我们介绍了两种用于大鼠脊髓损伤急性期或慢性期的触觉感觉测试方法。这些经过验证的实验步骤能够检测类似异常性疼痛感觉的发生和维持。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
我们介绍了两种用于大鼠脊髓损伤急性期或慢性期的触觉感觉测试方法。这些经过验证的实验步骤能够检测类似异常性疼痛感觉的发生和维持。
脊髓损伤(SCI)会损害感觉系统,导致异常性疼痛1-8。为了确定异常性疼痛的细胞和分子机制,需要在大鼠SCI模型中进行敏感且有效的感觉测试。然而,直到最近,尚无单一测试方法在SCI模型中得到验证,导致各实验室之间未能实施标准化的方法。此外,现有的测试方法无法在急性期或存在严重运动功能障碍时使用,从而阻碍了对SCI诱导的异常性疼痛发展过程的研究3。本文介绍了两种经过验证的感觉测试方法,使用冯·弗雷毛(von Frey Hair, VFH)单丝来量化SCI后触觉感觉阈值的变化4-5。其中一种是已广泛使用的上下法测试,在慢性期测试时,该方法在不同严重程度的SCI中均表现出高敏感性和特异性5。另一种是新开发的背侧VFH测试,可在SCI急性期、异常性疼痛出现但运动功能尚未恢复之前应用4-5。每根VFH单丝在接触后肢足底皮肤并弯曲时施加已校准的力。在上下法中,交替使用较大力量或较小力量的VFH作用于足底L5皮节,以确定屈肌回缩阈值。依次施加逐渐增大的力直至出现回缩反应,随后改用较小力的VFH直至回缩反应停止。触觉阈值定义为在50%刺激中引发回缩反应所需的力。对于新测试方法,将每根VFH施加于足背L5皮节,同时由实验者支撑大鼠。VFH刺激按力的大小升序进行,直到在某一特定力下至少3次中有2次引发足部回缩。触觉感觉阈值定义为在66%的情况下引发回缩反应的最小力。本文详细描述了适应、测试和评分流程,并定义了需要重测的异常试验和典型试验。动物实验已获得俄亥俄州立大学动物护理与使用委员会的批准。
1. 足底向上/向下Von Frey检测
该实验的目的是通过测量引发动物足爪回缩反应所需的力来评估触觉敏感性。使用商业化的校准Von Frey单丝纤维,其数值范围在4.56至6.10之间,对足爪进行刺激。其他感觉输入(如对刺激物的视觉感知或本体感觉)可能干扰触觉阈值的测量,因此基于视觉或本体感觉的反应无效。为防止动物看到单丝纤维接触皮肤,仅在大鼠进食谷物时进行测试。这种认知分散手段还可确保所有大鼠均在相似的基础舒适状态下接受测试。为避免因本体感觉而非触觉输入引发反应,不将单丝纤维抬高或移动足爪的试验次数纳入结果分析。
A. 上升-下降法的适应程序
B. 上-下法测试步骤
C. 上升-下降法的数据处理
2. 背侧 Von Frey 测试
该测试的目的是测定运动控制能力较差、无法使用典型足底VFH方法进行检测的大鼠的触觉敏感性。它可量化产生厌恶反应所需的触觉力大小。为避免对本体感受刺激产生反应,我们不将VFH施加过程中足爪发生移动的试验纳入分析。此外,VFH发生滑动或被刷过足背表面的试验也不纳入分析。
A. 背部Von Frey测试的适应程序
B. 背部Von Frey测试的检测程序
3. 代表性结果
成功的测试表现为,将VFH垂直施加于足底中部区域后,后肢足爪立即迅速回缩图1A)或两耳之间背部表面st 和 2nd 距关节1 cm处的跖骨(图1C)。这些反应被记录下来,以确定每只后肢的触觉阈值。急性脊髓损伤(SCI)期间背侧VFH测试所得的触觉阈值与慢性期测得的足底VFH阈值具有高度一致性。图2)。根据足底或背侧测试得出的触觉阈值在分级脊髓损伤(SCI)中出现下降图33,5)。这种过敏反应在脊髓损伤后7天即可出现,并在实验的整个持续期间内保持。3-4,6尽管不同程度的脊髓损伤(SCI)对足垫的触觉感觉阈值无显著影响,但在更严重的SCI情况下,感觉阈值会出现下降图3)。重要的是,损伤水平以下的痛觉过敏是一种全或无的反应,当病灶中心处的白质损失超过60%时即会发生。图 43).
触觉阈值可能会衰减,并对较低的 VFH 力量产生人为反应。至少有两种情况可导致阈值衰减:以快速戳刺或刺入的方式将 VFH 施加于皮肤,或在刺激应用之间等待时间不足。为了确保所测得的触觉阈值真实可靠,必须注意以相近的低速方式施加每个 VFH 刺激,且刺激间间隔必须至少为 30 秒。我们还发现,进食行为可减少阈值衰减5。

图 1. 示范足底和背侧冯·弗雷毛(von Frey hair, VFH)测试中VFH刺激部位的示意图与照片。A) 进行足底VFH测试时,应将冯·弗雷毛以垂直方向缓慢而稳定地施加于后肢足底中部,位置约为中节趾骨后方约1 cm处(如后肢足底表面示意图中红色方框所示),直至其弯曲。B 和 C) 采用背侧VFH技术时,如照片所示,将大鼠松散地包裹在手术毛巾中。VFH应施加于足背第一和第二跖骨之间,距关节近端约1 cm处。

图 2. 背侧 von Frey 丝感觉阈值与标准足底 von Frey 丝结果相关(n=44;Pearson 相关系数 = 0.503,p < 0.01,r² = 0.67)。虚线表示使用背侧 von Frey 丝或足底 von Frey 丝技术判断异常性疼痛感觉的截断阈值,表明在脊髓损伤后 7 天通过背侧 von Frey 丝测试得到的异常性疼痛阈值可预测由足底 von Frey 丝方法确定的慢性损伤水平以下异常性疼痛。

图 3. 脊髓损伤早期背部 von Frey 细丝感觉阈值可预测后期不同损伤程度下的触觉异常性疼痛(allodynia)及非异常性触觉敏感性。SCI 后 7 天的背部 von Frey 细丝测量值与 SCI 后 28 天的足底 von Frey 细丝测量值之间表现出可比的感觉阈值。在广泛的脊髓损伤程度范围内均观察到显著的相似性,其中中度至重度脊髓损伤表现出显著的异常性疼痛(p<.05,1.1 mm 位移 vs. 其他所有组)。

图4. 接受椎板切除术(无SCI)及SCI各组大鼠在SCI后6周时出现后足异常性疼痛的百分比。仅在中度或重度SCI大鼠(OSU ESCID装置,脊髓位移0.9、1.1、1.25、1.3 mm)中观察到异常性疼痛,而轻度SCI大鼠(脊髓位移0.3、0.5、0.7 mm)对触觉刺激表现出正常反应。图中还包括在损伤中心处染色显示髓鞘的代表性冠状脊髓切片,分别对应椎板切除术(未损伤对照组)、轻度(0.5 mm位移)、中度(1.1 mm位移)和重度(1.3 mm位移)脊髓挫伤,以展示与该种过敏反应相关的轴突保留程度。(比例尺 = 0.5 mm)。

图5. 上下法 von Frey 毛发测试的示例数据表。每次试验均记录毛发数值及结果(阳性或阴性)。记录测试过程中是否存在上脊髓感知的迹象。测试结束时,统计各毛发数值下的反应次数。示例数据中选定的阈值以圆圈标出。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本文介绍的VFH检测方法代表了两种对大鼠脊髓损伤(SCI)模型敏感且有效的检测范式。重要的是,背侧VFH测试旨在评估中胸段SCI后急性期大鼠后肢触觉感知的恢复情况,此时大鼠尚无法用后肢直立站立。该检测范式也可用于大鼠恢复体重支撑能力后,以及颈段SCI后的后肢功能评估。
本文展示的两种实验范式利用经过校准的VFH(Von Frey纤毛)来测定每只后肢爪垫的触觉阈值。其他方法则是通过记录动物对通常无害或通常有害刺激的回缩反应频率来评估痛觉。我们先前的研究表明,触觉阈值的微小改善可能意味着慢性神经病理性疼痛的存在与否,以及正常触觉感知之间的差异。因此,采用能够测定疼痛阈值的实验检测方法,可能有助于将潜在的治疗干预手段转化为临床应用。
与所有行为学测试一样,必须尽量减少测试环境中可能影响行为测试结果的混杂因素9。因此,每次测试应在每天的同一时间、在温度和湿度受控的同一房间内进行。此外,由于大鼠通过超声波范围进行声音交流,因此在测试开始前,应将等待测试的大鼠安置在另一个独立的房间中。Langford et ...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者无任何利益冲突需要披露。
美国国立卫生研究院 NS43798(DMB);美国国立卫生研究院 F31 NS058138(MRD);P30-NS045758(CBSCR);以及美国瘫痪退伍军人协会 #2451(DMB)和 #2707(MRD)。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Semmes-Weinstein 单丝纤维 | Stoelting 公司 | 58011 | |
| 鱼类繁殖盒 | 任意供应商 | 侧面钻孔用于输送谷物 | |
| 抬高的金属丝网(1/4" × 1/4" 网格) | 五金商店 | ||
| 用于固定鱼类繁殖盒的弹性带 | 任意供应商 | ||
| 含糖谷物 | 杂货店 | ||
| 外科纱布巾 16" × 23" | 医疗器械商店 | ||
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。