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方法文章

通过“过氧化”和“氧化”羟基自由基足迹法监测RNA结构的平衡变化

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DOI：

10.3791/3244

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2011年10月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Hunter College , 2Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案介绍了通过两种羟基自由基足迹法来定量分析依赖于镁离子（Mg(II)）的RNA三级结构形成的方法。

摘要

RNA分子在生物学中发挥着至关重要的作用。除了传递遗传信息外，RNA还能折叠成独特的三级结构，作为调节因子、结合分子或催化剂执行特定的生物学功能。了解RNA分子中三级接触的形成信息对其功能研究至关重要。羟基自由基（•OH）因其高反应活性和小分子尺寸，是研究核酸结构的独特探针1 。作为足迹探针使用时，羟基自由基能够以单核苷酸分辨率精确绘制DNA1 和RNA2磷酸二酯骨架的溶剂可及表面图谱。羟基自由基足迹法可用于鉴定分子间接触表面内的核苷酸，例如在DNA-蛋白质1和RNA-蛋白质复合物中。通过将羟基自由基足迹实验作为溶液变量或时间的函数进行，可分别确定体系的平衡3和动力学4变化过程。足迹法的一个关键特征是，对探针的有限暴露（例如“单次撞击动力学”）可实现对聚合物中每个核苷酸的均匀取样5。

在本视频文章中，我们以嗜热四膜虫（Tetrahymena）核酶的 P4-P6 结构域为例，说明 RNA 样品的制备以及 Mg(II) 介导的折叠等温线的测定。我们描述了常用的羟基自由基足迹分析方案，该方案需要使用 H2O2（我们称之为“过氧化”方案），以及一种有价值但尚未广为人知的替代方法，即利用自然溶解的 O2（我们称之为“氧化”方案）。本文还概述了数据归约、转换和分析的流程。

方案

1. 足迹试剂的制备

  1. 配制10倍反应缓冲液，包含100 mM 二甲胂酸钠、1 mM EDTA 和 1 M KCl，调节pH至7.4。使用0.2 μM醋酸纤维滤器（Nalgene）过滤缓冲液。注意：切勿将RNA直接加入10倍缓冲液中。
  2. 按照表1所示，为每个反应配制滴定反应混合液。在加入10 μl RNA（溶于1倍缓冲液）之前，滴定混合液体积（1倍缓冲液和所需浓度的Mg(II)）应为90 μl。
  3. 配制RNA酶T1消化缓冲液，包含6.63 M尿素、20 mM柠檬酸钠、1 mM EDTA、0.25 μg/μl tRNA、0.025% 二甲苯青蓝和0.025% 溴酚蓝。该缓冲液可在4 °C保存最多6个月。
  4. Fenton反应需要新鲜配制的水溶液，包括250 mM Fe(NH4)2(SO4)2、250 mM EDTA 和 500 mM L-抗坏血酸钠。第1.5节中注明的浓度适用于在不淬灭自由基的缓冲液（如二甲胂酸钠缓冲液）中进行的平衡实验，并适用于多种二价离子浓度条件。
  5. 用于过氧化（1.5.1）和氧化（1.5.2）足迹反应的试剂。
    1. 过氧化Fenton反应需要新鲜配制的水溶液：100 mM Fe-EDTA溶液、50 mM L-抗坏血酸钠和1.5% H2O2。Fe-EDTA溶液通过将Fe(NH4)2(SO4)2与EDTA混合制备，使EDTA摩尔量比铁过量1.1倍。
    2. 在启动氧化切割反应（3.4.2）前，立即配制Fenton反应混合液：将2 μl Fe(NH4)2(SO4)2（250 mM）、2.2 μl EDTA（250 mM）、62.5 μl L-抗坏血酸钠（500 mM）、22.5 μl 10倍反应缓冲液和135.5 μl H2O混合，使足迹反应体系（3.4.2）中终浓度分别为0.10 mM、0.11 mM和6.61 mM。

2. 足迹分析实验的 RNA 制备

  1. RNA 可通过 DNA 模板的标准体外转录6产生，或者如果长度短于 50 个核苷酸，也可直接购买（例如 Integrated DNA Technologies，www.idtdna.com）。在进行足迹实验期间，应遵循推荐的实验室清洁程序，以保持 RNA 样品的完整性。7
  2. 在对 RNA 的 5' 端进行 32P 标记之前，必须对体外转录的 RNA 进行去磷酸化处理8。使用激酶反应对 10 pmol RNA 进行末端标记9。磷酸酶成功失活后，溶液应呈现浑浊状态。
  3. 使用变性凝胶电泳纯化放射性标记的 RNA。通过两轮连续的凝胶提取法，使用 0.3 M 醋酸钠（pH 5.5）回收 RNA。将 0.5 ml 水溶液与 1 ml 乙醇混合后，在干冰上孵育 1 分钟以沉淀 RNA。在 4 °C、12500 rpm 条件下离心 0.5 小时。弃去上清液，并用 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。再次离心后弃去上清液，并在真空下干燥沉淀。
  4. 将 32P 标记的 RNA 样品溶解于 330 µl 的 1× 缓冲液中。取 30 µl RNA 溶液加入反应管中，用乙醇沉淀并在真空中干燥；保留此管用于生成参考梯度（步骤 3.5）。将缓冲液中的 RNA 溶液在 95 °C 加热 2 分钟以使其变性。随后将样品在室温下冷却 15 分钟，并短暂离心，使管盖上的冷凝液重新回到溶液中。

3. 足迹实验

  1. 电泳梳子决定了每块分析胶的最大数据点数量。我们使用30孔梳子。参考分子量标记占用2个孔，未切割对照占用1个孔。准备27个反应管。最终Mg(II)浓度应在对数尺度上均匀分布，覆盖滴定中点附近的数量级范围。
  2. 分别将RNA和Mg(II)溶液在50°C下孵育5分钟。取10 μl RNA溶液与90 μl相应量的Mg(II)在1x缓冲液中混合，使终体积为100 μl。将溶液在50°C下孵育30分钟。
  3. 让溶液在25°C下平衡1小时，同时进行RNA折叠。
  4. 过氧化（3.4.1）或氧化（3.4.2）羟基自由基足迹反应。
    1. 通过在含有RNA溶液的反应管内顶部分别放置2 μl Fe-EDTA（100 mM）、2 μl L-抗坏血酸钠（50 mM）和2 μl H2O2（1.5%），彼此分离，启动过氧化反应，并通过剧烈混合启动足迹反应。反应15秒后加入300 μl冷无水乙醇终止反应。将反应管翻转3–5次。按步骤2.4所述沉淀、洗涤并干燥沉淀物。
    2. 通过加入5 μl新配制的Fenton反应混合液（1.6）启动氧化羟基自由基足迹反应。在25°C下孵育30分钟。加入300 μl冷无水乙醇以淬灭反应，并通过翻转反应管3–5次混匀。按步骤2.4所述沉淀、洗涤并干燥沉淀物。
  5. 使用步骤1.3中制备的溶液，按照标准操作程序10制备RNase T1消化参考样品。
  6. 将RNA沉淀溶解于8 μl凝胶上样染料II（AMBION）中，并使用盖革计数器确认RNA已充分重悬。
  7. 根据标准操作规程11制备变性8%聚丙烯酰胺测序胶。上样样品，包括两个参考样和一个对照样。在60 W–75 W功率下电泳2.5小时。将干燥后的凝胶过夜暴露于存储磷屏。使用无胶片自显影成像系统（如Storm 865（GE Healthcare）或Typhoon（GE Healthcare））扫描磷屏。将凝胶图像文件传输至计算机。

4. 数据分析

  1. 通过定量分析凝胶上每条条带的强度来确定每个核苷酸的羟基自由基反应活性。下载、安装并打开SAFA软件，这是一款易于使用的开源软件，用于单一条带拟合与定量分析12, 13。请遵循用户手册中的说明。简要步骤如下：首先以.txt文件格式加载RNA序列，然后以.gel文件格式加载凝胶图像。调整条带强度，定义泳道，选择一个锚定泳道，并执行凝胶比对。条带与核苷酸的对应关系需参照RNase T1消化测序梯度进行指认。对条带积分进行定量，并利用归一化/色谱图功能对可能不变的残基进行归一化和指认。将输出结果保存为.txt文件。
  2. SAFA输出的电子表格中，各列代表凝胶上的泳道，各行代表对应RNA片段的单个条带的积分密度。首先，通过比较无Mg(II)样品的保护图谱与终点Mg(II)浓度（本例中为50 mM）的图谱，识别出溶剂可及性发生明显变化的保护位点。数值越低，表明该核苷酸对羟基自由基攻击的保护程度越高；反之亦然。
  3. 根据单个或一组核苷酸的归一化条带积分值与Mg(II)浓度的关系绘制折叠等温线。通过公式 fi = L + (U - L)•静力平衡；ΣFy=0；力平衡图；物理教育；矢量力分析。 将各等温线独立地缩放为分数饱和度，其中f表示被分析条带的积分密度，L和U分别代表转变的下限和上限，静力平衡；ΣFy=0；力平衡图；物理教育；矢量力分析。为分数饱和度14 。使用非线性最小二乘拟合分析程序（我们使用Origin（OriginLab）或GraphPad（GraphPad Software, Inc.））将数据按Hill方程（1）进行拟合，
    结合等温线方程； Ȳ=K_d^n[M]^n/(1+K_d^n[M]^n)；热力学公式。
    其中Kd为平衡解离常数，[M]为介导折叠反应的变量浓度（本例中为Mg(II)），nH为Hill系数。该方法可将转变过程缩放至分数饱和度，确定其转变中点，并提供一个现象学检验，判断该转变是否呈S形。由测序凝胶（图3A）获得并通过SAFA分析（图3B）后按上述方法拟合的等温线如图3C所示。图3中所示的分数饱和度等温线是通过在电子表格中将SAFA生成的数值依据最佳拟合的上下限（U和L）进行缩放得到的，计算公式为：分数 = 数值 / (U - L) - L / (U - L)。

5. 代表性结果：

图3展示了P4-P6 RNA的•OH足迹实验的代表性结果。凝胶图像（左侧）表明：a）背景切割信号极低（右泳道）；b）由于T1泳道中条带清晰可辨，可实现单核苷酸水平的定位（RNase T1在每个G位点处切割）；c）RNA经羟基自由基诱导产生的断裂信号显著高于背景。随着Mg(II)浓度从低到高变化，单个或成组条带的整合密度降低，表明RNA三级结构的形成。切割程度同步发生变化的一个或连续多个核苷酸被称为“保护”（protection）。在Mg(II)介导的P4-P6 RNA折叠过程中观察到的•OH保护区域，与其晶体结构中观察到的溶剂不可及区域高度一致。15

折叠的RNA分子可能具有非常不同的三级接触保护程度（即条带密度下降至接近背景水平的程度），而这种差异尚未与明确的结构或动态现象相关联。因此，一些RNA分子会表现出明确的结构转变（如图3所示），而另一些则不会。条带强度通过SAFA12分析进行量化和归一化（图3B）。输出结果为“热图”，用于可视化RNA核苷酸对•OH攻击的相对保护程度。颜色变化描述了加入Mg(II)后可及性的改变：从白色到红色表示核苷酸可及性增加，从白色到蓝色表示保护性增强。每种灰度等级均对应一个数值，可绘制为保护曲线（图3C），并使用结合模型（如Hill方程（1））进行分析。保护区域153-155对应的平衡解离常数约为保护区域163-164对应值的两倍。

Fe(II)-EDTA介导DNA切割的化学反应图示及Mg²⁺的影响；羟基自由基反应过程。
图1. 羟基自由基的生成与P4-P6 RNA的折叠。A) Fe(II)催化过氧化氢生成羟基自由基。抗坏血酸将Fe(III)还原为亚铁离子。B) 在缺乏Mg(II)时，P4-P6无法形成三级结构，羟基自由基可进入并切割所有可及的骨架位点。加入Mg(II)后，P4-P6开始折叠，仅溶剂可及的骨架区域可被羟基自由基切割。

RNA标记与纯化；包含变性PAGE、羟基自由基足迹分析、片段分析的示意图
图 2. 羟基自由基足迹分析实验流程示意图。A) RNA的去磷酸化及32P 5'端标记。B) 通过变性聚丙烯酰胺凝胶纯化32P标记的RNA。C) 切割RNA条带，随后进行RNA提取和乙醇沉淀。D) RNA的预折叠与折叠。E) 加入新鲜配制的芬顿反应混合液以产生羟基自由基。F) 通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA片段。G) 使用SAFA软件对RNA片段进行定量分析。

凝胶电泳，Mg²⁺ 结合分析，饱和曲线，蛋白质-配体相互作用研究。
图 3. 过氧化芬顿足迹反应后RNA片段的分析。（A）RNA暴露于羟基自由基，切割产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离。图中显示随着Mg(II)浓度增加而产生的过氧化切割产物。参考和对照泳道已标注。该图像文件是SAFA程序的输入，用于定量每条条带的体积。（B）SAFA生成的“热图”。（C）SAFA输出的积分条带密度与核苷酸编号对应数值表，通过诸如Hill方程（1）的结合模型进行分析。根据条带积分密度随Mg(II)浓度增加的变化，选择受保护区域。Kd 是所监测位点处一半RNA发生折叠时的Mg(II)浓度。Hill系数nH 反映曲线斜率，提供结合协同性的信息，并对该特定位点折叠过程中涉及的镁离子数提供一个下限估计。

RNA反应设置，不同Mg(II)浓度表格，变化条件，实验室实验数据。
表1. 制备含有不同Mg(II)浓度RNA样品的代表性体积。

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讨论

羟基自由基足迹法是一种用于评估核酸溶剂可及表面积的有效工具。可以依据离子类型和浓度、pH、温度、结合蛋白或折叠辅助因子等参数，追踪三级结构形成的定性与定量变化14。该方法操作简便、成本低廉，且能提供单核苷酸水平上的溶剂可及性和折叠信息，因而极具吸引力。传统上，•OH 足迹反应使用外源添加的 H2O2 进行，我们称此方法为“过氧化性”方法（图1A）。我们所强调的另一种替代方法（“氧化性”方法）17 则利用自然溶解的 O2，通过以下反应生成少量过氧化氢：
氧化还原反应，Fe(III)+O2→Fe(III)+O2；O2+2H+→H2O2+O2，化学方程式。

两种方法均通过 H2O2 将 Fe(II) 氧化为 Fe(III) 来...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院RO1-GM085130基金和美国国家科学基金会MCB0929394基金的资助。我们感谢Marion Schmidt博士提供的热情接待，并允许我们在她的实验室进行拍摄。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
名称公司货号
二甲胂酸钠（注意！有毒）Sigma-AldrichC4945-25g
EDTA (0.5 M)AmbionAM9260G
DEPC 处理水AmbionAM9915G
乙酸钠 (3 M)AmbionAM9740
MgCl2 (1 M)AmbionAM9530G
尿素AmbionAM9902
柠檬酸钠Sigma-AldrichW302600
tRNASigma-AldrichR-7876
抗坏血酸钠Sigma-AldrichA7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 · 6 H2OSigma-AldrichF1543-500g
RNase T1FermentasEN0541
过氧化氢 (30%)Sigma-Aldrich349887

参考文献

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