鼠标应用结扎Peyer氏修补肠袢含量评价M细胞的细菌吸收

Summary

在一个专门的卵泡相关Peyer氏斑上皮M细胞在肠道相关淋巴组织的粘膜免疫监视中发挥的重要作用。在这里，我们描述了细菌transcytosis M细胞的评价方法在体内。这种方法提供了一种方法，以了解在免疫系统中的M -细胞功能。

Abstract

我们的肠道内居住的共生细菌的数量巨大。对胃肠道的黏膜表面不断暴露给他们，并偶尔病原体。肠道相关淋巴组织（GALT）为诱导黏膜免疫反应，这些^{微生物1，2}中发挥了关键作用。要启动黏膜免疫反应，粘膜抗原必须运从肠腔整个组织，如Peyer氏斑淋巴滤泡的上皮屏障。这介导的抗原transcytosis是由专门的上皮^M细胞3， 4。 M细胞是非典型的上皮细胞，积极吞噬大分子物质和微生物。 M细胞与树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，靶抗原降解的溶酶体，主要transcytose内在抗原。这种积极通过M细胞的大分子transcytosis提供抗原的根本组织淋巴滤泡D是认为启动抗原特异性黏膜免疫反应的关键。然而，促进M细胞抗原摄取的分子机制在很大程度上是未知的。我们曾报道，糖蛋白2（GP2），特别是肠之间的M细胞的根尖质膜上表示，作为一个transcytotic受体的共生和致病肠杆菌的一个子集，包括大肠杆菌和沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌），通过承认FimH，细菌外膜⁵菌毛类型的组成部分，我。在这里，我们提出了一个鼠标Peyer氏修补肠袢的检测，以评估M细胞的细菌摄取的应用方法。这个方法是鼠标肠袢先前所描述的^6，7含量的改进版本。改进的要点如下:1。异氟醚被用作麻醉剂。 2。约1厘米结扎肠循环includING Peyer氏补丁成立。 3。 M细胞的细菌荧光标记的荧光标记试剂或过度表达的荧光蛋白，如绿色荧光蛋白（GFP）。 4。 M细胞相关的卵泡上皮覆盖Peyer氏补丁与反GP2抗体检测整个安装immunostainig。 5。荧光共聚焦显微镜分析观察M细胞的细菌transcytosis。小鼠Peyer氏补丁肠袢实验可以提供答案，什么样的共生或transcytosed M细胞的致病细菌，并可能导致我们了解如何通过M细胞刺激粘膜免疫系统的分子机制。

Protocol

1。细菌细胞的制备

1. 摆放着数甘油荧光的细菌（如绿色荧光蛋白表达的鼠伤寒沙门氏菌）的LB琼脂平板，含100μg / ml的氨苄青霉素。
2. 文化从单菌落LB琼脂2毫升的新的LB培养基中过夜。
3. 添加0.5毫升细菌培养，直到在600 nm的光密度达到1.0至4.5毫升的新的LB培养基孵育。
4. 收获的细菌细胞，离心（3000 XG，5分钟，4℃）。
5. 弃上清，5.0毫升的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗两次。
6. 5毫升的PBS重悬菌体，并用50μL暂停接种含有约¹⁰ 7菌落形成单位（CFU） 。
7. 在使用荧光标记的细菌的情况下，细菌细胞标记的荧光标记试剂，根据标准协议。

2。一nesthesia

1. 5％（V / V）填充一个小塑料盒（10 × 10 × 5厘米），蒸发异氟醚（流量:200毫升/分钟）与空气混合。
2. 麻醉八个弱十六岁的男性或女性在框中小鼠。
3. 麻醉后，将小鼠进行尸检表。
4. 不断麻醉2％（V / V）的小鼠异氟醚蒸发与空气混合（流量:200毫升/分钟）（ 图1）。这是一个终端程序。

3。结扎Peyer氏补丁循环检测

1. 腹部皮肤，然后切开1厘米削减麻醉小鼠的腹腔腹膜，取出小肠Peyer氏补丁。
2. 结扎肠道缝纫纱，照顾，以避免血管。注:只能绑定一个侧面的肠道，并留下对方松动。
3. 宽松的小号50μL菌悬液或PBS（对照组）用注射器注入结扎Peyer氏补丁循环肠道IDE（ 图2）。
4. 绑定宽松的一面，并关闭鼠标的腹部剪辑。
5. 1小时后，取出结扎Peyer氏补丁循环，安乐死颈椎脱位鼠标。
6. 海关Peyer氏补丁结扎Peyer氏补丁循环。
7. 闪烁的PBS1毫升Peyer氏补丁根尖使用注射器针，去除多余的粘膜液体和细菌。一个额外的两次闪烁Peyer氏补丁。

4。 Peyer氏补丁整装染色和激光共聚焦显微镜分析

1. Peyer氏补丁修复BD Cytofix / Cytoperm冰1小时解决方案。
2. 屋宇署权限/洗5分钟缓冲1毫升Peyer氏补丁洗净三次和然后块1毫升阻止包含0.1％（W / V）皂甙，0.2％（W ​​/ V）BSA的PBS 30分钟就缓冲冰。
3. 加入200倍稀释的抗鼠GP2的单克隆抗体（5微克/毫升）标本检测M细胞。
4. 在室温下2小时或过夜孵育4 ° C。
5. 1毫升冷PBS洗三次，再加入200倍稀释的抗鼠IgG抗体DyLight549（20微克/毫升）的标本共轭。
6. 孵育2小时的冰样本。
7. 1毫升冷PBS洗三次，然后加入50倍稀释Alexa的633标记的鬼笔环肽标本检测F -肌动蛋白。
8. 在冰上孵育2小时。
9. 1毫升冷PBS轻轻冲洗。然后放置在三到四个圆形玻璃盖片，幻灯片和嵌入的标本中30％的甘油PBS溶液幻灯片上（ 图3）。
10. 一个DM - IRE2共聚焦激光扫描显微镜或DeltaVision恢复反卷积显微镜观察标本。

5。代表性的成果:

鼠标的标本例如结扎Peyer氏修补与绿色荧光蛋白伤寒的循环实验murium观察与DeltaVision恢复反卷积显微镜（ 图4）。 GFP的鼠伤寒沙门氏菌是transcytosed由GP2 ⁺ M细胞。可以由M细胞transcytosed的小鼠Peyer氏修补肠袢检测可以识别的一种共生或致病菌。

图1。蒸发异氟醚条件下小鼠的麻醉。汽化异氟醚麻醉专用器具（左侧）提供。

图2。结扎Peyer氏修补肠袢实验总结。荧光菌悬液通过注射器注入肠道松边结扎Peyer氏补丁循环。

图4。结扎Peyer氏修补与GFP的鼠伤寒沙门氏菌循环实验鼠标的例子。 GP2的，这是M细胞特异性标志物⁵报道，染色试样抗鼠GP2的抗体（红色）。与DeltaVision恢复反卷积显微镜观察。 GFP的表达鼠伤寒沙门氏菌是共同本地化与GP2的M细胞的顶质膜和subapical细胞质囊泡（箭头） 。顶，根尖的看法。底部和侧面，外侧意见。比例尺:10微米。

Discussion

结扎Peyer氏菌悬液的补丁的孵化时间通常为1小时观察到M细胞的细菌掺入。在4小时孵化的情况下，细菌往往检测Peyer氏斑的T细胞区。由于蒸发异氟醚吸入麻醉小鼠保持稳定，结扎Peyer氏菌悬液的补丁的孵化时间可延长至观察T细胞Peyer氏补丁区移动的细菌。这个实验的重要的一点是要小心，不要划伤血管结扎肠道时。在不使用GFP表达的细菌的情况下，我们也可以选择使用商业荧光标记试剂荧光标记的细菌。如果试剂可能抑制细菌，你要使用的，附件M细胞上表达的分子，你应该使用特定的抗体，如果有的话，检测纳入细菌。

ontent"的结扎循环检测方法以前描述^6，7我们改善如下一些这种方法:。。。1异氟醚是一个保持小鼠稳定2的麻醉剂使用约1厘米结扎肠袢包括Peyer氏。补丁是成立3。M细胞在细菌是荧光由荧光标签的试剂或过度表达如GFP荧光蛋白标记。4。的卵泡，相关的覆盖Peyer氏补丁上皮M细胞是检测整体的贴装immunostainig与反GP2抗体5。M细胞的荧光细菌transcytosis共聚焦显微镜分析观察。

我们和其他人表现出不同的异种抗原，积极争取进入M...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
LB琼脂氨苄青霉素 100	西格玛	L5667
Cy3标记单反应 染料包	GE医疗集团	PA23001
的Alexa Fluor 350 羧酸， 琥珀酰亚胺酯	Invitrogen公司	A10168
吸入麻醉 仪器	信浓制作所	SN - 487
固定和 通透 解决方案	屋宇署	554722
抗鼠 糖蛋白2 抗体	MBL	D278 - 3	200倍稀释液（5μg/ml）
羊抗鼠IgG， F（AB'）2片段 具体	杰克逊 ImmunoResearch	112-505-006	200倍稀释液（20μg/ml）
的Alexa Fluor 633 鬼笔环肽	分子探针	A22284	50倍稀释
激光共聚焦 扫描显微镜	徕卡显微系统	DMIRE2
DeltaVision 恢复 反卷积 显微镜	应用精密	DeltaVision核心