在大鼠中诱导与监测过继性迟发型超敏反应

摘要

迟发型超敏反应（DTH）是一种由CCR7-效应记忆T（TEM）淋巴细胞介导的炎症反应。本文演示了如何激活抗原特异性TEM细胞，在Lewis大鼠中诱导过继性DTH反应，并监测其炎症反应过程。

摘要

迟发型超敏反应（DTH）是一种由CCR7-效应记忆T淋巴细胞介导的炎症反应，这些细胞会浸润至已被免疫系统致敏的抗原注射部位。该炎症反应的特征是抗原攻击部位出现红肿。DTH是评估免疫抑制剂体内功效的便捷模型。皮肤DTH可通过过继转移抗原特异性T淋巴细胞，或通过抗原主动免疫后，在特定皮肤区域进行皮内抗原攻击以诱导炎症反应。DTH反应可针对多种抗原诱导，例如卵清蛋白、结核菌素、破伤风类毒素或钥孔血蓝蛋白。此类反应也可针对自身抗原诱导，例如在以髓鞘碱性蛋白（MBP）诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠模型（多发性硬化动物模型）中针对MBP产生的反应（1）。 本文将演示如何在Lewis大鼠中诱导过继性DTH反应。首先，我们在体外刺激卵清蛋白特异性T细胞，并将活化的细胞经腹腔注射至未免疫的正常大鼠。待细胞在体内平衡2天后，用卵清蛋白对大鼠一侧耳廓进行皮内攻击，另一侧耳则注射生理盐水作为对照。炎症反应在攻击后3至72小时可见，通过测量耳部厚度评估DTH反应的严重程度。

方案

1. 卵清蛋白特异性T淋巴细胞的刺激

在刺激培养基中，将静息的卵清蛋白特异性T细胞与卵清蛋白共同孵育，同时加入经照射的Lewis大鼠胸腺细胞（30 Gy）作为抗原呈递细胞（APCs）。（刺激培养基配制方法：以DMEM为基础，添加青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺、非必需氨基酸（NEAA）、RPMI维生素、2-巯基乙醇（2ME）、大鼠血清和卵清蛋白，各成分终浓度见材料列表。）

大鼠血清制备

1. 我们从作为胸腺供体而处死的大鼠中采集血清。
2. 大鼠通过吸入氟烷进行深度麻醉，随后使用10 ml注射器和23 G 1"针头经心脏灌注尽可能抽取血液（每只大鼠5–10 ml），然后立即斩首以确保动物死亡。
3. 血液在37°C下静置凝固10分钟，再置于冰上10分钟。
4. 去除凝块后，将剩余液体离心。
5. 收集血清，经无菌过滤后于-20°C保存。

抗原呈递细胞的制备

1. 使用无菌器械取断头大鼠的胸腺，置于含青霉素和链霉素的冰冻磷酸盐缓冲液（PBS-PS）中。
2. 将胸腺组织置于组织培养罩中，清除血凝块及其他污染组织，将其剪碎后放入置于含10 ml PBS-PS的10 cm培养皿中的细胞筛（Fisher # 08-771-2）中。
3. 使用无菌1 ml注射器活塞的尾部....

讨论

抗原攻击也可在其他部位进行，例如背部皮肤（2）。然而我们发现这种方法存在挑战。如本视频所示，使用耳廓进行抗原攻击可实现对迟发型超敏反应（DTH）最精确的测量。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	GIBCO，隶属于 Life Technologies	12430-062	500ml
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	S8636	刺激培养基中终浓度为 1 mM
青霉素 – 链霉素 – L-谷氨酰胺	Cambrex/BioWhittaker	17-718R	100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM（终浓度），溶于刺激培养基
非必需氨基酸	Sigma-Aldrich	R7131	NEAA，终浓度1%，加入刺激培养基中
RPMI 维生素	Sigma-Aldrich	R7256	1% 终浓度，加入刺激培养基中
β-巯基乙醇–乙醇	Sigma-Aldrich	M6250	2ME, 50 μ刺激培养基中，M终浓度
同基因型大鼠血清			1% 终浓度。详见实验方案中的说明。
卵清蛋白	Sigma-Aldrich	A5503	10 μg/ml 终浓度，溶于刺激培养基中。