迟发型超敏反应（DTH）是一种由CCR7-效应记忆T（TEM）淋巴细胞介导的炎症反应。本文演示了如何激活抗原特异性TEM细胞，在Lewis大鼠中诱导过继性DTH反应，并监测其炎症反应过程。
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摘要
摘要
迟发型超敏反应（DTH）是一种由CCR7-效应记忆T淋巴细胞介导的炎症反应，这些细胞会浸润至已被免疫系统致敏的抗原注射部位。该炎症反应的特征是抗原攻击部位出现红肿。DTH是评估免疫抑制剂体内功效的便捷模型。皮肤DTH可通过过继转移抗原特异性T淋巴细胞，或通过抗原主动免疫后，在特定皮肤区域进行皮内抗原攻击以诱导炎症反应。DTH反应可针对多种抗原诱导，例如卵清蛋白、结核菌素、破伤风类毒素或钥孔血蓝蛋白。此类反应也可针对自身抗原诱导，例如在以髓鞘碱性蛋白（MBP）诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠模型（多发性硬化动物模型）中针对MBP产生的反应（1）。
本文将演示如何在Lewis大鼠中诱导过继性DTH反应。首先，我们在体外刺激卵清蛋白特异性T细胞，并将活化的细胞经腹腔注射至未免疫的正常大鼠。待细胞在体内平衡2天后，用卵清蛋白对大鼠一侧耳廓进行皮内攻击，另一侧耳则注射生理盐水作为对照。炎症反应在攻击后3至72小时可见，通过测量耳部厚度评估DTH反应的严重程度。
方案
1. 卵清蛋白特异性T淋巴细胞的刺激
在刺激培养基中，将静息的卵清蛋白特异性T细胞与卵清蛋白共同孵育，同时加入经照射的Lewis大鼠胸腺细胞（30 Gy）作为抗原呈递细胞（APCs）。（刺激培养基配制方法：以DMEM为基础，添加青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺、非必需氨基酸（NEAA）、RPMI维生素、2-巯基乙醇（2ME）、大鼠血清和卵清蛋白，各成分终浓度见材料列表。）
大鼠血清制备
- 我们从作为胸腺供体而处死的大鼠中采集血清。
- 大鼠通过吸入氟烷进行深度麻醉，随后使用10 ml注射器和23 G 1"针头经心脏灌注尽可能抽取血液（每只大鼠5–10 ml），然后立即斩首以确保动物死亡。
- 血液在37°C下静置凝固10分钟，再置于冰上10分钟。
- 去除凝块后，将剩余液体离心。
- 收集血清，经无菌过滤后于-20°C保存。
抗原呈递细胞的制备
- 使用无菌器械取断头大鼠的胸腺，置于含青霉素和链霉素的冰冻磷酸盐缓冲液（PBS-PS）中。
- 将胸腺组织置于组织培养罩中，清除血凝块及其他污染组织，将其剪碎后放入置于含10 ml PBS-PS的10 cm培养皿中的细胞筛（Fisher # 08-771-2）中。
- 使用无菌1 ml注射器活塞的尾部将每块组织通过细胞筛滤器压碎，收集单细胞悬液至预冷的50 ml离心管中。
- 用额外的 20–40 ml PBS-PS 冲洗细胞滤筛。将悬液在 1250g 离心，弃上清，将沉淀物重悬于 PBS-PS 中（每胸腺 5 ml），置于冰上。
- 用γ射线照射器对该悬浮液进行照射（30 Gy），随后立即用50 ml PBS-PS洗涤两次。
注意：最佳的胸腺供体为5至7周龄的年轻成年大鼠。也可使用长达10周龄的大鼠，但细胞数量随年龄增长而减少。性别并不重要，尽管有些人认为雄性大鼠是更好的胸腺供体。我们始终使用雌性大鼠，因为所有动物均饲养在同一房间内，而我们不希望将雄性和雌性饲养在同一房间。
刺激
- 洗涤T淋巴细胞一次，并进行计数。
- 计数抗原呈递细胞。
- 将3 × 106个卵清蛋白特异性T细胞与150 × 106个APC在含有10 ml刺激培养基的10 cm培养皿中混合。
- 在37°C下孵育48小时。
2. 卵清蛋白特异性T淋巴细胞的过继性转移
- 我们用作受体的大鼠为雌性，7至10周龄。
- 计数T淋巴细胞，它们应为体积较大且呈圆形。抗原呈递细胞将已死亡。
- 离心收集T淋巴细胞，并用PBS重悬至浓度为10 × 106 个细胞/ml。
- 使用3 ml注射器和23 G 1"针头，每只腹腔注射1 ml。
3. 耳部抗原激发实验
- 过继转移两天后，向一只耳朵注射20 μl浓度为1 mg/ml的卵清蛋白溶液（= 相关抗原），另一只耳朵注射生理盐水（或无关抗原）。请勿过滤抗原溶液，以免丢失可增强炎症反应的聚集体。
注意：应将大鼠麻醉以避免其移动。如果你是右利手，应用左手拇指和食指夹住耳朵，食指置于耳廓内侧，使大鼠面朝向你。 - 使用27G ½"针头将溶液注射至耳廓部位。尽量将所有大鼠的注射位置保持完全一致。
4. DTH 的测量
- 耳朵将开始发红并肿胀，这是炎症的迹象。使用弹簧式测微计（例如 Mitutoyo 公司的 PK-0505 型号）测量每只耳朵的厚度。
- 在每个时间点对每只耳朵进行 5–6 次测量，并计算平均值。
- 最大肿胀程度应出现在 24 至 72 小时之间。
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讨论
抗原攻击也可在其他部位进行，例如背部皮肤（2）。然而我们发现这种方法存在挑战。如本视频所示，使用耳廓进行抗原攻击可实现对迟发型超敏反应（DTH）最精确的测量。
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致谢
我们感谢德国马丁斯里德的 Alexander Flugel 博士为我们提供了本实验方案中使用的表达 GFP 且特异性识别卵清蛋白的 T 细胞系。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 12430-062 | 500ml |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | S8636 | 刺激培养基中终浓度为 1 mM |
| 青霉素 – 链霉素 – L-谷氨酰胺 | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM（终浓度），溶于刺激培养基 |
| 非必需氨基酸 | Sigma-Aldrich | R7131 | NEAA，终浓度1%，加入刺激培养基中 |
| RPMI 维生素 | Sigma-Aldrich | R7256 | 1% 终浓度，加入刺激培养基中 |
| β-巯基乙醇–乙醇 | Sigma-Aldrich | M6250 | 2ME, 50 μ刺激培养基中，M终浓度 |
| 同基因型大鼠血清 | 1% 终浓度。详见实验方案中的说明。 | ||
| 卵清蛋白 | Sigma-Aldrich | A5503 | 10 μg/ml 终浓度，溶于刺激培养基中。 |
参考文献
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. , 166-936 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).
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