经鼻移植人诱导性多能干细胞来源的小胶质细胞至小鼠脑内

摘要

本视频展示了将诱导多能干细胞来源的人源小胶质细胞（iPSMG）通过鼻腔途径移植到小鼠脑内的过程。在小胶质细胞耗竭的小鼠鼻腔内施用透明质酸酶以增强通透性，随后经鼻腔给予iPSMG悬液，并让小鼠恢复。定期给予富含生长因子的培养基，以支持iPSMG在脑组织中的存活。

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 细胞培养基、移植培养基和麻醉混合物的制备

2. 诱导性多能干细胞来源的人小胶质细胞（iPSMG）的制备

注意： 冻存的iPSMG（材料表）在使用前保存于-80 °C。

将冻存的细胞在37 °C水浴中快速解冻。轻轻摇动样品，直至所有可见冰晶完全融化。
将解冻后的诱导多能干细胞来源的人源小胶质细胞（iPSMG）加入预热至37 °C的培养基中。取1 mL含解冻细胞的培养液（含1 × 10⁶个细胞），加入10 mL培养基中。
以300 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。
离心后，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。建议彻底去除上清液，以减少对移植介质中细胞因子浓度的稀释。
加入移植介质，调整细胞浓度至1 × 10⁵ 个细胞/µL。
将iPSMG置于冰上，并立即进行移植。
注意：iPSMG移植前的制备操作应在超净工作台中进行，以避免污染。

3. 小鼠经鼻移植（Tsn）的术前准备

用含PLX5622的饲料喂养野生型雄性小鼠（C57BL/6J，8周龄）7天。
7 结束时^th 第几天停止PLX饮食，并给予小鼠正常饮食直至研究结束。
注意： 含PLX5622的饲料通过将1.2 g PLX5622加入1 kg AIN-93G中制备材料表).

4. 细胞经鼻移植

停止PLX喂养24小时后，称量小鼠体重，并通过腹腔注射麻醉混合物（0.2 mL/20 g）进行麻醉。
当小鼠完全麻醉（通过脚掌回缩反射测试，即用力捏脚趾无反应）后，使用10 µL移液器吸头，向每侧鼻孔分两次共给予2.5 µL透明质酸酶（溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为100 U/mL），每次间隔一定时间，以增强鼻黏膜通透性，此操作在iPSMG经鼻移植前1小时完成。
给予透明质酸酶后，将小鼠置于仰卧位。
在iPSMG经鼻移植前10分钟，重复步骤4.2。
使用10 µL移液器吸头，将2.5 µL细胞悬液经单侧鼻孔给予小鼠。
在向另一侧鼻孔给予细胞悬液前，将小鼠保持仰卧位5分钟。
重复步骤4.5和4.6共四次，每只小鼠总给予体积为20 µL。
将小鼠仰卧于37 °C加热垫上，直至从麻醉中恢复。
停止PLX喂养48小时后，对同一批小鼠再次重复执行步骤4.1–4.7。
注意：需要注意的是，iPSMG细胞在移植过程中应置于冰上保存。

细胞因子的应用

通过腹腔注射麻醉混合液（0.2 mL/20 g）对小鼠进行麻醉。
使用10 µL移液枪头将2.5 µL移植介质滴入小鼠一侧鼻孔。
在向另一侧鼻孔给予移植介质前，将小鼠保持仰卧位5分钟。
重复步骤5.2和5.3共四次，每只动物总注射体积为20 µL。
注意：应注意，为保证移植的iPSMG细胞在研究结束前的存活，需每12小时通过鼻腔给予移植介质（人细胞因子）。

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