本文描述了在转移性乳腺癌细胞生长和转移过程中，对其表达的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的生物发光反应进行构建、可视化及定量的方法。 体内.
本文内容
摘要
摘要
自乳腺癌细胞从原发性肿瘤转移到转移部位的机制和时间进程的研究取得显著进展以来 体内 生物发光成像技术 1-3事实上，能够在同一组动物中纵向定位并定量肿瘤生长，直至研究结束，而无需在特定检测时间点处死各组动物，这一能力彻底改变了研究人员探究乳腺癌转移的方式。然而，目前的方法尚无法实时评估乳腺癌细胞信号传导系统中发生的关键变化。 (i) 在原发性肿瘤内进化， (ii) 扩散至全身，以及 (iii) 在转移病灶部位重新启动增殖程序。然而，得益于生物发光成像技术的最新进展，如今已能够同时定量分析基因表达在肿瘤发生及转移进展过程中特定的时空变化。 通过 双底物发光反应的应用。为此，研究人员利用了两种从萤火虫中分离得到的发光荧光素酶Photinus pyralis) 和海扇（海肾（Renilla reniformis）），两者均针对互不重叠的底物发生反应，这一特性此前促进了它们的广泛应用 体外 基于细胞的报告基因检测 4。在此我们展示 体内 这两种酶的联用能够实现特定发光反应，分别用于标记肿瘤生长过程中的大小和位置，以及在肿瘤和转移发展的不同阶段可视化特定信号通路的激活状态。因此，本研究的目标分为两个方面：首先，我们将描述构建双荧光素酶报告细胞系所需的步骤，以及在乳腺癌转移级联过程中特定阶段可视化基因表达时空调控所需的实验方法。利用4T1乳腺癌转移模型，我们证明了 体内 合成的Smad结合元件（SBE）启动子活性在肺转移灶中较原发肿瘤中显著降低 4-6最近研究表明，乳腺癌转移受到原发肿瘤微环境和反应性间质变化的调控，其中包括成纤维细胞和浸润性免疫细胞所发生的变化。 7-9因此，我们的第二个目标是展示双荧光素酶技术在监测单个动物体内乳腺癌生长和转移过程中两种不同细胞群体的增殖与定位中的应用价值。
方案
1. CMV 驱动的Renilla荧光素酶的稳定表达
- 转染并筛选稳定的克隆群体是表达该海肾荧光素酶报告基因的首选方法。该方法在后续引入其他次级报告基因构建体后，能够获得更一致且均一的海肾荧光素酶表达水平。例如，萤火虫荧光素酶或荧光蛋白）。
- 将目标恶性细胞转染表达载体，该载体编码海肾荧光素酶，例如 pcDNA3.1-Hygro 或其他含有可筛选标记的质粒。
- 转染后，将转染细胞置于优化的抗生素浓度中培养数天至数周，以促进单个克隆的形成，随后分别挑取单克隆并进行传代培养。
- 选择 ≥10 个表达海肾荧光素酶的单克隆，以监测海肾荧光素酶表达水平。
- 表达大量海肾荧光素酶的菌落随后接受功能分析，以确保其 (i) 其亲本细胞的病理生理学特性得以保留，且 (ii) 海肾荧光素酶的表达值不会随时间发生偏离或改变。这些步骤对于避免分离和研究克隆变异体/偏离株，以及验证海肾荧光素酶载体在基因组中的正确整合至关重要。
- 一旦获得并验证了稳定的转染细胞系，即可撤去选择性压力，并可确信海肾荧光素酶的表达将在长时间内保持稳定 体外 和 在体 .
2. 诱导型启动子驱动的萤火虫荧光素酶的表达、筛选与功能验证
- 将目标启动子亚克隆至含有可筛选标记的pGL4-荧光素酶报告质粒中（例如，嘌呤霉素）与用于筛选稳定型海肾荧光素酶表达的筛选体系不同（例如，潮霉素）
- 转染恶性细胞，操作同第I步，随后筛选出稳定表达萤光素酶的多克隆细胞群体。由于报告基因在基因组中的整合位点可能对其表达和调控产生干扰性影响，强烈建议筛选多克隆而非单克隆的萤光素酶表达细胞群体，以确保 (i) 报告基因的表达更准确地反映了亲本细胞中内源基因的表达； (ii) 在异质细胞群体中，整合效应对基因表达的影响被平均化并减弱。
- 稳定表达海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的恶性细胞统称为双荧光素酶报告细胞，或 DBR 细胞
- 使用传统方法 体外 基于细胞的荧光素酶报告基因检测，验证DBR细胞是否以与瞬时转染这些载体的亲本细胞中观察到的一致方式，对萤火虫荧光素酶的表达进行正向或负向调控。同样，验证巨细胞病毒（CMV）驱动的海肾荧光素酶表达不受各种细胞刺激或处理条件的调控。
- 将DBR细胞和亲本细胞在24孔板中进行培养，随后使用生成DBR细胞时所用的原始CMV-renilla和启动子-firefly质粒，对亲本细胞进行瞬时共转染。
- 随后，用已知可调控目的启动子的因子或药理学试剂处理DBR及转染的亲本细胞，再使用Promega Dual Luciferase Assay Kit定量检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的发光强度。
3. 建立4T1原位乳腺肿瘤
- 已发现不携带血管周围啮齿类病原体的转移性4T1乳腺癌细胞，并通过基因工程稳定表达由CMV启动子驱动的海肾荧光素酶（pcDNA3.1-CMV-renilla luciferase-hygro）和由SBE启动子驱动的萤火虫荧光素酶（pGL4.2-SBE-firefly luciferase-puro），具体方法如上所述。将这些乳腺癌细胞进行原位移植后，可自发形成转移灶，主要转移部位为肺部。
- 4T1 细胞在传统二维组织培养系统中传代时，不应使其生长至汇合状态，且应在预计达到汇合前一日进行传代。 体内 接种
- 4T1 细胞应通过胰蛋白酶消化法解离，用完全培养基充分洗涤，并用 PBS 稀释至浓度为 2×10⁶ 个细胞/mL5 细胞/毫升，并立即置于冰上保存。
- 雌性Balb/C小鼠（4-6周龄）应使用3%异氟烷进行诱导麻醉，并以1%异氟烷维持麻醉状态。用70%异丙醇擦拭注射部位进行消毒。使用镊子轻轻夹起并提起第4对腹股沟乳腺垫。将27.5号针头斜面朝上，小心刺入乳头正下方的乳腺脂肪垫，特别注意避免将针头插入腹腔。松开腺体后缓慢注射 50 μl 细胞悬液的（1x104 细胞注入乳腺脂肪垫。
4. 初始双发光成像
- 在将4T1细胞移植到小鼠乳腺脂肪垫后立即操作，且在小鼠仍处于麻醉状态下时注射 100 μl 将RediJect腔肠素注入尾静脉侧支。此为供应商推荐的最佳底物浓度，且对动物耐受性最佳。
- 立即把小鼠放入IVIS-200成像系统中的异氟烷鼻罩内，采集0.5至1分钟的生物发光图像。注射与图像采集之间的操作效率至关重要，因为海肾荧光素酶信号在注射后约30秒迅速下降。成像完成后，将小鼠放回笼中，使其恢复至少1小时，以确保残留的海肾荧光素酶信号完全消退，且小鼠从麻醉状态中充分恢复。
- 注射150 mg/kg的D-荧光素钾盐 通过 腹腔注射并等待5分钟。此D-荧光素浓度为最佳浓度，可在注射后为实验动物提供持续5–15分钟的稳定发光信号。使用异氟烷麻醉小鼠，并将其重新放入IVIS-200系统中，注意使其体位与最初海肾荧光素酶成像时的位置尽可能一致。该萤火虫荧光素酶信号的总体强度取决于目标启动子的活性，因此，可视化萤火虫荧光素酶活性可能需要延长成像时间。
- 使用设置为“光子”模式的 IVIS Living Image 软件，确定海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶检测的数值，以建立基线相对发光比值（RLR）。
5. 纵向生物发光成像
- 4T1细胞具有高度侵袭性，接种1×10⁵个细胞即可4 细胞接种后通常在1周内形成可触及的肿瘤，并在4至5周内导致动物死亡。4T1肿瘤在第4周时具有天然的溃烂倾向。溃烂肿瘤的生长与维持可能需要单独的IACUC批准。本文所示的4T1肿瘤研究已获得凯斯西储大学IACUC的批准。
- 如上所述，应每周注射 RediJect Coelenterazine 以监测小鼠肿瘤的总体生长及转移情况，同时注射 D-luciferin 以监测肿瘤发展不同阶段中通路特异性的信号转导。每次检测时需注意，在采集萤火虫荧光素酶信号前，务必确保海肾荧光素酶信号已完全消退。
- 随着4T1肿瘤的形成与进展，海肾荧光素酶信号的获取应归一化为肿瘤细胞接种时测得的初始海肾荧光素酶值，以此作为归一化并追踪原位肿瘤生长的方法。更重要的是，通过随时间计算RLR值，可建立个体信号系统在肿瘤生长与进展过程中的时间调控规律。
- 乳腺脂肪垫接种4T1细胞后3-4周内可明显观察到肺转移灶。比较肺部RLR值 与 与原发性肿瘤计算结果的比较揭示了各信号系统相对于肿瘤生长和转移的空间调控规律。
6. 在单个动物体内对两种独特细胞类型进行双生物发光成像
- 如上所述，构建一种稳定表达由CMV启动子驱动的海肾荧光素酶的乳腺癌细胞系。对另一种不同的乳腺癌细胞系，采用由CMV启动子驱动的萤火虫荧光素酶重复该构建过程。
- 本文中，我们将表达海肾荧光素酶的4T1细胞与其非转移性且同基因型的表达萤火虫荧光素酶的4T07细胞混合10, 11。随后将不同比例的混合乳腺癌细胞群体按上述方法注射至乳腺脂肪垫中。
- 立即采集萤火虫和海肾荧光素酶的成像信号，以确定代表特定接种细胞混合物的初始RLR值。
- 纵向双荧光素酶成像将可视化并追踪原发肿瘤内细胞组成的动态变化，以及每种乳腺癌亚群在肿瘤生长和进展过程中时空转移的情况。
- 或者，可将不同的乳腺癌细胞群体分别接种于小鼠的不同部位（i.e. 右侧和左侧腹侧乳腺脂肪垫），以评估在肿瘤生长和转移的不同阶段，这两种细胞群体之间相互产生的系统性影响。
7. 代表性结果：
双生物发光成像的一个主要优势在于，每幅图像都具有内在的一致性和对照性，因此从原发肿瘤持续产生的信号可作为重要的指标，用于评估每次海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶成像的成功与否。在检测海肾荧光素酶活性时，这一成像过程的特性尤为重要，因为其底物腔肠素极易被氧化，从而产生自发光现象。图1A展示了一个此类副作用的示例，表现为来自肠道而非已建立的原发肿瘤的非特异性发光信号。通常，这些非特异性的腔肠素信号是在腔肠素底物静脉注射失败后出现的。然而，一旦获得了强健的、源自原发肿瘤的海肾荧光素酶信号（图1B，左图），便可安全地继续进行萤火虫荧光素酶的成像，以获取通路特异性的信号测量结果（图1B，右图），其底物D-荧光素在腹腔注射后高度稳定，几乎不产生背景自发光。
图 1. 获取 renilla 和 firefly 来源的生物发光图像以计算 in vivo RLR 值。（A） 腔静脉注射腔肠素失败的示例，导致肠道出现非特异性信号。圆圈和 PT 表示原发肿瘤的大致位置。（B） 一例成功获取携带 4T1 原发肿瘤及肺转移灶小鼠的 renilla 信号图像（左图；脂肪垫移植后 4 周）。相应的 firefly 信号图像可用于计算原发肿瘤及其肺转移灶的 RLR 值。（C） 根据 B 图所示小鼠计算出的原发肿瘤和肺转移灶 RLR 值的图形表示（n=4）。
讨论
生物发光成像技术的绝对优势在于其能够量化复杂纵向研究中的肿瘤生长和转移过程，本研究中采用了侵袭性强的4T1乳腺癌细胞。由于这些方法依赖于荧光素酶报告基因构建体的稳定整合，因此可轻松适应并转化应用于具有不同肿瘤潜伏期和转移能力的其他癌细胞系。与本研究展示的结果类似，在缓慢发展的原发性肿瘤及其最终转移灶中计算特定的相对发光强度（RLR），可实现对肿瘤转移进展过程中发生的特定信号事件进行实时、时空特异性的识别，而无论其潜伏期长短。在鉴定出特定启动子调控事件后，重要的是切除原发性肿瘤及其转移病灶，以进行标准的免疫组织化学分析和差异基因表达分析，从而验证内源性基因和/或蛋白质是否存在类似的调控模式。
从技术上讲，双荧光素酶分析的主要挑战在于海肾荧光素酶信号持续时间相对较短。因此，该成像技术需要对尾静脉注射操作进行大量优化，并对每只注射动物立即进行成像，这一过程相较于萤火虫荧光素酶的成像更为耗时且效率较低。最近，Promega 推出了“Viviren”，这是一种第二代荧光素酶底物，其氧化位点通过酯化作用被封闭，直到该分子进入细胞后才迅速发生去酯化反应。总体而言，这种新型底物能有效降低自发光以及与海肾荧光素酶诱导的自发光相关的非特异性修饰和/或降解12。通过这种方式，这种新的海肾荧光素酶底物可产生更强的发光信号；然而，由于“Viviren”的获取和使用成本过高，目前相关研究仍较少，尚不足以充分评估该底物在双荧光素酶分析中的整体实用性。最后，任何生物发光检测的灵敏度在很大程度上取决于用于捕获单个光单位的 CCD 相机性能。事实上，随着这些技术的进步，我们预计未来将有可能在自由活动的动物体内高效地实现对复杂光介导生物发光反应的可视化13。
致谢
W.P.S. 部分得到了美国国立卫生研究院（CA129359）、苏珊·G·科门抗癌基金会（BCTR0706967）、美国国防部（BC084561）以及西德曼癌症中心的资助；M.K.W. 得到了美国癌症协会博士后奖学金（PF-09-120-01）的支持。本研究还获得了凯斯医学影像研究中心、凯斯综合癌症中心（P30 CA43703）和囊性纤维化中心（P30 DK027651）的额外支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pGL4.2-Puro [luc2/Puro] 载体 | Promega Corp. | E6751 | |
| Glomax 多模式检测系统 | Promega Corp. | ||
| IVIS 200 系列 | Caliper Life Sciences | ||
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega Corp. | E1960 | |
| Rediject c–腔海荧光素-h | Caliper Life Sciences | 760506 | |
| D-荧光素钾盐 | Caliper Life Sciences | 122796 |
参考文献
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