高通量木质纤维素材料糖化分析方法

摘要

本文介绍了一种简单、快速测定大量植物生物质样品糖化潜力的方法。该分析的自动化平台包括在96孔板中制备植物生物质样品，并依次进行预处理、水解以及对释放糖分的定量分析。

摘要

构成植物木质纤维素生物质的多糖可被降解为多种糖类，进而可用于建立生物炼制厂。这些原材料将构成一种新的工业平台，兼具可持续性和碳中和特性，以替代当前对化石燃料的依赖。木质纤维素材料在降解过程中表现出的抗性，源于植物细胞壁的多种内在特性。结晶纤维素嵌入于木聚糖和阿拉伯木聚糖等基质多糖中，而整个结构则被难以降解的酚类聚合物木质素所包裹¹。为了提高植物材料的可消化性，我们需要识别细胞壁糖化过程中的主要限制因素，并筛选突变体和育种种群，以评估糖化能力的变异情况²。这些任务需要高通量的方法，本文介绍了一种可在96孔板中进行糖化分析的分析平台。该平台旨在实现对多种植物物种的大群体进行木质纤维素可消化性的高通量筛选。我们已缩小了温和预处理、部分酶解及糖含量测定等步骤的反应体积，以便在自动化系统中快速评估大量样本。

该自动化平台可处理毫克量级的生物质样品，在受控条件下进行球磨处理，以可重复的方式将植物材料研磨至标准化的粒径。样品研磨完成后，自动化分装机器人会将指定且记录好的样品量分装至96深孔板的相应孔中（图1）。通常情况下，我们会将同一样品分装至4个孔中，以获得4个用于分析的重复孔。当深孔板按所需布局填满植物材料后，由人工将其转移至液体处理工作站（图2）。在该工作站中，样品会接受温和的稀酸或碱性预处理，并在最高达90°C的温度下孵育。随后去除预处理溶液，并用缓冲液清洗样品，使其pH值恢复至适合水解的范围。接着，样品在50°C下与酶混合液孵育一定可变时间。从水解产物中取出等分试样，采用MBTH比色法自动测定还原糖含量。

方案

1. 样品制备

我们通常使用草本或木本植物的茎。对于草本材料，我们先将植物培育至成熟，种子发育完成后，在植株完全衰老时采集干燥的茎。将茎切成4 mm的片段，放入含有三个研磨珠的2 ml小瓶中。对于木本材料，先用粗齿钢锉将样品研磨成粗锯末，然后放入球磨仪中进行进一步处理。

将样品放置于研磨/定量工作站内的样品架中（图1）。该工作站依次对每个样品进行研磨、混匀和称重。每个样品所需的重复次数需通过一系列预实验确定，以评估特定粒径下样品的内在变异性。2 mL样品瓶从底部被穿刺，通过振动样品瓶将材料分配至选定的孔中。振动臂由天平反馈信号控制，从而实现粉末的精确分配。在标准分析中，机器人每孔分配4 mg样品，大多数情况下需要进行4次重复。由此可实现每块板分析20个植物样品。

2. 预处理

样品制备完成后，使用自动化液体处理系统对96孔板进行处理（图2）。在此过程中，通过向植物材料中加入350 μL的酸性或碱性溶液，并在适配的加热块上加热，对其进行温和预处理。为避免分析过程中发生蒸发，使用硅胶垫片密封96孔板。预处理的温度和时间可根据所研究的材料进行调整，但最高温度不得超过100 °C。若需测试更剧烈的预处理条件，可采用替代方案：在体系外进行材料预处理，从而将预处理步骤从主流程中移除。

3. 水解

1. 材料经预处理后，机器人自动移除预处理溶液，并用850 μL的25 mM乙酸盐缓冲液对所有孔进行5次洗涤。洗涤过程通过将缓冲液加入预处理溶液中实现，待样品中的固体沉降后，移除总体积的50%。吸液高度设定为液体质量的一半，以避免从孔底吸入固体；采用此方法可使固体损失极小。经过上述洗涤后，孔内pH值为4.5，材料已准备好进行酶解水解。
2. 机器人加入含有纤维素酶和半纤维素酶的酶混合液。每个孔中加入850 μL酶混合液，随后将酶标板转移至50 °C的摇动培养箱中。标准水解时间为8小时，但可根据实验目的调整。用于草类材料的标准酶添加量为每克材料7 FPU。

4. 还原糖的检测

采用改良的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙（MTBH）法测定水解后释放的还原糖含量³。选择MBTH法作为最适宜的方法，因其最易于实现自动化，且受蛋白质等化合物干扰的可能性最小。我们对该高灵敏度方法进行了改进，以适用于机器人平台，使其能够准确定量生物质水解液中糖的浓度，最终反应体积为250 μL，适用于标准光学96孔板。以下所有步骤均自动完成，每种糖化反应均进行三次独立的还原糖测定。

1. 从深孔板中取出 30 μL 水解产物，加入到带裙边的 96 孔 PCR 板中，与 45 μL 25 mM 醋酸钠缓冲液混合。
2. 加入 25 μL 1N NaOH 和 50 μL 含有 0.43 mg/mL MBTH 与 0.14 mg/mL DTT 的溶液。
3. 混匀后，将 PCR 板置于热循环仪或能向全部 96 个孔均匀传热的类似设备中，在 60°C 下加热 20 分钟。
4. 将反应产物转移至光学检测板中。
5. 加入 100 μL 氧化试剂（0.2% FeNH4(SO4)2、0.2% 亚磺酸、0.1% HCl），充分混匀，并静置至少 1 小时以显色。
6. 每块板还应包含 50 nmol、100 nmol 和 150 nmol 葡萄糖的标准反应。光学板在 620 nm 处读取吸光值。

5. 典型结果：

图3和图4展示了不同类型分析的示例。所有结果均通过自动化平台获得。图3显示了在8小时孵育过程中，随着纤维素酶用量的增加，粉碎后的杨木释放出的还原糖量相应增加。图4展示了酸性和碱性预处理对杨木样品的影响。在促进水解过程中糖的释放方面，NaOH预处理比稀释的H2SO4预处理更有效。当NaOH浓度高于1 M时，预处理后测得的水解糖量减少。

图 1. 用于生物质研磨及96孔板格式化的机器人工作站

图2. 高通量糖化分析用液体处理工作站

图3. 不同酶添加量对杨木样品中还原糖当量释放的影响

图 4. 不同预处理对杨木样品糖化的影响。A. 在90°C下用不同浓度的H2SO4处理30分钟后释放的糖量。B. 在与酸处理相同的温度和时间条件下，经NaOH预处理后释放的糖量。

讨论

标准糖化方案的多种变体可在同一平台上用于测定纤维素降解酶的活性（例如，通过改变微孔板中所用酶的浓度，或使用滤纸作为底物）；比较多种酶混合物在特定材料上的降解效率；糖化过程的时间进程研究等。

一种用于比较不同植物材料中糖化潜力的标准糖化方案，包括8小时的水解过程（图3和图4）。大多数被分析的植物材料需要四个重复。在此条件下，该平台每天可处理80个样品。该分析正被用于筛选大麦、玉米和短柄草的大群体，以确定糖化潜力的变异及其相关基因⁴。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
研磨 & 称重机器人	Labman Automation
带盖的 2 ml 微量离心管	Sarstedt有限公司	72.694
5 mm不锈钢珠	Qiagen	69989
1.2 ml Abgene 方孔储存板	Fisher Scientific	TUL-050-050C
96 孔方孔板用 Whatman 封口膜	Fisher Scientific	7704-0104
液体处理机器人	Tecan集团有限公司	Freedom Evo 200
硫酸	Fisher Scientific	S/9231/PB17
氢氧化钠	Fisher Scientific	BPE359-500
乙酸钠	Sigma-Aldrich	S8750-500G
乙酸	Fisher Scientific	A/0420/PB17
Novozyme 188	Novozyme	DCN00214
Celluclast 1.5L	Novozyme	CCN03122
96孔PCR全裙边板	Sarstedt有限公司	72.1980.202
D-葡萄糖	Fisher Scientific	G/0450/53
3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物	Sigma-Aldrich	129739-25G
DL-二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	D9163-1G
康宁96孔平底微孔板	Fisher Scientific	TKT-521-050H
十二水合硫酸铁(III)铵	Sigma-Aldrich	F1668-250G
磺基酸	Sigma-Aldrich	242772-500G
盐酸	Fisher Scientific	12462-0026