胞核。方案 1展示了离心后样品的外观。
- 将 2 mL 上清液小心铺加至每根 Percoll-蔗糖梯度管中，盖紧管盖，并使用适当的转子适配器（见试剂与仪器表），在固定角转子（Beckman J2-21 离心机，JA-17 转子）中于 4°C 以 32,500×g 离心 5 分钟。
- 使用玻璃巴斯德移液管吸除并弃去 SN 条带上方的液体。在 15%/23% 界面处吸取 SN 条带，转移至一个圆锥形离心管中，并置于冰上保存。每根梯度管或每个皮层组织可获得 0.9–1.1 mL 的 SN。
- 通过加入十分之一体积的 10× 刺激缓冲液来调节 SN 的盐浓度，加入 1000× CaCl2 至终浓度为 12 nM，并加入 1 mM TTX 储备液至终浓度为 1 μM，以抑制非特异性兴奋。（若 CaCl2 可能干扰后续 SN 应用，则可选择不添加。）
- 使用 Micro BCA 蛋白检测试剂盒测定 SN 的蛋白浓度。（不推荐使用 Bradford 蛋白检测法，因其会受到 Percoll 的干扰。）
- SN 可直接快速用于蛋白质翻译研究。对于其他应用，可使用 Pierce SDS-PAGE 样品制备试剂盒对 SN 裂解液进行纯化或浓缩处理。
4. 典型结果：
当小鼠大脑皮层被匀浆并经不连续 Percoll-蔗糖梯度离心（方案 1）分离时，可见6个条带或组分（图1）。先前在大鼠大脑皮层中已证实3,5，高分子量条带的成分为破碎的膜结构和髓鞘，而沉淀物中含有线粒体或其他细胞器（表1）。23%/15%界面（条带5）富含突触小体（SNs）。
在23%/15%界面处的条带含有完整的突触体（SNs），将其取出并按先前所述方法进行透射电子显微镜（EM）观察2,6。EM结果显示存在完整的突触小泡，并保留了突触前和突触后结构（图2）。分离突触前和突触后区室对于研究发生在两个区室中的信号转导和蛋白质合成至关重要7-13。Percoll-蔗糖梯度法为粗纯化方法，因此我们在突触体组分中观察到少量细胞、细胞核及细胞器污染，但总体分离效果良好。
通过 Western blot 检测，Percoll 分级组分中含有预期的蛋白质标志物，且 SN 条带中的突触纯度有所提高（图 3，表 2）。在富集的 SN 条带（第 5 条带）中，突触和神经元标志物得以保留，而其他标志物的丰度显著降低。特别是星形胶质细胞和胶质来源肿瘤细胞的标志物 GFAP 以及核标志物 Lamin-B1 几乎检测不到，而结构和突触标志物则保持不变或有所增强。此外，线粒体和高尔基体等参与蛋白质合成的细胞器标志物也得以保留。
SN条带的典型蛋白产量为每样250-500 ng μL，由BCA蛋白测定法确定。SNs的活性通过以下量来确定： 从头合成 通过[35S]-Met掺入监测的蛋白质合成情况图 4).2 基础翻译活性在SNs受到刺激时增加了1.56倍 50 μM 谷氨酸/10 μM 甘氨酸（Glu）或在使用Pin1抑制剂胡桃醌激活时增加5.12倍。已知Pin1抑制会导致蛋白质合成增加。2 为了证实[35S]-Met掺入量的增加是由于 从头合成 蛋白质合成，我们添加了 40 μM 茴香霉素（anisomycin）是一种蛋白质合成抑制剂，在有或无谷氨酸（Glu）存在的情况下，与基础水平相比，其掺入量显著降低。此外，加入2% Triton-X 100（可破坏SNs的完整性）后，基础翻译水平下降了75%。2 此外，在检测显示突触标志物富集最明显的条带（B4-B6）时，SNs或条带5表现出最高的活性 从头合成 蛋白质合成图5因此，不连续的Percoll-蔗糖梯度可快速获得高活性且富集的SN条带，可用于蛋白质翻译研究。
不连续的Percoll-蔗糖梯度法相较于其他方法更具优势，因为其他方法中的更剧烈条件会导致机械性损伤。与过滤法相比，在过滤法中，澄清的皮层匀浆需通过孔径依次减小的一系列滤膜，3,14-15 Percoll 方法可形成更多具有更高活性的突触小体。如图所示 图6，当采用过滤法制备的SN样品通过Percoll-蔗糖梯度离心时，在15/23%界面处的SN数量显著减少，且破损膜成分更多。当 从头合成 通过S35-甲硫氨酸掺入法测定蛋白质合成，采用过滤法制备的SNs活性显著较低（图7）。为了最大化翻译活性，我们使用出生后14至18天（P14–P18）的小鼠。虽然也可以从成年小鼠制备SN，但我们观察到，使用幼年小鼠制备的SN具有显著更高的翻译活性（图8).
表 1. 小鼠皮层匀浆物经不连续 Percoll 梯度离心分离所得各条带的组分。3,5
表 2. 不连续 Percoll-蔗糖梯度各条带组分的 Western 印迹分析总结。 通过 Western 印迹法测定利用不连续 Percoll-蔗糖梯度分离的各条带组分中蛋白质的相对浓度。无蛋白质存在（-），蛋白质浓度为上清液（S，皮层匀浆物经离心后的上清）的 0≥0.2（+）、0.2≥0.8（++），或 >0.8（+++）倍，结果代表 n=3 的实验。
图式 1：使用非连续 Percoll-蔗糖密度梯度制备突触小体（SN）的示意图。 小鼠脑皮层组织经解剖后进行匀浆，并以低速离心去除未充分匀浆的组织、完整细胞以及包括细胞核和膜结构在内的完整细胞器。非连续梯度应具有清晰分界的各层。插图展示了各层结构的一个示例，为便于观察层间界限，仅作示意性蓝色染色。将上清液加至非连续 Percoll-蔗糖密度梯度之上，再以中等速度离心。随后从梯度中收集突触小体（SN）条带，即可用于后续实验。
图 1. 在不连续 Percoll-蔗糖梯度中对匀浆进行分级分离。小鼠皮层组织经匀浆后在不连续 Percoll-蔗糖梯度中分离，产生 6 个条带或组分。纯化且具有活性的 SNs (*) 存在于第 5 条带中。
图 2. SN 制备物提供了保留突触前和突触后成分的异质性 SN 混合物。 对来自 C57BL/6 小鼠（年龄 P13 至 P21）的 SN 制备物进行电子显微分析，方法如前所述，结果显示 SN 具有保存完好的突触前和突触后结构。2,6 红色箭头指向突触后致密区。比例尺为 1 μm。
图3. 对SN组分的Western印迹分析显示，纯化的SN（5号条带）中突触和神经元标志物得以保留，而其他标志物的丰度显著降低。 对上清液（S，离心后的皮层匀浆物）以及非连续Percoll-蔗糖梯度分离的1-6号条带进行免疫印迹检测，所检测的蛋白包括β-Actin（结构性蛋白，上样对照）、GFAP（星形胶质细胞标志物）、GP73（高尔基体标志物）、HSC70（细胞质和细胞核）、Lamin-B1（核膜蛋白）、Prohibitin（线粒体标志物）、PSD95（突触后密度蛋白）、SNAP25（突触标志物）、Synaptophysin（突触标志物）以及β3-Tubulin（神经元特异性标志物）。条带使用Storm 860磷光成像仪显影，结果代表n=3的实验重复。
图4. SNs具有活性并表现出 从头合成 通过[35S]-Met掺入检测蛋白质合成。 SNs 已预先平衡至 37°C 10分钟。然后，SNs不进行处理或用指定试剂预处理15分钟 40 μM 茴香霉素或 1 μM 胡桃醌在 37°C 随后加入[35S]-Met， 20 μl ExpressPro 标记混合物 S35 Easy Tag，含或不含谷氨酸 37°C 30分钟。样品使用Pierce SDS-PAGE样品制备试剂盒制备，在15%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，干燥后使用Molecular Dynamics Storm 860磷屏成像仪进行定量，结果为n=3次独立实验的代表性数据，误差条表示±标准误（SEM）。
图 5. 不连续 Percoll-蔗糖梯度中的第 5 条带含有最高水平的从头蛋白质合成。将第 4、5、6 条带及上清液（S，离心后的皮层匀浆）在 37°C 预平衡 10 分钟，随后加入 [35S]-Met（Express Pro Label Mix S35 Easy Tag），在有或无谷氨酸（Glu）的条件下于 37°C 反应 30 分钟。样品使用 Pierce SDS-PAGE 样品制备试剂盒处理，在 15% 聚丙烯酰胺凝胶上电泳，干燥后采用 Molecular Dynamics Storm 860 磷光成像仪进行定量分析，结果代表 n=3 次独立实验，误差线表示 ±SEM。
图6. 采用过滤法所制备的突触小体含有更多的破损膜结构和更少的完整突触小体，相较于采用不连续Percoll-蔗糖梯度法所制备的突触小体SNs 通过将匀浆后的皮层组织按先前所述方法依次穿过孔径递减的滤膜来制备。3,14-15 采用过滤法获得的上清液等分试样经不连续Percoll-蔗糖梯度离心，与采用不连续Percoll-蔗糖梯度法处理的等量样品进行比较。
图7. 通过过滤法制备的SNs所含的从头蛋白质合成活性低于通过不连续Percoll-蔗糖梯度法制备的SNs。SNs通过将皮层组织匀浆依次通过孔径递减的滤膜进行制备（如前所述）3,14-15，并与不连续Percoll-蔗糖梯度法进行比较。两种方法制备的SNs均在37°C预平衡10分钟，随后加入[35S]-Met（Express Pro Label Mix S35 Easy Tag），在37°C条件下反应30分钟，反应体系中可选择性添加或不添加Glu。样品使用Pierce SDS-PAGE样品制备试剂盒处理，在15%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，干燥后使用Molecular Dynamics Storm 860磷光成像仪进行定量分析，结果为n=3的代表性数据，误差线表示±标准误（SEM）。
图 8. 来自较年轻小鼠（P14）的突触体（SNs）比来自较年老小鼠（P85）的突触体具有更高的翻译活性。 突触体使用不连续的Percoll-蔗糖梯度法从小鼠脑组织中分离，经37°C预平衡10分钟，随后在含[35S]-Met（Express Pro Label Mix S35 Easy Tag）的环境中处理或不处理谷氨酸（Glu），孵育30分钟，迅速冷冻，之后使用Pierce SDS-PAGE样本制备试剂盒进行纯化。将纯化后的样本在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，凝胶干燥后使用Molecular Dynamics Storm 860磷屏成像仪成像，结果为n=3次独立实验的代表性图像，误差线表示±标准误（SEM）。来自P14小鼠的突触体活性至少是P85小鼠的3倍以上。
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讨论
本文所述的不连续Percoll-蔗糖梯度制备方法是一种快速、可靠的分离活性突触体（SNs）的方法，可用于多种突触传递实验。该梯度方法基于Dunkley等人开发的方法。3,4 是一种分离相互关联的突触前和突触后膜来源囊泡的亚细胞脑组织分级分离方法。无需进一步纯化，这些突触复合体即可用于多种分子生物学技术，包括免疫沉淀、蛋白质印迹、流式细胞术检测 从头合成 通过[35S]-Met掺入法检测蛋白质合成、透射电子显微镜观察以及多种酶活性测定，包括异构酶和激酶活性测定。
不连续 Percoll-蔗糖梯度法操作相对简单；然而，整个制备过程中必须始终保持溶液和脑组织处于 4°C，并且梯度介质需预先冷却。尽管匀浆物始终需保持冰浴以最大限度减少蛋白水解，但为了获得更高的产量和活性，在加入 GM 缓冲液后不宜将皮质组织在冰上放置过久再进行匀浆。当皮质组织经快速冲洗后立即进行匀浆时，突触体（SNs）的形成效果最佳。不过，匀浆物在初次离心前可暂时置于冰上，不会产生不良影响。一旦皮质组织被收获，操作速度就成为关键因素，因此突触体的分离应尽快完成。尽管突触体可在 1–...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢威斯康星大学麦迪逊分校电子显微镜中心的 B. K. August 提供电子显微镜技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 R01-DA026067 和 P30-HD03352（授予 J.S.M.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂名称 | 公司 | 货号 | 评论（可选） |
| Micro BCA 蛋白检测试剂盒 | 皮尔斯 | 23235 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| CO2 气体 | Airgas（UW-MDS） | CD50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Fisher | A407SK-4 | |
| HCl | Fisher | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
| Pierce SDS-PAGE 样品制备试剂盒 | 皮尔斯 | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO₃3 | Fisher | BP328-500 | |
| Na2PHO4 | Fisher | S381-500 | |
| 蔗糖 | RPI | S24060 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| 河豚毒素 | Sigma | T5651 | |
| Express Pro Label Mix S35 Easy Tag | Perkin Elmer | NEG772 | |
| 仪器设备 | 公司 | 货号 | 评论（可选） |
| 解剖工具 | |||
| Dounce 匀浆器，7 mL（配有两支标有字母的玻璃研杵） " A" 和 "B") | Wheaton | ||
| P1000 Gilson 移液器 | Gilson | F123602 | |
| Allegra 6KR 离心机 | 贝克曼库尔特 | 366830 | |
| GH 3.8 转子，摆桶式转子 | 贝克曼库尔特 | 360581 | |
| Beckman J2-21 离心机 | 贝克曼 | ||
| 带盖的Beckman离心管 | 贝克曼 | 355672 | |
| 白色壁适配器 | 贝克曼 | 342327 | |
| 蓝色壁面适配器 | 贝克曼 | ||
| JA-17 转子，固定角转子 | 贝克曼 | 369691 | |
用于蛋白质印迹的抗体列表： | |||
| 抗体名称 | 公司 | 货号 | 宿主物种 |
| β-肌动蛋白 | Sigma | A5441 | 小鼠 |
| GFAP | 圣克鲁斯 | sc-65343 | 小鼠 |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | 兔 |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | 小鼠 |
| 层粘连蛋白β | Santa Cruz | Sc-6261 | 山羊 |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | 兔 |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | 小鼠 |
| SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | 兔 |
| 突触素 | Millipore | MAB368 | 小鼠 |
| β-3-微管蛋白 | Santa Cruz | sc-80016 | 小鼠 |
|
参考文献
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