覆盖派尔集合淋巴结的特殊滤泡相关上皮中的M细胞在肠相关淋巴组织的黏膜免疫监视中发挥重要作用。本文描述了评估M细胞介导细菌转胞吞作用的方法。 体内该方法为研究免疫系统中M细胞的功能提供了一种途径。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
我们的肠道内部栖息着数量庞大的共生细菌。胃肠道黏膜表面持续暴露于这些微生物，偶尔也会接触病原体。肠道相关淋巴组织（GALT）在诱导针对这些微生物的黏膜免疫应答中起关键作用1, 2。为了启动黏膜免疫应答，黏膜抗原必须从肠腔穿过上皮屏障，转运至如派尔集合淋巴结（Peyer's patches）等结构化的淋巴滤泡中。这种抗原转胞吞作用由特化的上皮M细胞介导3, 4。M细胞是一类非典型的上皮细胞，能够主动吞噬大分子物质和微生物。与树突状细胞（DCs）和巨噬细胞不同（它们将抗原靶向溶酶体进行降解），M细胞主要将内吞的抗原进行转胞吞。通过M细胞进行的这种高效的大分子转胞吞作用可将抗原递送至下方的结构化淋巴滤泡，被认为对启动抗原特异性的黏膜免疫应答至关重要。然而，促进M细胞摄取抗原的分子机制在很大程度上仍不清楚。我们先前报道过，糖蛋白2（Gp2）在肠上皮细胞中特异性表达于M细胞的顶膜表面，可通过识别细菌外膜I型菌毛组分FimH，作为某些共生和致病肠杆菌（包括Escherichia coli和Salmonella enterica血清型鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium））的转胞吞受体5。本文介绍了一种应用小鼠派尔集合淋巴结肠段结扎环模型评估M细胞摄取细菌的方法。该方法是对先前描述的小鼠肠段结扎环实验的改进版本6, 7。改进之处如下：1. 使用异氟烷作为麻醉剂；2. 建立约1 cm长、包含派尔集合淋巴结的结扎肠段；3. 通过荧光标记试剂或过表达绿色荧光蛋白（GFP）等荧光蛋白对M细胞摄取的细菌进行荧光标记；4. 利用抗Gp2抗体对覆盖派尔集合淋巴结的滤泡相关上皮中的M细胞进行整体免疫染色检测；5. 通过共聚焦显微镜分析观察M细胞介导的荧光标记细菌的转胞吞过程。小鼠派尔集合淋巴结肠段结扎环实验可帮助回答哪些类型的共生或致病细菌能够通过M细胞进行转胞吞，并可能推动我们理解通过M细胞激活黏膜免疫系统的分子机制。
方案
1. 细菌细胞的制备
- 在含有 100 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上划线接种保存在甘油中的荧光标记细菌（例如表达 GFP 的 S. Typhimurium）。
- 挑取单个菌落，接种于 2 ml 新鲜 LB 培养基中，过夜培养。
- 将 0.5 ml 菌液加入 4.5 ml 新鲜 LB 培养基中，培养至 600 nm 处光密度达到 1.0。
- 通过离心收集菌体（3,000 × g，4°C，5 分钟）。
- 弃去上清液，用 5.0 ml 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。
- 将菌体沉淀重悬于 5 ml PBS 中，并取 50 μl 含约 107 菌落形成单位（CFU）的菌悬液作为接种物。
- 若使用荧光标记细菌，应根据标准操作流程使用荧光标记试剂对细菌进行标记。
2. 麻醉
- 用一个小型塑料盒（10 × 10 × 5 cm）装入5%（v/v）异氟烷蒸气与空气的混合气体（流速：200 ml/min）。
- 将8至16周龄的雄性或雌性小鼠放入盒中进行麻醉。
- 麻醉后将小鼠转移至解剖台。
- 通过持续吸入2%（v/v）异氟烷蒸气与空气的混合气体（流速：200 ml/min）维持小鼠麻醉状态（图1）。此为终末性操作。
3. 结扎派伊尔集合淋巴结环实验
- 切开麻醉小鼠腹部皮肤约1厘米，随后剪开腹膜，取出含有派伊尔结的小肠组织。
- 用缝合线结扎肠段，注意避开血管。注意：仅结扎肠段的一端，另一端保持开放。
- 使用注射器将50 μl细菌悬液或PBS（对照）从肠段开放端注入结扎的派伊尔结肠袢中（图2）。
- 结扎开放端，用夹子关闭小鼠腹部切口。
- 1小时后，取出结扎的派伊尔结肠袢，并通过颈椎脱臼法处死小鼠。
- 从结扎的派伊尔结肠袢中分离出派伊尔结组织。
- 使用连接针头的注射器向派伊尔结的顶端表面冲洗1 ml PBS，以去除多余的黏膜液体和细菌；再重复冲洗两次。
4. 派尔集合淋巴结的全组织染色与共聚焦显微镜分析
- 将派伊尔集合淋巴结置于冰上，用BD Cytofix/Cytoperm固定液固定1小时。
- 用1 ml BD Perm/Wash缓冲液冰上洗涤派伊尔集合淋巴结3次，每次5分钟，然后加入含0.1% (w/v) 皂苷和0.2% (w/v) BSA的PBS封闭缓冲液1 ml，冰上封闭30分钟。
- 向样本中加入200倍稀释的小鼠抗GP2单克隆抗体（5 μg/ml），用于检测M细胞。
- 室温孵育2小时，或4°C过夜孵育。
- 用1 ml冷PBS洗涤3次，然后向样本中加入200倍稀释的DyLight549标记的抗大鼠IgG抗体（20 μg/ml）。
- 样本在冰上孵育2小时。
- 用1 ml冷PBS洗涤3次，然后向样本中加入50倍稀释的Alexa 633标记的鬼笔环肽，用于检测F-肌动蛋白。
- 在冰上孵育2小时。
- 用1 ml冷PBS轻轻洗涤。然后在载玻片上放置三至四片圆形盖玻片，将样本置于含30%甘油的PBS溶液中封片（图3）。
- 使用DM-IRE2共聚焦激光扫描显微镜或DeltaVision Restoration去卷积显微镜观察样本。
5. 代表性结果：
通过DeltaVision显微镜去卷积成像系统观察了小鼠结扎派伊尔集合淋巴结环模型中GFP-S. Typhimurium的示例标本（图4）。GFP-S. Typhimurium可被GP2+M细胞转胞吞。小鼠派伊尔集合淋巴结肠段环模型实验可用于鉴定哪些共生菌或致病菌可被M细胞转胞吞。
图 1. 在异氟烷气体麻醉条件下对小鼠进行麻醉。异氟烷气体由专用麻醉设备（左侧）提供。
图 2. 结扎派伊尔结肠段实验流程示意图。通过注射器将荧光标记的细菌悬液注入肠管松弛侧的结扎派伊尔结肠段中。
图 3. 标本的安装。将标本置于一种特制载玻片上的PBS甘油溶液（30%）中，该载玻片由一层1 mm厚的带孔塑料板通过粘合剂固定在玻璃载片上构成。
图 4. 小鼠结扎派伊尔集合淋巴结环实验示例，使用GFP标记的S. Typhimurium。GP2被报道为M细胞特异性标志物5，用抗小鼠GP2抗体（红色）染色。标本使用DeltaVision Restoration去卷积显微镜观察。表达GFP的S. Typhimurium与M细胞顶端质膜及亚顶端胞质囊泡中的GP2共定位（箭头）。上方为顶端视图，下方和侧面为侧向视图。比例尺：10 μm。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
结扎派伊尔集合淋巴结与细菌悬液共孵育的时间通常为1小时，以观察细菌被M细胞摄取的情况。若孵育4小时，则常可在派伊尔集合淋巴结的T细胞区检测到细菌。由于气化的异氟烷吸入麻醉可使小鼠保持稳定状态，因此可延长结扎派伊尔集合淋巴结与细菌悬液的孵育时间，以观察进入派伊尔集合淋巴结T细胞区的细菌。本实验的关键在于结扎肠道时需注意避免刮伤血管。若不使用表达GFP的细菌，可改用 commercially available 荧光标记试剂对细菌进行荧光标记。如果所用标记试剂可能抑制目标细菌与M细胞表面分子的结合，则应使用特异性的一抗（如可获得）来检测已进入的细菌。
结扎肠袢实验方法先前已有描述6, 7。我们对该方法进行了如下改进：1. 使用异氟烷作为麻醉剂以保持小鼠稳定。2. 建立包含派尔集合淋巴结（Peyer's patch）的约1 cm长的结扎肠袢。3. 通过荧光标记试剂或过表达如绿色荧光蛋白（GFP）等荧光蛋白，对M细胞摄取的细菌进行荧光标记。4. 利用抗Gp2抗体对覆盖派尔集合淋巴结的滤泡相关上皮中的M细胞进行整体免疫染色检测。5. 通过共聚焦显微镜分析观察M细胞介导的...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
作者谨向所有参与开发该技术的EIB成员致以感谢。本研究部分得到了日本文部科学省重点研究领域“膜运输”（H.O.）、“感染现象的网络”（K.H.）、青年科学家项目（S.F. 和 K.H.）、科学研究基金（H.O.），以及创新科学领域“细胞内物流”（H.O.）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LB 琼脂 氨苄青霉素-100 | SIGMA | L5667 | |
| Cy3 单反应性染料试剂盒 | GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 羧酸，琥珀酰亚胺酯 | Invitrogen | A10168 | |
| 吸入麻醉装置 | Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| 固定和通透溶液 | BD | 554722 | |
| 抗小鼠糖蛋白2抗体 | MBL | D278-3 | 200倍稀释（5μg/ml） |
| 山羊抗大鼠IgG，F(ab')2片段特异性 | Jackson ImmunoResearch | 112-505-006 | 200倍稀释（20μg/ml） |
| Alexa Fluor 633 鬼笔环肽 | Molecular Probes | A22284 | 50倍稀释 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration 去卷积显微镜 | Applied Precision | DeltaVision Core |
参考文献
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
- Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
- Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
- Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
- Hase, K. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, 226-230 (2009).
- Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops. Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).
- Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. Jr M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration. J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).
- Owen, R. L. M cells--entryways of opportunity for enteropathogens. J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).
- Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells. Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).
- Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches. Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).
- Nagai, S. Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
