在感染过程中，一个关键步骤是病原体与宿主细胞之间的黏附。大多数情况下，这种黏附过程发生在流动液体所产生的机械应力环境中。本文介绍一种将剪切应力作为重要参数用于研究细菌黏附的技术。
本文内容
摘要
摘要
在细菌感染过程中，病原体与其宿主之间会发生一系列相互作用。细菌对宿主细胞表面的黏附通常是致病过程的初始且决定性步骤。尽管实验上黏附作用大多在静态条件下进行研究，但实际上黏附发生在液体流动的环境中。细菌与其宿主的初次接触通常发生在黏膜层面，如口腔、肺部、肠道、眼睛等部位，这些区域的黏液沿着上皮细胞表面流动。在感染后期，病原体有时会进入血液循环，引发危及生命的疾病，例如败血症、脓毒症和脑膜炎。这些感染的一个显著特征是病原体能够在血液流动的条件下与内皮细胞相互作用。流动液体（如黏液或血液）的存在决定了黏附过程，因为它会对病原体施加机械力。为了表征流动液体的影响，通常会参考剪切应力（shear stress）这一概念，即流体在静止壁面附近单位面积上施加的切向力，单位为达因/平方厘米（dynes/cm2）。剪切应力的强度因血管类型、大小、器官和位置等因素而异（0–100 dynes/cm2）。毛细血管中的血流可达到极低的剪切应力值，甚至在数秒至数分钟的时间段内暂时停止1。而在另一端，微动脉中的剪切应力可高达100 dynes/cm22。剪切应力对多种生物过程的影响已有明确报道，例如白细胞与内皮细胞之间的相互作用3。为了在细菌黏附过程中考虑这一力学参数，我们采用了一种基于一次性流动腔室的实验方法4。将宿主细胞培养于流动腔室内，通过注射泵控制流速，引入荧光标记的细菌。我们最初的研究聚焦于细菌病原体Neisseria meningitidis，这是一种革兰氏阴性菌，可导致败血症和脑膜炎。此处描述的方法使我们能够研究剪切应力对细菌能力的影响，包括：黏附于细胞1、在细胞表面增殖5以及脱离并定植新位点6（图1）。更多技术细节可参见参考文献7。本文所采用的剪切应力值基于我们以往的经验1，并参考了文献中报道的典型数值。本方案适用于多种病原体的研究，具体操作可根据研究目标进行相应调整。
方案
1. 人类宿主细胞与细菌培养
- 将 HUVECs 在 37°C、含 5% (v/v) CO2 的湿润培养箱中培养，传代次数控制在 1 至 9 代之间。当细胞融合度接近 80% 时，使用胰蛋白酶/EDTA 进行消化传代，用于在 75 cm2 培养瓶中维持培养，或在一次性流动小室（μ-Slides VI）中进行实验培养。
- 吸除待传代培养瓶中的培养基，用 10 ml PBS 洗涤细胞，吸除 PBS 后加入 1.5 ml 胰蛋白酶/EDTA。将细胞置于细胞培养箱中，在 37°C 下孵育 5 分钟，使细胞脱落。
- 用 10 ml 细胞培养基收集细胞至 15 ml 离心管中。在室温下以 200 g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。将细胞重悬于 4 ml 含 10% (v/v) FBS 的 Endo-SFM 培养基中，并按照制造商说明，使用 Malassez 计数板进行细胞计数。
- 将 30 μl 含 1×106 个 HUVEC 细胞/ml 的细胞悬液加入通道中（共 3×104 个细胞），在 37°C、含 5% (v/v) CO2 的湿润培养箱中孵育 3 小时，使细胞贴壁。随后加入额外的 120 μl Endo-SFM 培养基以充满小室。细胞应形成亚融合的单层（图 2）。
- 在含 Kellogg 补充剂和 5 μg/ml 氯霉素的 GCB 琼脂平板上，于 37°C、含 5% (v/v) CO2 的湿润环境中培养表达 GFP 的 N. meningitidis（本实验中为在 IPTG 诱导型启动子调控下表达 GFP 的菌株 8013），培养 16 小时。
2. 细菌个体对宿主细胞的初始黏附
- 将GCB琼脂平板上培养的细菌用预热的含10% (v/v) 胎牛血清（FBS）的Endo-SFM调整至OD600为0.05，并在37°C、含5% (v/v) CO2的湿润环境中，以130 rpm轻柔振荡培养120分钟。在整个培养期间，通过向培养基中添加1 mM IPTG诱导GFP表达。
- 将一次性μ-Slide放置在配有加热平台的倒置显微镜载物台上，以维持样品温度在37°C。
- 将预热的含2% (v/v) FBS的Endo-SFM倒入无菌玻璃烧杯中，并用该培养基填充无菌50 ml注射器。将“入口”管路连接至注射器，并注入培养基将其充满。
- 小心地将“入口”管路连接至μ-Slide，避免将空气引入腔室。随后，将“出口”管路连接至另一端，并缓慢用培养基填充通道，直至距离腔室“出口”约1 cm处。
- 测定细菌的OD600，并用含2% (v/v) FBS的Endo-SFM调整至0.15。为观察单个细菌，需通过剧烈涡旋处理细菌样品以彻底分散任何聚集体。
- 向储液池中加入100 μl含2% (v/v) FBS的Endo-SFM培养基，并从涡旋后溶液的上层取100 μl细菌悬液加入，以避免取到残留的细菌聚集体。
- 通过旋转旋塞阀，将200 μl体积的细菌悬液小心注入μ-Slide腔室中。
- 使用注射泵将维持在37°C的含2% (v/v) FBS的Endo-SFM以0.044 dynes/cm2的剪切应力（适用于细菌黏附）引入腔室，持续15分钟。
例如，参见视频1或图3。完成此步骤后，可转至第3、4或6节。
3. 单个细菌对宿主细胞初始黏附的定量分析
- 初始黏附15分钟后，在液体仍在循环时随机获取十个视野的图像。
- 使用 ImageJ 软件8分析所获取的图像，以计算每个视野中平均黏附的细菌数量。具体操作如下：首先，在“图像”菜单中的“阈值”（Threshold）窗口对每张图像进行阈值处理，以突出显示单个黏附的荧光细菌，同时尽量减少细胞背景的干扰。然后，使用插件“Cell Counter”（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html）对每个细菌进行计数。将每幅图像的数据记录在 Excel 电子表格中，并计算平均值，以定量每个视野中黏附细菌的平均数量。
4. 测定单个细菌黏附于宿主细胞后对流动的抗性
- 设置注射泵系统，以产生 3 至 100 dynes/cm2 的剪切应力，持续 5 分钟。
- 5 分钟结束后，随机选取十个视野进行图像采集（方法如步骤 3.1 所述），但在采集前需停止流动。
- 按照步骤 3.2 所述方法分析所采集的图像，并量化每个视野中残留细菌的平均数量。
5. 测量单个贴壁细菌生长至微菌落的过程
- 使用注射泵将含有10% (v/v) FBS、并在加热平台上维持于37°C的Endo-SFM引入腔室，施加选定的剪切应力持续数小时。每5分钟采集一帧图像，用于实时视频显微观察。
- 完成视频显微观察后，关闭注射泵以停止施加剪切应力，再采集2-3张附加图像，随后在软件中停止图像采集程序。视频2展示了细菌增殖的一个示例。
6. 测定粘附性细菌微菌落的流动阻力
- 在细胞表面形成较大的微菌落（步骤5.2）后，在施加流动之前，先通过相差显微镜获取细胞图像，并通过GFP荧光获取细菌图像，各拍摄2-3张。在后续实验中，成像方案将仅监测荧光信号。
- 施加高剪切应力5分钟（3-100 dynes/cm2），每5秒记录一帧图像。
- 通过关闭注射泵停止剪切应力，再获取2-3张附加图像，然后在软件中停止图像采集序列。
- 接下来，首先小心移除“出口”管路，避免通道排空，然后加入预热的新鲜培养基以填充小室，再移除“入口”管路。
- 为了定量确定剪切应力对细菌抗性的影响，可进行平板培养实验：收集剩余培养基，并用120 μl PBS洗涤μ-Slide两次，以清除通道中残留的培养基（两次洗涤液也需一并收集）。
- 加入50 μl胰蛋白酶/EDTA，在37°C孵育5分钟以解离感染的细胞，并将解离后的细胞样品与上一步收集的悬浮液混合。
- 在PBS中进行系列稀释，取10 μl稀释液，每种稀释度设三个重复，接种于GCB琼脂平板上，37°C、5% (v/v) CO2培养箱中孵育，次日计数菌落形成单位（CFU）。
视频3和视频4比较了野生型菌株与pilV突变株。
7. 微菌落中细菌的脱离
- 通过重复步骤 2.1 至 2.8，在流室中感染细胞，并使感染持续 30 分钟。
- 将流速提高至 10 dynes/cm2，持续 2 分钟，以去除未结合的细菌，随后继续感染 2 小时。
- 将流速降低至 0.15 dynes/cm2。
- 每小时收集一滴从流室中流出的培养基。
- 对样品进行连续稀释，并接种至 GCB 琼脂平板上。
- 将平板置于含 5% (v/v) CO2 的培养箱中，37°C 培养过夜后，于次日测定菌落形成单位（CFU）数量。
8. 典型结果
图1： 在流动条件下可观察和测量的细胞单层不同阶段。
图 2： 实验开始时流动腔室中的内皮细胞单层（无剪切应力）。约 50 个内皮细胞排列成亚融合单层。
图 3： 细菌在细胞表面初始黏附的图示。显示了三个视野的数据，用以反映预期的视野间变异（0,044 dynes/cm2）。
视频 1. 细菌在细胞单层上初始黏附随时间变化的可视化（0.044 dynes/cm2）。表达GFP的细菌随流动培养基方向移动。视频加速60倍，实际时长为10分钟。
点击此处观看视频。
视频 2. 细菌在细胞表面初始黏附后，允许其增殖 7 小时（加速 1000 倍）。
点击此处观看视频。
视频 3. 在细胞表面增殖后，通过将剪切应力水平提高至 10 dynes/cm2 持续 5 分钟，测试微菌落的机械抗性，但野生型微菌落可耐受高达 60 倍的加速剪切应力。
点击此处观看视频。
视频 4. pilV 突变株形成的微菌落会因流速增加（10 dynes/cm2）而被破坏。该突变株无法诱导微菌落下细胞质膜的重塑，因此对剪切应力的增加更为敏感（视频加速 60 倍）5。
点击此处观看视频。
讨论
剪切应力以及力学因素在生物学中的重要性正日益受到重视。例如，在引入剪切应力的条件下，已发现选择素（Selectin）蛋白家族在淋巴细胞黏附并沿血管壁滚动过程中的高度适应性黏附特性。上述方法已应用于革兰氏阴性菌 Neisseria meningitidis，但也应适用于多种其他病原体。剪切应力的重要性在其他病原体及感染部位的研究中也已得到证实。由尿路致病性大肠杆菌（Escherichia coli, UPEC）表面的FimH黏附素介导的细菌黏附过程即是在剪切应力条件下被揭示的9。与选择素类似，FimH与其宿主细胞受体之间的相互作用被剪切力诱导的机械力所增强9，而肠毒素型大肠杆菌（E.coli）的CfaE黏附素也被报道通过依赖剪切力的机制介导其与肠上皮细胞的黏附10。我们曾利用本章节所述的层流 chamber 实验方案报道，无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的菌毛在该病原体于流动条件下黏附上皮细胞的过程中起着关键作用11。此类研究证实，我们的流动 chamber 实验是一种研究剪切应力条件下宿主细胞与病原体相互作用的有效工具。
致谢
作者感谢Emilie Mairey和Emmanuel Donnadieu在本实验方案初始建立过程中提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| μ-Slide VI0.4 流体实验套件 | IBIDI | 80606 | |
| 50 ml 鲁尔锁注射器 Plastipak | BD Biosciences | 300865 | |
| Tygon R3603 软管 3.2 × 4.8 mm | Fisher Scientific | R3603 | |
| 三通旋塞阀，两母鲁尔接头转一公鲁尔接头 | Bio-Rad | 7328103 | |
| 注射泵 | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| 倒置显微镜，Nikon | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| CCD 相机 | Hamamatsu Corp. | ORCA 285 CCD 或 ORCA 3-CCD | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | 免费软件 (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |
参考文献
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