这是一种用于观察白细胞在离体加压血管中与内皮细胞黏附的方法。该技术能够在不同管腔压力（最高达200 mmHg）的剪切流条件下研究血管黏附过程，从而模拟高血压的病理生理状态。
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摘要
摘要
全球范围内，高血压的发病率约为人口总数的四分之一，是全球最主要的生物医学死亡风险因素。在血管系统中，高血压与内皮功能障碍和炎症反应增强相关，可导致动脉粥样硬化以及多种疾病状态，如慢性肾病。2, 脑卒中3 和心力衰竭4动脉粥样硬化发生过程中血管炎症的初始步骤是白细胞黏附级联反应，包括白细胞在内皮细胞表面的滚动、锚定、黏附以及随后的跨内皮迁移。白细胞向内皮的募集与积聚由多种黏附分子的上调所介导，这些分子包括血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和E-选择素，同时还伴随细胞因子和趋化因子释放的增加以及活性氧物质的上调。5. 体外 静态黏附实验等方法有助于确定细胞间黏附的相关机制以及细胞黏附分子的分析。先前研究中采用的方法 体外 研究表明，内皮细胞所受压力的急性升高可导致单核细胞黏附，以及黏附分子和炎症标志物的上调6 然而，与许多 体外 这些发现尚未在生理流动条件下使用全血进行实时检测。因此， 体内 在动物模型中，检测血管炎症和斑块形成的方法正日益得到广泛应用。活体显微镜技术现已被广泛用于评估白细胞的黏附、滚动、迁移及跨内皮迁移。7-9在综合压力对白细胞与内皮细胞黏附作用的影响时 体内 相关研究较为有限。其中一项研究探讨了血流和剪切力对动脉生长和重塑的实时影响，但炎症标志物仅通过免疫组织化学方法进行评估。10在此，我们介绍一种利用全血灌注在完整加压血管中实时记录白细胞黏附的模型。该方法是对原有方法的一种改进。 离体 血管腔灌注模型9 可实现完整血管中白细胞与内皮细胞黏附相互作用的实时分析。我们的改进使得管腔内压力可调节至高达200 mmHg，从而不仅可在生理流动条件下进行研究，还可研究压力条件下的血管反应。尽管已有研究利用压力肌动图系统观察血管壁和管腔直径的变化11 以及血管收缩，这是首次实时展示白细胞与内皮细胞相互作用的技术。本文以大鼠颈动脉为例，将其取出后连接至定制的流动腔室，并与荧光显微镜耦合，演示该技术的操作过程。该血管腔室底部配有大面积盖玻片，可使用大直径、短工作距离的物镜对血管进行成像。此外，可通过选择性使用激动剂和/或拮抗剂，进一步研究调控细胞黏附的分子机制。与活体显微技术相比，该方法的优势在于无需侵入性手术，因而通量更高；同时，该方法允许对目标血管进行局部抑制剂处理，而活体显微仅能实现全身性抑制剂干预。
方案
1. 分离颈动脉
- 通过 CO2/O2 窒息法处死 10 周龄的 Sprague Dawley 大鼠。
- 完整剥离左右两侧颈总动脉，并连同主动脉和心脏一起取出，确保血管受到的牵拉最小。
- 在冰冻的 Krebs 缓冲液中将颈总动脉与主动脉和心脏分离，并进行精细解剖。
- 将分离后的血管置于冰上的 Krebs 溶液中保存，待安装前使用。
大约需要时间 = 45 分钟
2. 启动反应室
- 在血管腔的近端和远端连接处，使用经碳酰气（95% O2；5% CO2）通气维持生理 pH 的 Krebs 缓冲液，在 37°C 条件下进行冲洗。
- 确保导管和套管完全冲洗干净并正确对齐。
- 用 Krebs 缓冲液冲洗 P1（近端）和 P2（远端）压力传感器，关闭活塞以确保传感器内无气泡。
- 将传感器连接至相应的连接口，再次冲洗 Krebs 缓冲液以确保无气泡，然后关闭通向腔室的活塞。
大约需要时间 = 15 分钟
3. 加压容器室
- 开启压力设备：压力伺服器、压力监测器、蠕动泵（图1）。
- 启动蠕动泵并施加压力，将压力伺服器设为自动运行模式，以20 mmHg（调节至1档）的压力使Krebs缓冲液流经管路，确保无气泡残留。
- 将管路连接至封闭的P2传感器。压力将逐渐稳定。
- 打开P2通向血管腔室的阀门，以排出可能存在的气泡，随后关闭阀门。
- 向浴槽中加入Krebs缓冲液（5 - 7 mL）。
大约需要时间 = 10 分钟
4. 安装血管
- 在解剖显微镜下，将黑色聚酯线绑在每根套管上（图2）。
- 将套管和套管支架分开，并将¼血管段（主动脉弓端）安装到P1套管上。注意不要撕裂血管。
- 使用装有Krebs缓冲液的注射器，通过P1传感器轻轻冲洗血管内多余的血液。然后关闭P1与腔室之间的通路。
- 用聚酯线将血管固定在P1套管上。
- 将套管/套管支架靠近，以便安装到P2套管上。
- 将血管远端约¼长度的部分安装到远端套管上，并用聚酯线固定。
大约需要 20 分钟
5. 加压容器
- 调整套管夹，确保血管无弯曲或拉伸。
- 关闭P1和P2与腔室的连接，将压力伺服系统从自动模式切换至手动模式。观察压力伺服系统，确认10秒内压力无持续下降。若压力持续下降，则表明存在泄漏，需检查并紧固连接处和传感器。
- 将压力伺服系统调回自动模式，然后打开P2与腔室的连接。在显微镜下观察，当旋塞打开至腔室时血管是否扩张。
- 将压力伺服系统切换至手动模式，再次检查10秒内压力是否持续下降。若存在泄漏，则系统未达到压力密封状态，血管可能存在破损。
- 切换回自动模式，打开P1与腔室的连接。在手动模式下检查压力是否保持稳定。
- 若无泄漏，在手动模式下将旋钮调至2（40 mmHg）。
- 调回自动模式，在显微镜下观察血管状态。必要时调整套管夹，确保血管无弯曲。在手动模式下检查是否存在泄漏。
- 重复步骤5.6至5.7，依次将旋钮调至3（60 mmHg）、4（80 mmHg）等，直至达到所需压力。
大约需要时间 = 15 - 30 分钟
6. 培养加压容器
- 连接温度控制器，并设置为 37°C。
- 使用第二台蠕动泵以 1 mL/min 的流速将 Krebs 缓冲液灌注到血管腔浴槽中。
- 将吸引器连接至浴槽，确保仅移除浴液的上层液体。
- 将加压的血管在 37°C 条件下孵育 1 小时，压力设置为自动模式。
- 定期检查压力是否泄漏（是否切换至手动模式）。
- 在孵育过程中，通过直接将药物加入浴液中，即可观察不同药理学干预的作用效果。
大约需要时间 = 1 小时
7. 用全血灌注加压血管
- 孵育期间，采集至少 7.5 mL 人全血/血管，每毫升血液中加入 40 U 肝素抗凝。将血液置于 50 ml 离心管中，37°C 孵育。
- 孵育结束前 10 分钟，在避光条件下，用 VybrantDil（1:1000）标记血液，37°C 孵育 10 分钟。
- 10 分钟后，将血液吸入注射器中，排除所有气泡，并连接至设定为 37°C 的带加热套的注射泵。
- 关闭 P1 传感器与灌注室/血管的连接，连接注射器和废液管路。
- 以 1000 μL/min 的流速通过废液管路灌注血液，以去除任何气泡。
- 打开 P1 与灌注室的连接。压力伺服系统将自动调节以维持设定压力。
- 以 100 μL/min 的流速进行血液灌注。
- 使用配备数字相机的荧光显微镜，在灌注后 1、3、5、7.5 和 10 分钟时，分别记录灌注血管的两个视野，每个视野持续 15 秒。
- 灌注结束后，可通过药理学技术（如肌动图）评估内皮完整性和功能，并通过免疫组织化学检测黏附分子表达，以进一步验证炎症反应。
大约需要时间 = 15 分钟
8. 代表性结果：
压力室装置的示意图见图1。将数码相机与荧光显微镜耦合后，可通过实时视频记录立即观察结果。代表性视频图像见图3，其中若白细胞静止停留达10秒，则视为已黏附于内皮。通过连续循环播放视频记录，可对黏附细胞进行计数，并以每视野平均数表示。尽管低压（图3A）和高压（图3B）均会引起一定程度的黏附，但在较高管腔压力下白细胞黏附显著增加，该结果亦通过定量分析得以证实（图4）。
图1. 加压 离体 血管腔示意图 连接近端（P1）传感器和远端（P2）传感器的套管化血管，可实现血管内血压的调控。灌注通过P1传感器进行，血压通过P2传感器维持。
图 2. 带缝合线的套管。 每个套管上均连接有黑色聚酯缝合线。
图3. 代表性视频图像。 灌注10分钟后，在80 mmHg（A）和120 mmHg（B）压力下荧光观察到的动态细胞黏附（红色箭头）。
图 4. 在低（80 mmHg）和高压力（120 mmHg）下孵育 1 小时后，Sprague Dawley 大鼠颈动脉中的白细胞黏附情况。***P<0.001，经双因素重复测量方差分析（ANOVA）结合 Bonferroni 事后检验分析得出。
讨论
这是一种改进的方法，用于在加压条件下实时研究白细胞在完整离体血管中与内皮细胞的黏附。仅灌注血管腔即可快速验证大型小鼠和大鼠血管的促炎性表型。通过调控压力，可观察从低到极高的管腔压力下的动态细胞相互作用，从而更真实地模拟生理和病理生理条件。此外，使用适当的细胞成像程序还可测量血管直径，进而确定并调控剪切流和流速。
凭借其肌动图功能，将药物干预物质加入浴液可为该模型的实验条件增加另一个维度，从而实现对机械和信号通路的研究。尽管在压力调控过程中无法确认内皮是否完整保留，但可在灌注后进行乙酰胆碱（ACh）和去氧肾上腺素（PE）的反应检测9。
需要注意的是，该实验装置用于演示管腔内压力对细胞间相互作用的影响，而非脉动血流或收缩压、舒张压的作用。此外，尽管实验中观察到了急性压力变化对白细胞黏附的影响，但该装置也可用于研究慢性压力效应（例如延长孵育时间，或使用慢性压力动物模型）。本实验以Sprague Dawley大鼠的颈总动脉为例进行演示，但通过适当调整套管尺寸，也可使用其他品系或物种的血管。需要特别指出的是，动物的年龄和体重会影响血管尺寸，因此该实验装置需根据每根血管的具体情况进行个体化调整。仔细而谨慎地剥离结缔组织可极大改善白细胞的观察效果。
披露
该研究方案已获阿尔弗雷德医学研究与教育园区动物伦理委员会和阿尔弗雷德医院伦理委员会批准。
致谢
本研究部分得到了维多利亚州政府OIS计划、澳大利亚国家健康与医学研究理事会的项目和课题资助（JPF Chin-Dusting）以及研究生奖学金（D Michell）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 注射泵 | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| 数字相机及控制器 | Hamamatsu Corp. | C4742-95 | |
| 荧光照明系统 | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| 血管腔室 | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| 压力伺服控制器及蠕动泵 | Living Systems Instrumentation | PS - 200 | |
| 灌注压力监测仪 | Living Systems Instrumentation | PM - 4 | |
| 2 个压力传感器 | Living Systems Instrumentation | PT - F | |
| 温度控制器 | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| 蠕动泵 | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil 细胞标记溶液 | Invitrogen | V-22885 | 使用比例 1:1000 |
参考文献
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