大鼠脊髓损伤后急性期与慢性期触觉感觉功能检测

摘要

我们介绍了两种用于大鼠脊髓损伤急性期或慢性期的触觉感觉测试方法。这些经过验证的实验步骤能够检测类似异常性疼痛感觉的发生和维持。

摘要

脊髓损伤（SCI）会损害感觉系统，导致异常性疼痛^1-8。为了确定异常性疼痛的细胞和分子机制，需要在大鼠SCI模型中进行敏感且有效的感觉测试。然而，直到最近，尚无单一测试方法在SCI模型中得到验证，导致各实验室之间未能实施标准化的方法。此外，现有的测试方法无法在急性期或存在严重运动功能障碍时使用，从而阻碍了对SCI诱导的异常性疼痛发展过程的研究³。本文介绍了两种经过验证的感觉测试方法，使用冯·弗雷毛（von Frey Hair, VFH）单丝来量化SCI后触觉感觉阈值的变化^4-5。其中一种是已广泛使用的上下法测试，在慢性期测试时，该方法在不同严重程度的SCI中均表现出高敏感性和特异性⁵。另一种是新开发的背侧VFH测试，可在SCI急性期、异常性疼痛出现但运动功能尚未恢复之前应用^4-5。每根VFH单丝在接触后肢足底皮肤并弯曲时施加已校准的力。在上下法中，交替使用较大力量或较小力量的VFH作用于足底L5皮节，以确定屈肌回缩阈值。依次施加逐渐增大的力直至出现回缩反应，随后改用较小力的VFH直至回缩反应停止。触觉阈值定义为在50%刺激中引发回缩反应所需的力。对于新测试方法，将每根VFH施加于足背L5皮节，同时由实验者支撑大鼠。VFH刺激按力的大小升序进行，直到在某一特定力下至少3次中有2次引发足部回缩。触觉感觉阈值定义为在66%的情况下引发回缩反应的最小力。本文详细描述了适应、测试和评分流程，并定义了需要重测的异常试验和典型试验。动物实验已获得俄亥俄州立大学动物护理与使用委员会的批准。

方案

1. 足底向上/向下Von Frey检测

该实验的目的是通过测量引发动物足爪回缩反应所需的力来评估触觉敏感性。使用商业化的校准Von Frey单丝纤维，其数值范围在4.56至6.10之间，对足爪进行刺激。其他感觉输入（如对刺激物的视觉感知或本体感觉）可能干扰触觉阈值的测量，因此基于视觉或本体感觉的反应无效。为防止动物看到单丝纤维接触皮肤，仅在大鼠进食谷物时进行测试。这种认知分散手段还可确保所有大鼠均在相似的基础舒适状态下接受测试。为避免因本体感觉而非触觉输入引发反应，不将单丝纤维抬高或移动足爪的试验次数纳入结果分析。

A. 上升-下降法的适应程序

1. 在饲养笼内提供水果麦片，使大鼠能够识别并主动寻找该食物奖励。在整个驯化或测试过程中，大鼠无需进行任何程度的食物剥夺。
2. 当大鼠能够在饲养笼内进食水果麦片后，即可开始适应测试环境和操作流程。适应过程至少需要进行4次，每次10分钟，但部分大鼠可能需要更多次数。采用10分钟的会话时长，以确保大鼠在会话结束前不会因饱食而停止活动。
3. 将大鼠放入测试装置中，并放置三片水果麦片。当大鼠吃完后，陆续补充一至两片麦片。在第三次适应会话中，当大鼠进食时，在金属网底下方做出缓慢的手部移动，使其逐渐适应足下区域的运动刺激。在第四次会话中，约每分钟一次，使用5.18单纤维丝轻触大鼠足底约10次。未经处理的大鼠应对该低于阈值的刺激无反应。
4. 记录大鼠摄食的麦片数量、排尿与排便频率，以及僵直和理毛行为。僵直行为表现为两种形式：a）大鼠身体低伏贴近地面，通常靠近笼后壁或背向实验者，保持静止不动；b）大鼠在笼中央弓背蜷缩，常伴有牙齿打颤。僵直行为可能持续较长时间。
5. 完成驯化并准备进入测试阶段的大鼠，将在10分钟内几乎持续进食，能够在笼内自由活动，并在吃完最后一片麦片后迅速寻找下一片。重要的是，该大鼠在进食过程中不会因金属网底下的手部移动或足底施加单纤维丝刺激而停止进食或分心。

B. 上-下法测试步骤

1. 大鼠会产生高于人类听觉范围的痛苦叫声。等待测试的大鼠应放置在单独的房间内，以避免其听到这些叫声。
2. 适用于上下移动 von Frey 毛测试的脊髓损伤大鼠必须能够用四肢承重。无法支撑大鼠体重的肢体不能进行可靠测试，因为单丝施加时会在毛弯曲前移动足部。
3. 将大鼠放入测试箱中，并放入 2 至 3 片水果麦片。每次施加 von Frey 单丝时，大鼠必须处于进食状态。
4. 掷骰子以确定先测试哪一侧肢体。偶数代表右前足，奇数代表左前足。
5. 测试应从 5.18 单丝开始。正常大鼠和脊髓损伤大鼠的撤足反应通常出现在 4.56 至 6.10 范围内，5.18 单丝位于该范围中点。
6. 当大鼠出现冻结、蜷缩或停止进食时，不应施加单丝。测试者可等待，这些行为有时会自行消失，之后可继续测试。若大鼠持续表现出上述行为且在装置内总时长已达 20 分钟，则应停止测试，并于次日从头重新开始。切勿在大鼠表现出这些行为时将其移出，以免增加其发生频率。应等待大鼠脱离这些行为模式后再进行操作，以避免强化此类行为。
7. 将单丝轻触后足脚垫之间的 L5 足底皮区，直至单丝弯曲（见图 1A）。此操作应平稳、稳定，持续约 1 秒，随后将单丝从皮肤移开。避免接触任何脚垫区域，因为这些区域的皮肤敏感性显著较低。单次触碰即为一次试验。
8. 当大鼠迅速将足部从单丝处抬起时，视为阳性反应。撤足动作必须在单丝移开前启动，以确认该反应与单丝刺激相关。
9. 观察动物是否出现其他感知单丝刺激的迹象，例如发声、低头、回头或注视被测足部、舔舐足部、持续抬足或耳朵抽动。将这些行为记录在数据表上。当这些行为与抬足反应同时出现时，表明刺激已被脊髓上中枢感知。
10. 若出现阳性反应，则使用下一档更低的单丝继续测试；若无反应（阴性），则改用下一档更高的单丝。每次单丝刺激之间应间隔 30 秒，使感觉感受器恢复至基础放电水平后再进行下一次测试（防止感觉适应）。
11. 根据阳性或阴性反应，继续对后足施加更高或更低的单丝，直至完成 10 次试验。随后在另一侧后足重复相同过程。（参见示例数据表）。
12. 在不引入本体感觉输入并避免抬足的前提下，最大可测试的 von Frey 单丝为 6.10。不应使用 6.45VFH 及更大规格的单丝，因为足部会在单丝弯曲前即被抬起。若在 6.10 时无反应，则下一次试验仍使用 6.10 单丝重复测试。
13. 若在刺激施加或抬足过程中发生以下任一情况，该次反应应作废，且该次试验需重新进行：
    1. 大鼠未持续进食。
    2. 在单丝弯曲前，大鼠已主动远离 von Frey 刺激，导致无法确定引发撤足反应的实际刺激力。
    3. von Frey 单丝（无论在弯曲前或弯曲后）将足部抬起，从而在触觉刺激之外引入了本体感觉输入。
14. 双侧后肢的测试通常可在 15 分钟内完成。

C. 上升-下降法的数据处理

1. 每只爪子需完成连续 10 次试验，方可视为测试成功。
2. 触觉阈值是指在 ≥50% 的刺激呈现中引发爪子回缩反应的最小单丝纤维，且该单丝纤维至少需给予 3 次或以上的刺激（参见示例数据表，阈值已用圆圈标出）。
3. 即使一次试验为阳性、一次为阴性，若某单丝纤维仅进行了 2 次试验，则不能将其选为阈值。多次呈现刺激更能准确反映对该力度刺激的反应模式。
4. 若没有任何单丝纤维能在至少 50% 的测试中引发阳性反应，则该大鼠的评分为 6.45。这意味着该大鼠未能以高于随机概率的水平感知到可测试范围内最大力度的单丝纤维（6.10）。评分为 6.45 是因为该数值代表了超出可测试单丝纤维范围的下一个数值。
5. 将右爪和左爪的阈值转换为克力（gram force）。克力数值由 von Frey 纤维供应商提供。对于双侧损伤的数据，可将两只爪子的阈值克力取平均值，得到一个单一评分。

2. 背侧 Von Frey 测试

该测试的目的是测定运动控制能力较差、无法使用典型足底VFH方法进行检测的大鼠的触觉敏感性。它可量化产生厌恶反应所需的触觉力大小。为避免对本体感受刺激产生反应，我们不将VFH施加过程中足爪发生移动的试验纳入分析。此外，VFH发生滑动或被刷过足背表面的试验也不纳入分析。

A. 背部Von Frey测试的适应程序

1. 在基线测试和脊髓损伤前，对大鼠进行四次温和操作，每次10分钟。
2. 用一条小毛巾松松地包裹大鼠，使后躯暴露，如下图所示（图1B）。将大鼠置于桌面上方，使其后肢轻轻接触桌面。对每只大鼠均采用相同但不过紧的包裹方式并保持固定。将前臂支撑在桌缘，有助于减少个体间差异。
3. 经过温和处理的大鼠在测试时应能持续数分钟不抗拒被毛巾包裹；但在检测双侧后肢期间，可能需要重新包裹大鼠1至2次。

B. 背部Von Frey测试的检测程序

1. 掷骰子以确定先测试哪一侧后肢。偶数代表右爪，奇数代表左爪。
2. 用毛巾松松包裹大鼠，使后躯暴露。
3. 只有当大鼠安静不动至少10秒后，才可施加触觉刺激。
4. 从4.56 VFH开始，将单丝纤维垂直施加于第一和第二跖骨背侧之间，位置约在关节近端1 cm处（图1C）。在1秒的时间内平稳、持续地施加单丝纤维，直至其弯曲，然后将其移开。单次接触构成一次试验。
5. 当大鼠迅速将爪子移离刺激源时，视为阳性反应。运动方向通常在后肢屈曲前表现为向后或向外。为确认反应与单丝纤维刺激相关，撤除单丝纤维时必须已开始发生回缩动作。
6. 以至少30秒的间隔再重复施加4.56单丝纤维两次，以防止感觉“增强效应”，并在重复测试前使感觉感受器恢复至基础放电水平（防止适应）。
7. 若VFH滑脱并轻微擦过皮肤，导致施力更接近于刷拭或扫过而非定点接触，则应重新进行刺激测试。
8. 若对4.56单丝纤维的阳性反应少于2次（即1次或0次），则换用下一规格更大的VFH，以相同方式施加3次。
9. 以此方式，依次使用从4.56至5.88的更大规格VFH，直至出现两次或以上阳性反应，或已使用最大规格VFH为止。
10. 爪回缩阈值是指在3次试验中至少引发2次阳性反应的最低VFH值。
11. 在另一侧爪子上重复上述步骤。
12. 通常可在15分钟内完成双侧后爪的测试。

3. 代表性结果

成功的测试表现为，将VFH垂直施加于足底中部区域后，后肢足爪立即迅速回缩图1A）或两耳之间背部表面^st 和 2^nd 距关节1 cm处的跖骨（图1C）。这些反应被记录下来，以确定每只后肢的触觉阈值。急性脊髓损伤（SCI）期间背侧VFH测试所得的触觉阈值与慢性期测得的足底VFH阈值具有高度一致性。图2）。根据足底或背侧测试得出的触觉阈值在分级脊髓损伤（SCI）中出现下降图3^3,5）。这种过敏反应在脊髓损伤后7天即可出现，并在实验的整个持续期间内保持。^3-4,6尽管不同程度的脊髓损伤（SCI）对足垫的触觉感觉阈值无显著影响，但在更严重的SCI情况下，感觉阈值会出现下降图3）。重要的是，损伤水平以下的痛觉过敏是一种全或无的反应，当病灶中心处的白质损失超过60%时即会发生。图 4³).

触觉阈值可能会衰减，并对较低的 VFH 力量产生人为反应。至少有两种情况可导致阈值衰减：以快速戳刺或刺入的方式将 VFH 施加于皮肤，或在刺激应用之间等待时间不足。为了确保所测得的触觉阈值真实可靠，必须注意以相近的低速方式施加每个 VFH 刺激，且刺激间间隔必须至少为 30 秒。我们还发现，进食行为可减少阈值衰减⁵。

图 1. 示范足底和背侧冯·弗雷毛（von Frey hair, VFH）测试中VFH刺激部位的示意图与照片。A) 进行足底VFH测试时，应将冯·弗雷毛以垂直方向缓慢而稳定地施加于后肢足底中部，位置约为中节趾骨后方约1 cm处（如后肢足底表面示意图中红色方框所示），直至其弯曲。B 和 C) 采用背侧VFH技术时，如照片所示，将大鼠松散地包裹在手术毛巾中。VFH应施加于足背第一和第二跖骨之间，距关节近端约1 cm处。

图 2. 背侧 von Frey 丝感觉阈值与标准足底 von Frey 丝结果相关（n=44；Pearson 相关系数 = 0.503，p < 0.01，r² = 0.67）。虚线表示使用背侧 von Frey 丝或足底 von Frey 丝技术判断异常性疼痛感觉的截断阈值，表明在脊髓损伤后 7 天通过背侧 von Frey 丝测试得到的异常性疼痛阈值可预测由足底 von Frey 丝方法确定的慢性损伤水平以下异常性疼痛。

图 3. 脊髓损伤早期背部 von Frey 细丝感觉阈值可预测后期不同损伤程度下的触觉异常性疼痛（allodynia）及非异常性触觉敏感性。SCI 后 7 天的背部 von Frey 细丝测量值与 SCI 后 28 天的足底 von Frey 细丝测量值之间表现出可比的感觉阈值。在广泛的脊髓损伤程度范围内均观察到显著的相似性，其中中度至重度脊髓损伤表现出显著的异常性疼痛（p<.05，1.1 mm 位移 vs. 其他所有组）。

图4. 接受椎板切除术（无SCI）及SCI各组大鼠在SCI后6周时出现后足异常性疼痛的百分比。仅在中度或重度SCI大鼠（OSU ESCID装置，脊髓位移0.9、1.1、1.25、1.3 mm）中观察到异常性疼痛，而轻度SCI大鼠（脊髓位移0.3、0.5、0.7 mm）对触觉刺激表现出正常反应。图中还包括在损伤中心处染色显示髓鞘的代表性冠状脊髓切片，分别对应椎板切除术（未损伤对照组）、轻度（0.5 mm位移）、中度（1.1 mm位移）和重度（1.3 mm位移）脊髓挫伤，以展示与该种过敏反应相关的轴突保留程度。（比例尺 = 0.5 mm）。

图5. 上下法 von Frey 毛发测试的示例数据表。每次试验均记录毛发数值及结果（阳性或阴性）。记录测试过程中是否存在上脊髓感知的迹象。测试结束时，统计各毛发数值下的反应次数。示例数据中选定的阈值以圆圈标出。

讨论

本文介绍的VFH检测方法代表了两种对大鼠脊髓损伤（SCI）模型敏感且有效的检测范式。重要的是，背侧VFH测试旨在评估中胸段SCI后急性期大鼠后肢触觉感知的恢复情况，此时大鼠尚无法用后肢直立站立。该检测范式也可用于大鼠恢复体重支撑能力后，以及颈段SCI后的后肢功能评估。

本文展示的两种实验范式利用经过校准的VFH（Von Frey纤毛）来测定每只后肢爪垫的触觉阈值。其他方法则是通过记录动物对通常无害或通常有害刺激的回缩反应频率来评估痛觉。我们先前的研究表明，触觉阈值的微小改善可能意味着慢性神经病理性疼痛的存在与否，以及正常触觉感知之间的差异。因此，采用能够测定疼痛阈值的实验检测方法，可能有助于将潜在的治疗干预手段转化为临床应用。

与所有行为学测试一样，必须尽量减少测试环境中可能影响行为测试结果的混杂因素⁹。因此，每次测试应在每天的同一时间、在温度和湿度受控的同一房间内进行。此外，由于大鼠通过超声波范围进行声音交流，因此在测试开始前，应将等待测试的大鼠安置在另一个独立的房间中。Langford et ...

材料

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