通过“过氧化”和“氧化”羟基自由基足迹法监测RNA结构的平衡变化

摘要

本实验方案介绍了通过两种羟基自由基足迹法来定量分析依赖于镁离子（Mg(II)）的RNA三级结构形成的方法。

摘要

RNA分子在生物学中发挥着至关重要的作用。除了传递遗传信息外，RNA还能折叠成独特的三级结构，作为调节因子、结合分子或催化剂执行特定的生物学功能。了解RNA分子中三级接触的形成信息对其功能研究至关重要。羟基自由基（•OH）因其高反应活性和小分子尺寸，是研究核酸结构的独特探针¹ 。作为足迹探针使用时，羟基自由基能够以单核苷酸分辨率精确绘制DNA¹ 和RNA²磷酸二酯骨架的溶剂可及表面图谱。羟基自由基足迹法可用于鉴定分子间接触表面内的核苷酸，例如在DNA-蛋白质¹和RNA-蛋白质复合物中。通过将羟基自由基足迹实验作为溶液变量或时间的函数进行，可分别确定体系的平衡³和动力学⁴变化过程。足迹法的一个关键特征是，对探针的有限暴露（例如“单次撞击动力学”）可实现对聚合物中每个核苷酸的均匀取样⁵。

在本视频文章中，我们以嗜热四膜虫（Tetrahymena）核酶的 P4-P6 结构域为例，说明 RNA 样品的制备以及 Mg(II) 介导的折叠等温线的测定。我们描述了常用的羟基自由基足迹分析方案，该方案需要使用 H₂O₂（我们称之为“过氧化”方案），以及一种有价值但尚未广为人知的替代方法，即利用自然溶解的 O₂（我们称之为“氧化”方案）。本文还概述了数据归约、转换和分析的流程。

方案

1. 足迹试剂的制备

1. 配制10倍反应缓冲液，包含100 mM 二甲胂酸钠、1 mM EDTA 和 1 M KCl，调节pH至7.4。使用0.2 μM醋酸纤维滤器（Nalgene）过滤缓冲液。注意：切勿将RNA直接加入10倍缓冲液中。
2. 按照表1所示，为每个反应配制滴定反应混合液。在加入10 μl RNA（溶于1倍缓冲液）之前，滴定混合液体积（1倍缓冲液和所需浓度的Mg(II)）应为90 μl。
3. 配制RNA酶T1消化缓冲液，包含6.63 M尿素、20 mM柠檬酸钠、1 mM EDTA、0.25 μg/μl tRNA、0.025% 二甲苯青蓝和0.025% 溴酚蓝。该缓冲液可在4 °C保存最多6个月。
4. Fenton反应需要新鲜配制的水溶液，包括250 mM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂、250 mM EDTA 和 500 mM L-抗坏血酸钠。第1.5节中注明的浓度适用于在不淬灭自由基的缓冲液（如二甲胂酸钠缓冲液）中进行的平衡实验，并适用于多种二价离子浓度条件。
5. 用于过氧化（1.5.1）和氧化（1.5.2）足迹反应的试剂。
   1. 过氧化Fenton反应需要新鲜配制的水溶液：100 mM Fe-EDTA溶液、50 mM L-抗坏血酸钠和1.5% H₂O₂。Fe-EDTA溶液通过将Fe(NH....

讨论

羟基自由基足迹法是一种用于评估核酸溶剂可及表面积的有效工具。可以依据离子类型和浓度、pH、温度、结合蛋白或折叠辅助因子等参数，追踪三级结构形成的定性与定量变化¹⁴。该方法操作简便、成本低廉，且能提供单核苷酸水平上的溶剂可及性和折叠信息，因而极具吸引力。传统上，•OH 足迹反应使用外源添加的 H₂O₂ 进行，我们称此方法为“过氧化性”方法（图1A）。我们所强调的另一种替代方法（“氧化性”方法）¹⁷ 则利用自然溶解的 O₂，通过以下反应生成少量过氧化氢：

两种方法均通过 H₂O₂ 将 Fe(II) 氧化为 Fe(III) 来.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
名称	公司	货号
二甲胂酸钠（注意！有毒）	Sigma-Aldrich	C4945-25g
EDTA (0.5 M)	Ambion	AM9260G
DEPC 处理水	Ambion	AM9915G
乙酸钠 (3 M)	Ambion	AM9740
MgCl2 (1 M)	Ambion	AM9530G
尿素	Ambion	AM9902
柠檬酸钠	Sigma-Aldrich	W302600
tRNA	Sigma-Aldrich	R-7876
抗坏血酸钠	Sigma-Aldrich	A7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 · 6 H2O	Sigma-Aldrich	F1543-500g
RNase T1	Fermentas	EN0541
过氧化氢 (30%)	Sigma-Aldrich	349887