覆盖派尔集合淋巴结的特殊滤泡相关上皮中的M细胞在肠相关淋巴组织的黏膜免疫监视中发挥重要作用。本文描述了评估M细胞介导细菌转胞吞作用的方法。 体内该方法为研究免疫系统中M细胞的功能提供了一种途径。
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摘要
摘要
我们的肠道内部栖息着数量庞大的共生细菌。胃肠道黏膜表面持续暴露于这些微生物，偶尔也会接触病原体。肠道相关淋巴组织（GALT）在诱导针对这些微生物的黏膜免疫应答中起关键作用1, 2。为了启动黏膜免疫应答，黏膜抗原必须从肠腔穿过上皮屏障，转运至如派尔集合淋巴结（Peyer's patches）等结构化的淋巴滤泡中。这种抗原转胞吞作用由特化的上皮M细胞介导3, 4。M细胞是一类非典型的上皮细胞，能够主动吞噬大分子物质和微生物。与树突状细胞（DCs）和巨噬细胞不同（它们将抗原靶向溶酶体进行降解），M细胞主要将内吞的抗原进行转胞吞。通过M细胞进行的这种高效的大分子转胞吞作用可将抗原递送至下方的结构化淋巴滤泡，被认为对启动抗原特异性的黏膜免疫应答至关重要。然而，促进M细胞摄取抗原的分子机制在很大程度上仍不清楚。我们先前报道过，糖蛋白2（Gp2）在肠上皮细胞中特异性表达于M细胞的顶膜表面，可通过识别细菌外膜I型菌毛组分FimH，作为某些共生和致病肠杆菌（包括Escherichia coli和Salmonella enterica血清型鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium））的转胞吞受体5。本文介绍了一种应用小鼠派尔集合淋巴结肠段结扎环模型评估M细胞摄取细菌的方法。该方法是对先前描述的小鼠肠段结扎环实验的改进版本6, 7。改进之处如下：1. 使用异氟烷作为麻醉剂；2. 建立约1 cm长、包含派尔集合淋巴结的结扎肠段；3. 通过荧光标记试剂或过表达绿色荧光蛋白（GFP）等荧光蛋白对M细胞摄取的细菌进行荧光标记；4. 利用抗Gp2抗体对覆盖派尔集合淋巴结的滤泡相关上皮中的M细胞进行整体免疫染色检测；5. 通过共聚焦显微镜分析观察M细胞介导的荧光标记细菌的转胞吞过程。小鼠派尔集合淋巴结肠段结扎环实验可帮助回答哪些类型的共生或致病细菌能够通过M细胞进行转胞吞，并可能推动我们理解通过M细胞激活黏膜免疫系统的分子机制。
方案
1. 细菌细胞的制备
- 在含有 100 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上划线接种保存在甘油中的荧光标记细菌（例如表达 GFP 的 S. Typhimurium）。
- 挑取单个菌落，接种于 2 ml 新鲜 LB 培养基中，过夜培养。
- 将 0.5 ml 菌液加入 4.5 ml 新鲜 LB 培养基中，培养至 600 nm 处光密度达到 1.0。
- 通过离心收集菌体（3,000 × g，4°C，5 分钟）。
- 弃去上清液，用 5.0 ml 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。
- 将菌体沉淀重悬于 5 ml PBS 中，并取 50 μl 含约 107 菌落形成单位（CFU）的菌悬液作为接种物。
- 若使用荧光标记细菌，应根据标准操作流程使用荧光标记试剂对细菌进行标记。
2. 麻醉
- 用一个小型塑料盒（10 × 10 × 5 cm）装入5%（v/v）异氟烷蒸气与空气的混合气体（流速：200 ml/min）。
- 将8至16周龄的雄性或雌性小鼠放入盒中进行麻醉。
- 麻醉后将小鼠转移至解剖台。
- 通过持续吸入2%（v/v）异氟烷蒸气与空气的混合气体（流速：200 ml/min）维持小鼠麻醉状态（图1
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讨论
结扎派伊尔集合淋巴结与细菌悬液共孵育的时间通常为1小时，以观察细菌被M细胞摄取的情况。若孵育4小时，则常可在派伊尔集合淋巴结的T细胞区检测到细菌。由于气化的异氟烷吸入麻醉可使小鼠保持稳定状态，因此可延长结扎派伊尔集合淋巴结与细菌悬液的孵育时间，以观察进入派伊尔集合淋巴结T细胞区的细菌。本实验的关键在于结扎肠道时需注意避免刮伤血管。若不使用表达GFP的细菌，可改用 commercially available 荧光标记试剂对细菌进行荧光标记。如果所用标记试剂可能抑制目标细菌与M细胞表面分子的结合，则应使用特异性的一抗（如可获得）来检测已进入的细菌。
结扎肠袢实验方法先前已有描述6, 7。我们对该方法进行了如下改进：1. 使用异氟烷作为麻醉剂以保持小鼠稳定。2. 建立包含派尔集合淋巴结（Peyer's patch）的约1 cm长的结扎肠袢。3. 通过荧光标记试剂或过表达如绿色荧光蛋白（GFP）等荧光蛋白，对M细胞摄取的细菌进行荧光标记。4. 利用抗Gp2抗体对覆盖派尔集合淋巴结的滤泡相关上皮中的M细胞进行整体免疫染色检测。5. 通过共聚焦显微镜分析观察M细胞介导的.......
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致谢
作者谨向所有参与开发该技术的EIB成员致以感谢。本研究部分得到了日本文部科学省重点研究领域“膜运输”（H.O.）、“感染现象的网络”（K.H.）、青年科学家项目（S.F. 和 K.H.）、科学研究基金（H.O.），以及创新科学领域“细胞内物流”（H.O.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LB 琼脂 氨苄青霉素-100 | SIGMA | L5667 | |
| Cy3 单反应性染料试剂盒 | GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 羧酸，琥珀酰亚胺酯 | Invitrogen | A10168 | |
| 吸入麻醉装置 | Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| 固定和通透溶液 | BD | 554722 | |
| 抗小鼠糖蛋白2抗体 | MBL | D278-3 | 200倍稀释（5μg/ml） |
| 山羊抗大鼠IgG，F(ab')2片段特异性 | Jackson ImmunoResearch | 112-505-006 | 200倍稀释（20μg/ml） |
| Alexa Fluor 633 鬼笔环肽 | Molecular Probes | A22284 | 50倍稀释 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration 去卷积显微镜 | Applied Precision | DeltaVision Core |
参考文献
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
- Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Scienc....
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