高活性酵母核糖体的层析纯化

摘要

通过传统方法纯化的真核生物核糖体常因共纯化出的核酸酶和蛋白酶污染，从而对后续的生化与结构分析产生不利影响。本研究采用酵母核糖体作为模型系统，使用一种快速且简单的色谱纯化方法来解决这一问题。

摘要

与真细菌和古菌核糖体相比，真核生物核糖体更不稳定，这给研究人员带来了显著挑战。尤其令人困扰的是，细胞裂解会释放大量蛋白酶和核酸酶，这些酶可降解核糖体。因此，必须尽快将核糖体与这些酶分离开来。然而，传统的差速超速离心方法会使核糖体暴露于这些酶的作用下过长时间，从而影响其结构完整性和功能活性。为解决这一问题，我们采用了一种使用半胱氨酸负载的Sulfolink树脂的层析方法。该方法操作简便、快速，可显著减少共纯化的蛋白水解和核酸水解活性，获得高产量的完整且生化活性高的酵母核糖体。我们建议该方法也可适用于哺乳动物核糖体。该方法的简便性以及通过层析纯化所获得的核糖体更高的纯度和活性，代表了真核生物核糖体研究领域的一项重要技术进步。

方案

1. 准备半胱氨酸负载的Sulfolink树脂

1. 在室温下准备 Sulfolink 树脂（Pierce）。
2. 将制造商提供的 50% Sulfolink 偶联凝胶浆液共 10 ml 分装至两个 10 ml 塑料离心管中，每管各加入 5 ml。
3. 在 850 × g 条件下短暂离心，小心吸除上清液。
4. 用偶联缓冲液（50 mM Tris，pH 8.5，5 mM EDTA）洗涤凝胶三次：每次加入 5 ml 缓冲液重悬凝胶珠，短暂离心（850 × g），然后用移液器吸除上清液。
5. 向每根管中加入 5 ml 偶联缓冲液中含 50 mM L-半胱氨酸的溶液，在 25°C 下混合浆液 1 小时。
6. 按照步骤 1.4 所述方法洗涤，以去除残留的 L-半胱氨酸。
7. 将凝胶重悬于 10 ml 结合缓冲液 [20 mM HEPES，pH 7.6，5 mM Mg(OAc)₂，60 mM NH₄Cl，2 mM DTT] 中，并按步骤 1.4 所述方法用 10 ml 结合缓冲液洗涤 3 次，使树脂平衡。将树脂转移至 10 ml 离心柱中，加盖后于 4°C 保存。该树脂的 RNA 结合能力为每毫升约 20 A₂₆₀ 单位。

2. 使用半胱氨酸修饰的 Sulfolink 树脂对核糖体进行色谱纯化

讨论

核糖体纯化方案基本包括裂解细胞、通过低速离心收集细胞质组分，然后通过高速离心沉淀核糖体¹。尽管已有少数新方法用于纯化细菌核糖体，但真核生物核糖体的纯化尚未取得类似进展^2-4。尽管多年来已增加了一些步骤，例如盐洗涤和甘油垫层离心（例如参见⁵），但酵母核糖体的生化与结构研究仍受到其在纯化过程中易被内源性降解酶破坏的限制，这很可能是因为在超速离心步骤中核糖体长时间暴露于这类酶所致⁶。

传统方案存在的主要问题是核糖体在纯化过程中会共纯化蛋白酶和核酸酶，导致核糖体在纯化期间发生降解，从而降低具有生物化学活性的核糖体得率。在致病菌的临床分离株中，蛋白酶和核酸酶含量较高，这促使研究人员开发了一种使用半胱氨酸偶联的Sulfolink树脂进行核糖体纯化的层析方法⁷。采用该方法分离的细菌核糖体所获得的rRNA和蛋白质显示出更低程度的降解，且纯化后的核糖体结合红霉素和合成蛋白质的能力显著增强。核糖体与Sulfolink树脂结合的具体化学机制尚不明确，但据推测可能涉及疏水相互作用⁷

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫联偶联树脂	Pierce, Thermo Scientific	20402
Mini bead-beater 16	Biospec Products	607
Optima Max E 超速离心机	Beckman Coulter Inc.
Legend RT	Sorvall, Thermo Scientific
0.5 mm 玻璃珠	Biospec Products	11079105
Tris	Sigma-Aldrich	252859
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
DTT	Sigma-Aldrich	43815
HEPES	Sigma-Aldrich	54459
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
KCl	Sigma-Aldrich	60128
Mg(OAc)2	Sigma-Aldrich	M5661
KOH	Sigma-Aldrich	221473
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P7255
GTP	Fermentas	R0461