本文描述了一种定制的实时共聚焦扫描成像系统的完整构建方法。该系统可轻松用于视频速率显微镜和显微内窥镜检查，能够实现多种标准商用共聚焦系统无法达到的成像几何结构和应用，且成本仅为后者的一小部分。
本文内容
摘要
摘要
共聚焦显微镜已成为生物学和生物医学科学中不可或缺的工具，能够对复杂系统进行快速、高灵敏度和高分辨率的光学切片。例如，共聚焦显微镜常规用于研究特定的细胞靶标1，监测活细胞内的动态过程2-4，以及可视化整个生物体的三维发育过程5,6。共聚焦成像系统的扩展技术，如共聚焦微内窥镜，可在体内实现高分辨率成像in vivo7，目前正被应用于临床环境中的疾病成像与诊断8,9。
共聚焦显微镜利用简单的几何光学原理，通过生成所谓的“光学切片”来实现三维分辨率。在标准的宽场显微镜中，样品发出的荧光由物镜收集并直接传递至探测器。这种方法适用于薄样品的成像，但对于厚样品，来自物镜焦平面上方和下方的荧光会导致图像模糊。相比之下，共聚焦显微镜能够实现虚拟的光学切片，通过抑制非焦平面的杂散光，构建出样品高分辨率的三维图像。
共聚焦显微镜通过在检测光路中使用共聚焦孔径来实现这一功能。物镜从样品收集的荧光信号经扫描镜反射后，穿过主二向色镜；该二向色镜经过精心选择，可反射较短波长（如激光激发光），同时透射较长波长的斯托克斯位移后的荧光发射光。随后，这一长波长荧光信号被传递至位于针孔两侧的一对透镜，该针孔的位置恰好处于与物镜焦平面共轭的平面上。来自样品焦体积的光子被物镜准直后，再由共聚焦透镜聚焦并通过针孔。而来自焦平面上方或下方产生的荧光则无法被正确准直，因而不能通过共聚焦针孔1，从而形成光学切片，使得只有来自显微镜焦点处的光可见。（图1）因此，针孔实际上在焦平面上起到一个虚拟孔径的作用，将检测到的发射光限制在唯一一个有限的空间位置。
现代商用共聚焦显微镜为用户提供全自动操作，使以往复杂的成像流程变得相对简单且易于实施。尽管这些系统具有高度灵活性和强大功能，但商用共聚焦显微镜并不适用于所有共聚焦成像任务，例如许多 在体 成像应用。如果无法构建满足其需求的定制化成像系统，许多重要的实验将难以实现。
本文提供了一种从基础部件完整构建定制化视频速率共聚焦成像系统的逐步方法。将采用振镜式共振扫描镜作为快速扫描轴，构建正置显微镜，而慢速扫描轴则使用标准速度的振镜式共振扫描镜。为了在物镜焦点处形成精确的扫描光束，这些扫描镜将通过四片中继透镜被放置在所谓的远心平面位置。共聚焦检测将使用现成的标准光电倍增管（PMT）实现，图像则通过Matrox图像采集卡及其配套软件进行采集与显示。
方案
激光波长、二向色镜和光学滤光片的选择应根据实验中所使用的特定染料来确定。例如，对使用 Alexa Fluor 488 染色的样品进行共聚焦成像时，最佳配置是采用 488 nm 激光、500 nm 长通二向色镜以及中心波长为 515 nm、带宽为 30 nm 的带通滤光片。相比之下，对红色染料 Alexa Fluor 647 进行共聚焦成像则需要另一组不同的光学元件。本方案中所使用的显微镜设计用于观察在 400 nm 处具有强吸收且发射波长超过 450 nm 的任何染料。因此，我们选用 406 nm 激发激光和 425 nm 长通二向色镜来反射激光束。通过选择合适的发射滤光片，可实现对激发后荧光染料的特异性成像。在整个方案中，凡标明之处均必须使用合适的光学安装硬件；使用不恰当或临时替代的硬件将无法良好保持光路准直，并可能带来安全隐患。
1. 设置共振振镜与中继光学系统
构建任何类型的共聚焦扫描系统时，一个重要的概念是物方或像方远心性（telecentricity）。在远心光学系统中，透镜之间的间距等于其焦距之和，使得系统的放大倍率仅由焦距之比决定1。这使得能够构建一种光学中继系统，其中放大倍率及系统的其他特性可通过选择透镜而被明确设定。另一个重要概念涉及所谓的“固定”光学平面，也称为“孔径平面”。孔径平面是指在光路中光束不发生横向移动的位置。在此显微镜设计中，存在三个重要的孔径平面：第一和第二扫描反射镜，以及物镜的后孔径。为了在物镜的焦平面上实现最佳的光束扫描，进入物镜后孔径的光束必须保持位置固定，仅在角度上进行扫描。为了形成这种位置固定而角度扫描的平面，需要将第一和第二扫描反射镜置于与物镜后孔径共轭且远心的平面上。放置在反射镜与物镜之间的透镜用于在这些固定平面之间传递角度扫描的光束（图 2）。扫描反射镜安装在两个扫描振镜（galvo）上，每个振镜负责成像平面某一方向（X 和 Y）的扫描。为了实现视频速率成像所需的行扫描速率，需要使用高频谐振振镜来扫描x轴（也称为“快速”轴）。这些振镜采用灵敏的闭环反馈电路，以产生正弦扫描模式，并能够在非常高的频率下运行；本系统选用了8 kHz的振镜。
- 将光纤准直器安装在光学支架上，并使用调节螺丝粗略调整光束，使其在水平和垂直方向上均沿直线传播。然后取一个光阑，将其放置在光纤准直器前方，调节光阑的垂直高度，使光束恰好通过光阑中心。接着将光阑沿光路远离准直器移动，观察光束是否仍通过光阑中心。若未通过，使用两个调节螺丝调整光束在光阑上的位置。
- 将安装好的二向色镜置于光路中，使激光束大致位于镜面中心位置。在将镜片夹紧固定于平台前，旋转镜架使反射光束偏转约90度，并粗略调节反射方向，使反射激光束的垂直高度保持不变。
- 将安装好的谐振式检流计扫描镜置入激光光路中，注意确保激光束精确地位于镜面的水平中心。在本方案中，谐振检流计镜已用环氧树脂直接粘接至镜架上。旋转镜架使激光束以90度角反射，并粗略调节镜面反射，以保持激光束反射后的垂直高度不变。
- 为了将任意光线引导至指定方向，必须通过定义空间中的两个点来确定该光线的传播路径。通常通过在期望的水平和垂直路径上放置两个光阑，并调节激光束使其穿过每个光阑的中心来实现。调节光束需要四个自由度：每个光阑分别具有水平和垂直两个自由度。实现这些自由度最常见且直接的方法是使用两面镜子来引导或“步进”激光束。
取两个光阑，参照从谐振检流计镜反射出的激光束，按照步骤1.1的方法设定其垂直高度。然后以光学面包板上的螺孔作为视觉引导，将两个光阑沿直线夹紧固定。 - 调节二向色镜和谐振检流计镜，使激光束穿过两个光阑的中心。使用光路中的第一面镜（二向色镜）使光束在第一个光阑上居中，再使用光路中的第二面镜（谐振检流游戏副本）使光束在第二个光阑上居中。反复迭代调节这两面镜子，直至光束同时通过两个光阑中心，并在整个过程中确保从谐振检流计镜反射出的激光束仍大致从镜面中心反射。若光束发生偏移，需调节光纤准直器支架并重复上述迭代步骤。
- 当光束已居中于两个光阑时，接下来放置两个中继透镜，用于将第一个固定的、物方远心平面（i.e.，谐振检流计镜）成像至第二个固定的、物方远心平面（i.e.，标准速度检流计镜）。对于本台显微镜，第一组中继透镜选用相同焦距“f”的透镜，因此在该远心系统中两镜之间的距离为4f。为确保透镜在光路中精确居中，采用透镜对准技巧：将第一片透镜置入光路，观察紧随其后的光阑上激光光斑的位置；然后垂直调节透镜高度，使光束垂直中心与光阑中心对齐；最后调节水平方向，使光束在光阑上居中。对第二片透镜执行相同操作。
2. 设置第二扫描镜并旋转显微镜
- 为了确定第二个物方远心平面的精确位置，将谐振振镜连接至其扫描单元并开启。使用一张白色名片追踪光束通过两个透镜的路径。在距离谐振振镜约4f的位置处，可找到物方远心平面，此时激光束看起来完全静止。在光学平台上标记该位置。
- 将标准扫描振镜精确置于该物方远心平面位置，并调节振镜的高度和位置，使远心平面上的光束准确照射到扫描振镜的中心。在此过程中，必须为振镜控制硬件供电，并在扫描振镜输入端施加0伏电压，以确保振镜处于其中心平衡位置。仔细调节振镜角度，使光束垂直向上反射，然后轻轻固定振镜位置。
- 由于我们正在构建一台直立式显微镜，接下来需使用90度安装支架将第二块光学平台以90度角固定。在此操作过程中，务必关闭激光器和扫描电子设备，断开光纤连接，并断开扫描振镜。为便于后续对准操作，在将支架用螺栓固定后，小心旋转整个显微镜系统，使新的光学平台处于水平状态。使用夹具将光学平台固定在工作台面上。此后，原先垂直方向的其余组件可方便地在水平光学平台上完成安装与调整。
3. 设置扫描、聚光镜和物镜
接下来，我们将设置第二组中继透镜，正式称为“扫描透镜”和“管镜”。选择合适的透镜组合至关重要，以在物镜焦平面处实现正确的放大倍数，并优化最终图像分辨率。首先，为了充分发挥任意给定物镜的数值孔径（NA）性能，入射到物镜后端的激光束必须完全充满物镜的后光阑；只有这样，物镜才能形成最紧密的聚焦光斑。不同物镜的后光阑尺寸各不相同；因此应选择适当的透镜放大倍率，使后光阑被略微过充满。其次，为了实现正确的放大倍数，物镜必须与其设计所对应的管镜焦距相匹配。遗憾的是，不同显微镜物镜制造商采用了不同的管镜焦距标准，因此在构建显微镜时，必须为所使用的特定物镜选用正确的管镜。此外，某些制造商（如 Zeiss）设计其管镜时，会补偿其配套物镜特有的色差，若使用不匹配的物镜-管镜组合，反而会引入原本不存在的新像差。我们通常更倾向于使用 Olympus 物镜，因为其所有色差校正均在物镜内部完成，从而简化了物镜与管镜的匹配过程。尽管在物镜与管镜不匹配的情况下显微镜仍可工作，但实际的显微镜放大倍数很可能与物镜上标注的放大倍数不符。在本例显微镜的构建中，确定最佳后光阑尺寸为 4 mm，因此扫描透镜与管镜之间需要 1:4 的放大倍率关系。在此定制显微镜构建中，我们将采用焦距为 75 mm 的扫描透镜和焦距为 300 mm 的管镜。
- 由于第二扫描镜与物镜焦点之间的总距离较大，显微镜搭建的这一部分首先需布置用于将光束引导至物镜的反射镜。将第一块较大的直径为2英寸（50 mm）的反射镜放置在光学平台边缘附近，并旋转镜架，使激光束偏转约90度。粗略调节镜面反射，使光束保持相同的垂直高度。将另一块2英寸反射镜置于光学平台的对侧边缘，使其方向可将光束向下偏转90度。使用调节螺丝确保光束的垂直高度不变。设置两个小孔光阑（iris），如步骤1.4所述，并按照步骤1.5的指示调节两个反射镜，使光束在两个小孔光阑中心对准。
- 保持小孔光阑位置不变，将扫描透镜插入光路中，并调节其水平和垂直位置，使激光光斑在第一个小孔光阑上居中。在距离该透镜75 mm + 300 mm的位置（位于两块反射镜之间），小心放置大尺寸2英寸的管镜，并调节其水平和垂直位置，使光束在第一个小孔光阑上居中。为便于将来维持光路对准，建议保留这些小孔光阑；在本应用中，可将一张带有合适孔径的名片粘贴在支架上并插入光路中作为替代。
- 所有反射镜和透镜就位后，开始驱动谐振检流计扫描镜和标准扫描镜。在本系统中，标准扫描镜最终将通过定制的控制电路（如图3所述）与谐振镜的扫描速率同步，从而实现更优的垂直与水平方向同步。然而，出于对准目的或许多成像应用中，可直接使用函数发生器输出的锯齿波驱动扫描镜。使用一张名片，在管镜后方300 mm处定位激光光束。尽管光束在显微镜其他部分同时进行垂直和水平方向的扫描，但在该位置附近光束应完全静止。此处即为物镜后孔径的放置位置。若水平与垂直方向的静止平面在光路中未能重合于同一平面，应小心松开管镜夹具并沿光轴方向平移管镜，以确保两个静止平面尽可能重叠。重新调节管镜的垂直和水平位置，并牢固夹紧固定。
- 将物镜插入光路，确保物镜的后孔径尽可能靠近静止平面。由于不同制造商的设计差异，物镜的实际后孔径位置可能并不总是位于物镜物理后端开口处。因此，最好始终向制造商确认实际后孔径的位置。
- 安装样品台，并确保用于实现z轴移动的平移架在其全行程范围内移动时不会与物镜镜架发生碰撞。
4. 设置并校准共聚焦针孔与检测器
- 断开所有电源和光纤连接，旋转显微镜组件，使其重新放置在承载共振扫描镜的光学平台上。将光学平台牢固夹紧，然后重新连接光纤与准直器，并重新连接两个扫描振镜及其控制电缆。与之前相同，将标准扫描振镜的控制电压设为 0 伏。
- 在样品台上放置一张名片或少量高亮度染料，置于物镜焦平面处，并用两张盖玻片夹住。染料的选择取决于所用激光器和二向色镜；在此示例中，我们将利用白色名片的荧光发射来校准共聚焦检测系统。量子点也可用于校准，因其亮度高且不易发生光漂白。其他可选方案包括荧光微球和/或经衣物增白剂处理的织物样品，二者均具有强荧光。打开激光光源，使用平移台将样品移入显微镜焦点。一旦聚焦完成，样品产生的荧光应可见于二向色镜后方，如下一步所述。将激光功率调至最大，以使荧光尽可能明亮。
- 使用名片，追踪样品发出的荧光，经物镜返回并通过扫描系统到达二向色镜。二向色镜将透射荧光发射光，同时反射激光束；在二向色镜另一侧找到该荧光信号。现在，在二向色镜后方放置一面反射镜，将其以 90 度角反射荧光。取一个虹膜光阑（如步骤 1.1 所示），配合反射镜使用，使荧光光束尽可能笔直且平行于光学平台传播。此步骤在弱光环境下操作效果最佳。
- 按照 图 2 所示设置共聚焦针孔单元。我们发现 ThorLabs 公司的空间滤波笼式安装组件非常适合此任务。选择合适的针孔尺寸至关重要，以确保共聚焦系统在不显著损失信号的前提下达到最佳分辨率。对于本定制显微镜，选用 100 μm 的针孔尺寸。将空间滤波单元置于荧光光路中，注意使第一个聚焦透镜支架精确对准荧光发射光束。在单元内安装短焦距透镜（也可使用显微物镜）后，滑动 z 向平移支架，直至在针孔表面观察到清晰的聚焦光斑。确保整个单元沿荧光光束所确定的精确直线方向排列。将该单元夹紧固定在光学平台上。
即使在黑暗环境中，大多数样品的发射荧光仍远弱于环境光水平。因此，必须沿发射光路采取充分的遮光/挡光措施，以防杂散光污染。此外，高环境光水平可能使许多光电倍增管（PMT）过载甚至损坏，尤其是无电流保护功能的型号。因此强烈建议使用透镜管封闭发射光路；如本例所示，一个充分屏蔽的系统可在普通室内光照下运行，几乎无杂散光干扰。 - 现在，使用平移台上的调节旋钮，系统性地移动共聚焦针孔，寻找使通过针孔的荧光信号最强的位置。该位置可通过在针孔支架表面进行二维搜索，迭代调节两个轴向来最简便地确定。找到信号最强位置后，在针孔后方的笼式支架上安装准直透镜。使用名片找到通过共聚焦单元的荧光发射，沿支架滑动准直透镜，直至发射的荧光信号尽可能准直。光束准直后，务必在光路中的透镜管内插入适当的滤光片。
- 设置光电倍增管（PMT）组件。在荧光发射光路中放置一个焦距为 50 mm 的透镜，并使用名片找到其焦点。在光学平台上标记该位置。现在，完全关闭激光器——这一点非常重要，因为杂散光或未衰减的激光可能永久损坏大多数 PMT。将 PMT 定位，使其感光区域尽可能接近所标记的焦点位置。使用可调透镜管将 PMT 组件与聚焦透镜连接，并仔细用黑色胶带包裹针孔后所有暴露的光路部分。
- 打开激光器，但务必保持其功率极低，使荧光发射 barely visible（勉强可见）。开启 PMT，随着控制电压升高，仔细在示波器上读取其输出电压。PMT 通过一系列电子倍增级产生信号；若光电流相对于入射光强过高，管体可能遭受不可逆损伤。因此强烈推荐使用带限流电路的 PMT，特别是对未使用过此类探测器的用户。
逐步提高 PMT 控制电压，直至在示波器屏幕上观察到尖峰状信号和/或直流偏移；对于大多数 PMT，该信号相对于地为负。通过关闭激光器以观察信号消失，确认该信号确实来源于荧光。 - 最后，通过迭代调整聚焦透镜的 z 向位置，再调节 yz 向平移台，使示波器上的信号达到最大，完成针孔的最终对准。
- 视频速率显微镜的硬件部分已完成！现在按照 图 3 所示连接扫描镜、自定义控制板和计算机。与上述步骤类似，建议首先使用成像系统观察一个已知尺寸的标准样品，以确定显微镜的最佳分辨率，并计算成像系统的像素-分辨率常数。可用的标准样品有多种，例如具有已知字号的白色名片、荧光或反射式空军靶标、以及荧光微球。
5. 共聚焦扫描微内窥镜系统的准备
在本装置中，我们使用了一种相干图像光纤，它由数千根光纤纤芯组成的束构成；这种结构可使图像通过光纤进行传输，并在另一端轻松地重建和/或扩展（图4）。用于制造该内窥镜的相干光纤束两端均经过抛光处理，因此属于所谓的“接触式”微内窥镜。只有当微内窥镜探头与物体紧密接触时，才能形成清晰对焦的图像。在这种伪共聚焦结构中，显微镜的扫描作用将激光依次聚焦到单个光纤纤芯上，同时共聚焦针孔确保来自周围纤芯的离焦光无法通过到达探测器。对于不同的成像应用，可在远端探头处添加一组透镜，以实现前向、远距离的荧光成像。微光学透镜以及梯度折射率（GRIN）透镜均可方便地适用于此用途，并可使用光学级胶水将其固定在光纤远端端面。
- 为建立微内窥镜成像系统，小心移除样品台，并替换为光纤固定台（图5）。将光纤束的一端浸入稀释的染料溶液中，使所有光纤纤芯均匀产生荧光发射。开启扫描系统，并调节光纤夹持器，使光纤束的另一端（近端，即靠近显微镜光学系统的一端）处于焦平面上。首先，使用平移调节螺钉将光纤在扫描视野中居中。然后，在扫描过程中观察近端光纤尖端的荧光发射图像。当整个微内窥镜表面处于物镜的焦平面时，各光纤纤芯的荧光发射将尽可能均匀。使用角度调节旋钮调整光纤端面，使所有纤芯亮度一致。在此调节过程中，可能需要重新调整平移位置，以再次将光纤居中于扫描视野。重复上述调节步骤，直至整个光纤尖端准确聚焦。
- 使用微内窥镜前，用经HPLC级甲醇轻微润湿的镜头纸轻轻清洁远端尖端。与前述方法相同，使用已知尺寸标准物测量并计算微内窥镜成像系统的分辨率。
6. 典型结果：
图6展示了一个用于显微内镜的直立式共聚焦扫描显微镜组装完成后的示例。图中激光束和发射光束以示意图形式标出，便于观察。在显微内镜操作过程中，光纤固定装置用于固定成像光纤。该光纤固定装置可方便地替换为xy或xyz平移台，从而作为直立式显微镜平台使用。ThorLabs公司的PT3（xyz平移）部件，或两个堆叠的PT1平移台（xy平移），配合如ThorLabs AP90型号的直角支架，均适用于此用途。
采用视频速率帧采集卡从输入信号中生成图像。图7显示了使用视频速率显微镜扫描系统拍摄的、印在白色名片上的小写字母“m”的代表性测试图像。漂白的白纸含有可被紫外光和蓝光激发的荧光团，从而在暗色字母“m”后方形成明亮的背景。选择中心波长为515 nm的发射滤光片来收集该荧光发射信号。图像中可观察到轻微的畸变，尤其在图像帧的侧边缘附近较为明显。这种畸变源于8 kHz振镜的正弦扫描模式，下文将对此进行详细讨论。
图 1. 展示共聚焦显微镜工作原理的示意图。从物镜焦点发出的光线经系统反射后，通过共聚焦针孔（红色）聚焦。从物镜焦点上方（蓝色）或下方（绿色）发出的光线无法以平行光束形式从物镜出射，因此无法高效通过共聚焦针孔。
图2. 显示光束扫描系统中所有光路的示意图。扫描镜位于与固定的物镜后焦平面共轭的远心平面。固定平面之间的透镜组用于传递扫描后的光束。前两片中继透镜具有相等的焦距，构成一个1:1的望远系统。第二组透镜，正式称为扫描透镜和管镜，其焦距不必相等，通常作为光束扩束望远系统，以确保物镜后光阑被充分填充。从样品发出的光沿原路返回扫描系统，并穿过二向色镜。一个短焦透镜将发射光聚焦通过共聚焦针孔，随后由另一透镜使其准直。最后一个透镜将经过共聚焦滤波的发射光聚焦到光电倍增管上。 点击此处查看该图像的完整尺寸版本。
图3. （a）扫描电子系统设置的示意图。显微镜的整体参考信号和时间基准为快速轴谐振振镜的“sync”TTL输出，该输出在每条扫描线结束时产生一个TTL脉冲即，当振镜完成一个扫描周期时）。这为图像采集卡提供水平同步信号（H-sync）。振镜的同步输出同时也连接至垂直同步控制板，该控制板在接收到每个H-sync脉冲后逐步升高其输出电压，从而生成驱动慢扫描轴的锯齿波形。当所有扫描线均已完成扫描后，垂直同步板将重置锯齿波形，并产生一个TTL脉冲，作为图像采集卡的垂直同步信号（V-sync）。图像采集卡的最后一个输入信号来自光电倍增管的模拟输出信号（注意：许多光电倍增管输出负电压，请务必据此设计电路并选择合适的硬件）。视频帧率图像由Matrox图像采集卡软件生成并显示。（b）示例控制电路。在此设计中，每个H-sync脉冲的电压通过运算放大器积分器进行“累加”/积分，以生成锯齿波的上升沿；同时，在TTL计数器阶段对脉冲进行同步计数。当达到预设的扫描线数时（即当光栅扫描完成时，计数器会生成一个低电平有效的“进位输出”脉冲，该脉冲驱动施密特触发器产生一个用于积分器的复位脉冲。该复位脉冲同时将计数器和运算放大器积分器复位，使电路为下一个周期做好准备。通过合理选择元器件，该电路可广泛适用于多种光栅尺寸。这只是其中一种实现方式，其他多种实现方式亦可能存在，并在特定情况下更受青睐。此外，该电路专为与Matrox图像采集卡配合使用而设计，此类图像采集卡可自动检测并校正图像相位。若将该电路用于其他图像采集卡，则可能需要额外的相位校正电路或软件。 单击此处查看该图像的完整尺寸版本。
图4. 通过相干光纤束的图像传输。在此示意图中，位于光纤束两侧的透镜按比例缩放，既用于将投影到光纤束输入端的图像进行匹配，也用于放大光纤束输出端的图像。
图5. 安装在五轴支架上的光纤束示例。使用一块小型直径为1英寸的铝块，将其钻孔以便插入成像光纤束。为确保稳定性，光纤在铝块的顶部和底部均用环氧树脂固定。
图6. 完整显微系统的图像，其中已连接显微内窥镜。为了更清晰地显示光路，激发光束路径以蓝色标出，而经过二向色镜后的发射光束路径以红线表示。
图7. 视频速率共聚焦扫描显微系统生成的示例图像。在白色名片明亮的荧光背景上，出现一个暗色的小写字母“m”。
讨论
该视频速率成像系统采用一个工作频率约为8 kHz的谐振检流计镜。谐振镜在满功率运行时可能产生较大噪音，其高音调在足够长时间暴露下可能令人不适甚至有害。尽管此处未作演示，但仍建议将谐振检流计镜置于透明外壳内，以显著降低系统噪声，和/或佩戴适当的听力保护装置（如耳塞）。
共振振镜以正弦波模式进行扫描。然而，图像采集卡在读取信号时，假设水平和垂直方向的扫描速度完全呈线性。由于正弦扫描在扫描范围边缘处速度变慢，因此在快速（水平）图像轴上可能出现图像压缩伪影。减小该问题的一种方法是，有意将共振振镜的扫描范围驱动得显著大于中继透镜的直径。通过这种方式，仅有正弦扫描模式中接近线性的中央扫描区域通过样品，从而最小化图像畸变。另一种方法是对采集的图像进行后处理，以实现快速轴的线性化。这可以通过对一个已知的荧光图案（例如网格）成像，并利用该已知图案的尺寸信息编写图像处理脚本，对采集的图像进行去扭曲来实现。
该特定扫描系统专为体内成像而设计，此类成像通常需要直立取向的视频速率显微镜。对于细胞成像实验，更常使用倒置显微镜。此处介绍的设计可轻松改造为构建此类倒置显微镜，仅需旋转最终直径为2英寸的反射镜即可。无需将反射镜定向以使扫描光束向下传播，而是可将其调整为向上反射光束。将物镜与样品台置于距反射镜相同距离的位置，即可实现倒置光路结构下的成像。若成像系统仅用于微型内窥镜成像，则完全无需在垂直方向上折叠显微镜设计。相反，整个扫描系统可构建于同一水平光学平台之上，物镜方向与光学台面平行。
请注意，本构建中使用的显微镜采用固定的针孔配置；虽然这种设计可最大程度地简化构建过程并便于对准，但对于希望获得更高灵活性的用户，可考虑采用可变针孔，如同大多数商用共聚焦显微镜中所配备的那样。通过允许用户调节针孔大小以适应不同发射光强度的样品，可更有效地优化特定样品在信号强度与分辨率之间的权衡。
为显微镜选择的光纤成像束至关重要。我们推荐使用住友（Sumitomo）相干光纤，因其光纤芯间距紧密且相对自体荧光较低。已发现藤仓（Fujikura）制造的光纤具有较强的自体荧光10，可能掩盖样品微弱的荧光信号，从而限制微型内窥镜的最终灵敏度。住友公司生产的光纤（例如本实验装置中使用的8-30N型号）其自体荧光水平明显低于藤仓同类产品。尽管拉丝式光纤束在微型内窥镜应用中可能具有吸引力，但其设计通常使单根光纤芯之间的间距过大，导致对物体的采样稀疏，遗漏大量潜在感兴趣的区域。
最后需要指出的是，尽管本文所述显微镜在多种体外（in vitro）和体内（in vivo）应用中均具有实用价值，且其成本仅为功能齐全的商业系统的很小一部分，但它不具备透射光检测、目镜观察或非共聚焦宽场落射荧光的光路等功能。虽然理论上可以从零开始构建包含这些功能的系统，但希望获得此类系统的读者可能更倾向于改造现有的商业系统以满足其需求，而非从头开始全新搭建。
披露
本视频的制作由Thorlabs, Inc.赞助。
致谢
作者感谢ThorLabs对本项目的支持。AJN希望感谢美国国家科学基金会研究生奖学金提供的支持。
本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）通过NIH主任新创新者奖计划资助，资助编号为1 DP2 OD007096-01。有关新创新者奖计划的信息，请访问http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/。作者谨此感谢Tom Hayes提供使用哈佛大学电子实验室的机会。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 515 nm 带通滤光片 | Chroma Technology Corp. | HQ515/50M | 46 FWHM |
| 消色差双合透镜，25.4 mm 直径 × 50 mm 焦距，MgF₂ 涂层 | Edmund Scientific | NT49-766 | |
| 消色差双合透镜，25.4 mm 直径 × 76.2 mm 焦距，MgF₂ 涂层 | Edmund Scientific | NT49-768 | |
| 消色差双合透镜，25.4 mm 直径 × 88.9 mm 焦距，MgF₂ 涂层 | Edmund Scientific | NT49-769 | |
| 50 mm 直径 x 300 mm 焦距氟化镁（MgF2）镀膜消色差双合透镜 | Edmund Scientific | NT45-179 | |
| 8 kHz R 高频光学扫描仪 | Electro-Optical Products Corporation (EOPC) | SC-30 | 8 kHz |
| AGC 驱动器 | Electro-Optical Products Corporation (EOPC) | ACG：8K | |
| H7422-PA 光电传感器模块 | 滨松公司 | H7422-PA | 建议限流 |
| M9012 电源 | 滨松公司 | M9012 | 适用于 H7422-PA 的使用 |
| HC PL APO CS物镜 | Leica Microsystems | 11506284 | 10x/0.40 |
| Solios eA/XA 图像采集卡 | Matrox | Solios eA/XA | 需要 MIL 软件； –M互连建议 |
| 12V 电源供应器 | 明纬 | LPV-100-12 | +12V，8.5A |
| 5x 显微镜物镜 | Newport Corp. | M-5X | 0.10 NA，25.4 mm 焦距 |
| 相干成像光纤 | 住友电木有限公司 | 8-30N | |
| 1/4"-20 内六角螺钉及五金套件 | Thorlabs 公司 | HW-KIT2 | |
| 100 μm 装载针孔 | Thorlabs 公司 | P100S | 适用于构建空间滤波器 |
| 30 mm 笼式立方体夹具 | Thorlabs 公司 | B6C | |
| 30 mm 笼系统立方连接器，四通 | Thorlabs 公司 | C4W | |
| 406 nm，5 mW，B类PIN码，单模光纤尾纤激光二极管，FC/PC接口 | Thorlabs 公司 | LPS-406-FC | 产品已停产，由 LP405-SF10 取代 |
| 5分钟环氧树脂，1盎司 | Thorlabs 公司 | G14250 | |
| 6轴运动学光学支架 | Thorlabs 公司 | K6X | |
| 8-32内六角螺钉及紧固件套装 | Thorlabs 公司 | HW-KIT1 | |
| 8-32 内六角螺钉及配件套装 | Thorlabs 公司 | HW-KIT3 | |
| 带外置RMS螺纹和内置SM1螺纹的转接器 | Thorlabs 公司 | SM1A4 | |
| 调整式FC/PC和FC/APC准直器，焦距 = 2.0 mm，增透膜：400–600 nm | Thorlabs 公司 | CFC-2X-A | f = 2.0 mm |
| 可调光纤准直器适配器，SM1 螺纹 | Thorlabs 公司 | AD9.5F | |
| 铝制光学平台，12" × 18" x 1/2" | Thorlabs 公司 | MB1218 | 1/4"-20 螺纹 |
| 台式激光二极管/热电冷却器控制器 | Thorlabs 公司 | ITC4001 | 1 A/96 W |
| DMLP 425 nm 长波通二向色镜 | Thorlabs 公司 | DMLP425 | |
| 用于1的运动学支架" 光学 | Thorlabs 公司 | KM100 | |
| ThorLabs 光纤耦合激光二极管的 LD/TEC 安装座 | Thorlabs 公司 | LM9LP | |
| 18 mm光学元件镜头安装座 | Thorlabs 公司 | LMR18 | 包含一个卡环 |
| 用于2的镜头支架" 光学 | Thorlabs 公司 | LMR2S | 带有内螺纹和外螺纹；包含固定环 |
| 迷你系列笼具组装杆，6 根" 长，4 mm，数量 1 | Thorlabs公司 | SR6 | |
| 1.0" 带8-32螺纹孔的立柱支柱" 长 | Thorlabs 公司 | RS1P8E | |
| 1" 支柱延长段，长度=0.5 | Thorlabs 公司 | RS05 | |
| 1" 支柱延长段，长度=0.75" | Thorlabs 公司 | RS075 | |
| 1" 受保护银镜，3.2 mm 厚 | Thorlabs 公司 | ME1-P01 | |
| 1" SM1 旋转可调聚焦元件，L = 1" | Thorlabs 公司 | SM1V10 | |
| 2" 保护型银镜，3.2 mm 厚 | Thorlabs 公司 | ME2-P01 | |
| P100S - 100 μm 聚焦针孔 | Thorlabs 公司 | P100S | |
| Polaris 低漂移 1" 运动学镜架 | Thorlabs 公司 | POLARIS-K1 | 低漂移 |
| SM1透镜管，L = 1" | Thorlabs 公司 | SM1L-10 | 包含一个卡环 |
| SM1螺纹30毫米笼板，0.35" 厚 | Thorlabs 公司 | CP02 | |
| SM1至M25光学元件螺纹转接器 | Thorlabs 公司 | SM1A24 | 外螺纹 SM1 和内螺纹 M25.5×0.5 |
| 小光束直径振镜系统 | Thorlabs 公司 | GVSM001 | |
| 小型夹持叉 | Thorlabs 公司 | CF125 | 1/25" 沉头槽，通用型 |
| 空间滤波系统 | Thorlabs 公司 | KT310 | 针孔单独出售 |
| 5.6 的热电冷却安装座 &和 9 mm 激光器 | Thorlabs 公司 | TCLDM9 | |
| 面包板垂直支架 | Thorlabs 公司 | VB01 | 每个 |
| 平场复消色差物镜 | 卡尔·蔡司股份公司 | 1101-957 | 20x/0.75 数值孔径 |
参考文献
- Pawley, J. B. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer Verlag. 985-985 (2006).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).
- Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics. European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).
- Stephens, D. J. Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging. Science. 300, 82-86 (2003).
- McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration. Science. 322, 1546-1550 (2008).
- Wallingford, J. B. Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation. Nature. 405, 81-85 (2000).
- Laemmel, E. Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation. Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).
- Moussata, D. The confocal laser endomicroscopy. Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).
- Dunbar, K., Canto, M. Confocal endomicroscopy. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).
- Udovich, J. A. Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles. Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).
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