视频速率扫描共聚焦显微成像与微型内窥显微技术

摘要

本文描述了一种定制的实时共聚焦扫描成像系统的完整构建方法。该系统可轻松用于视频速率显微镜和显微内窥镜检查，能够实现多种标准商用共聚焦系统无法达到的成像几何结构和应用，且成本仅为后者的一小部分。

摘要

共聚焦显微镜已成为生物学和生物医学科学中不可或缺的工具，能够对复杂系统进行快速、高灵敏度和高分辨率的光学切片。例如，共聚焦显微镜常规用于研究特定的细胞靶标¹，监测活细胞内的动态过程^2-4，以及可视化整个生物体的三维发育过程^5,6。共聚焦成像系统的扩展技术，如共聚焦微内窥镜，可在体内实现高分辨率成像in vivo⁷，目前正被应用于临床环境中的疾病成像与诊断^8,9。

共聚焦显微镜利用简单的几何光学原理，通过生成所谓的“光学切片”来实现三维分辨率。在标准的宽场显微镜中，样品发出的荧光由物镜收集并直接传递至探测器。这种方法适用于薄样品的成像，但对于厚样品，来自物镜焦平面上方和下方的荧光会导致图像模糊。相比之下，共聚焦显微镜能够实现虚拟的光学切片，通过抑制非焦平面的杂散光，构建出样品高分辨率的三维图像。

共聚焦显微镜通过在检测光路中使用共聚焦孔径来实现这一功能。物镜从样品收集的荧光信号经扫描镜反射后，穿过主二向色镜；该二向色镜经过精心选择，可反射较短波长（如激光激发光），同时透射较长波长的斯托克斯位移后的荧光发射光。随后，这一长波长荧光信号被传递至位于针孔两侧的一对透镜，该针孔的位置恰好处于与物镜焦平面共轭的平面上。来自样品焦体积的光子被物镜准直后，再由共聚焦透镜聚焦并通过针孔。而来自焦平面上方或下方产生的荧光则无法被正确准直，因而不能通过共聚焦针孔¹，从而形成光学切片，使得只有来自显微镜焦点处的光可见。（图1）因此，针孔实际上在焦平面上起到一个虚拟孔径的作用，将检测到的发射光限制在唯一一个有限的空间位置。

现代商用共聚焦显微镜为用户提供全自动操作，使以往复杂的成像流程变得相对简单且易于实施。尽管这些系统具有高度灵活性和强大功能，但商用共聚焦显微镜并不适用于所有共聚焦成像任务，例如许多 在体 成像应用。如果无法构建满足其需求的定制化成像系统，许多重要的实验将难以实现。

本文提供了一种从基础部件完整构建定制化视频速率共聚焦成像系统的逐步方法。将采用振镜式共振扫描镜作为快速扫描轴，构建正置显微镜，而慢速扫描轴则使用标准速度的振镜式共振扫描镜。为了在物镜焦点处形成精确的扫描光束，这些扫描镜将通过四片中继透镜被放置在所谓的远心平面位置。共聚焦检测将使用现成的标准光电倍增管（PMT）实现，图像则通过Matrox图像采集卡及其配套软件进行采集与显示。

方案

激光波长、二向色镜和光学滤光片的选择应根据实验中所使用的特定染料来确定。例如，对使用Alexa Fluor 488染色的样品进行共聚焦成像时，最佳配置是采用488 nm激光器、500 nm长通二向色镜和中心波长为515 nm、带宽为30 nm的带通滤光片。相比之下，对红色染料Alexa Fluor 647进行共聚焦成像则需要另一套不同的光学组件。本方案中所使用的显微镜设计用于观察在400 nm处具有强吸收且发射波长大于450 nm的任何染料。因此，我们选用406 nm激发激光器和425 nm长通二向色镜来反射激光束。通过选择合适的发射滤光片，可以选择性地观察被激发的荧光染料。在整个方案中，应在指定位置正确使用适当的光学安装硬件；使用不恰当或临时替代的硬件不仅难以保持光路准直，还可能带来安全隐患。

1. 设置共振式光机扫描镜和中继光学系统

构建任何类型共聚焦扫描系统的一个重要概念是光瞳中心性（telecentricity）。在光瞳中心光学系统中，透镜之间的间距等于其焦距之和，因此系统的放大倍率可简单地由焦距之比确定¹。这使得可以构建一种光学中继系统，其中放大倍率以及系统的其他特性均可通过选择透镜而被明确定义。另一个重要概念涉及所谓的“静止”光学平面，也称为“孔径平面”。孔径平面是指在光路中光束不发生任何横向移动的位置。在此显微镜设计中，存在三个重要的孔径平面：第一和第二扫描镜，以及物镜的后孔径。为了在物镜的焦平面上实现最佳的光束扫描，进入物镜后孔径的光束必须保持位置静止，仅在角度上进行扫描。为了形成这种位置静止、角度扫描的平面，我们需要将第一和第二扫描镜放置在与物镜后孔径共轭且光瞳中心的平面上。位于扫描镜与物镜之间的透镜用于在这些静止平面之间传递角度扫描的光束（图2）。扫描镜安装在两个扫描检流计（galvo）上，每个检流计负责成像平面某一方向（X 和 Y）的扫描。为了实现视频速率成像所需的线扫描速率，需要使用高频谐振检流计来扫描x轴（也称为“快速”轴）。这些检流计采用灵敏的闭环反馈电路，以产生正弦扫描模式，并能够在非常高的频率下运行；本系统选用了8 kHz的检流计。

1. 将光纤准直器安装在光学支架上，并使用调节螺钉粗略调整光束方向，使其在水平和垂直方向上均沿直线传播。然后取一个光阑，将其放置在光纤准直器前方，调节光阑的垂直高度，使光束恰好穿过光阑中心。接着，将光阑沿光路远离准直器移动，观察光束是否仍通过光阑中心。若未对准，则使用两个调节螺钉调整光束在光阑上的位置。
2. 将安装好的二向色镜置于光路中，使激光束大致位于镜面中心位置。在将镜片夹紧固定于光学平台之前，旋转镜架，使光束反射角度约为90度，并粗略调节反射方向，确保反射后的激光束垂直高度保持不变。
3. 将安装好的谐振式检流计扫描镜放入激光光路中，注意确保激光束精确地位于镜面的水平中心。在本方案中，谐振式检流计镜已直接用环氧树脂粘接至镜片支架上。旋转镜片支架，使激光束以90度角反射。粗略调节镜面反射，以保持激光束的垂直高度不变。
4. 根据定义，要将任意光线引导至特定方向，必须在空间中确定两个点，使光线穿过这两个点。通常通过在期望的水平和垂直路径上放置两个光阑，并调节激光束使其穿过每个光阑的中心来实现。调节光束需要四个自由度：每个光阑分别具有水平和垂直两个自由度。实现这些自由度最常见且直接的方法是使用两面镜子来引导或“步进”激光束。
   取两个光阑，参照从谐振式检流计镜反射出的激光束，按照步骤1.1的方法设定其垂直高度。然后，以光学面包板上的螺孔作为视觉参考，将两个光阑沿直线夹紧固定。
5. 调节二向色镜和谐振式检流计镜，使激光束穿过两个光阑的中心。使用光路中的第一面镜子（即二向色镜）将光束对准第一个光阑的中心，再使用第二面镜子（即谐振式检流计镜）将光束对准第二个光阑的中心。反复迭代调节这两面镜子，直至光束同时穿过两个光阑，并在整个过程中确保从谐振式检流计镜反射的激光束仍大致从镜面中心反射。若光束发生偏移，需调节光纤准直器支架，并重复上述迭代步骤。
6. 当光束已对准两个光阑中心后，接下来放置两个中继透镜，用于将第一个固定的物方远心平面（i.e.，谐振式检流计镜）成像至第二个固定的物方远心平面（i.e.，标准速度检流计镜）。对于该特定显微镜，第一组中继透镜选用相同焦距“f”的透镜，因此在物方远心系统中两面镜子之间的距离为4f。为确保透镜在光路中精确居中，采用透镜对准技巧：将第一片透镜置于光路中，观察紧随其后的光阑上的激光光斑位置；然后垂直调节透镜高度，使光束的垂直中心与光阑中心对齐；最后调节水平方向上的光束位置，使光束在光阑上居中。对第二片透镜执行相同的操作流程。

2. 设置第二扫描镜并旋转显微镜

1. 为了确定第二个远心平面的精确位置，将谐振振镜连接至其扫描单元并开启。使用一张白色名片追踪光束通过两个透镜的路径。您将在距离谐振振镜约4f的位置找到远心平面，在该位置激光束看起来完全静止。在光学平台上标记此位置。
2. 将标准扫描振镜精确放置在该远心平面位置，并调节振镜的高度和位置，使远心平面上的光束准确照射到扫描振镜的中心。在此过程中，必须为振镜控制硬件供电，并在扫描振镜输入端施加0伏电压，以确保振镜处于其中心中性位置。仔细调节振镜角度，使光束垂直向上反射，然后轻轻固定振镜位置。
3. 由于我们正在构建一台直立式显微镜，接下来需使用90度安装支架将第二块光学平台以90度角固定。在此操作过程中，请务必关闭激光器和扫描电子设备，断开光纤连接，并断开扫描振镜。为便于后续对准操作，在将支架用螺栓固定后，小心旋转整个显微镜系统，使新的光学平台平放于工作台面。使用夹具将光学平台固定在工作表面上。此后，原先垂直方向的其余组件可方便地在水平放置的光学平台上完成安装与调整。

3. 设置扫描、管状和物镜镜头

接下来，我们将设置第二组中继透镜，通常称为“扫描透镜”和“管镜”。选择合适的透镜组合至关重要，以在物镜焦平面处实现正确的放大倍数，并优化最终图像的分辨率。首先，为了达到任意给定物镜的最大数值孔径（NA），照射到物镜后端的激光束必须完全充满其后孔径；只有这样，物镜才能形成最紧密的聚焦光斑。不同物镜的后孔径尺寸各不相同；应选择适当的透镜放大倍率，使后孔径被略微过充满。其次，为了实现正确的放大倍数，物镜必须与其设计所匹配的管镜焦距相配合。遗憾的是，不同的显微镜物镜制造商采用了不同的管镜焦距，因此在构建显微镜时，必须为所使用的特定物镜配备正确的管镜。此外，某些制造商（如Zeiss）设计其管镜时会补偿与其匹配物镜的特定色差，因此若使用不匹配的物镜-管镜组合，反而会引入原本不存在的新像差。我们通常更倾向于使用Olympus物镜，因为其所有色差校正均在物镜内部完成，从而简化了物镜与管镜的配对过程。尽管当物镜与管镜不匹配时显微镜仍可工作，但实际的显微镜放大倍数很可能与物镜上标注的放大倍数不符。对于本例中的显微镜构建，确定最佳后孔径尺寸为4 mm，因此扫描透镜与管镜之间需要1:4的放大倍率。在此定制显微镜构建中，我们将采用75 mm焦距的扫描透镜和300 mm焦距的管镜。

1. 由于第二扫描镜与物镜焦点之间的总距离较大，因此在显微镜搭建的这一阶段，需先布置用于将光束引导至物镜的反射镜。将第一块较大的直径为2英寸（50 mm）的反射镜放置在光学平台边缘附近，并旋转镜架，使激光束偏转约90度。粗略调节镜面反射，以保持光束高度在垂直方向上不变。将另一块2英寸反射镜置于光学平台的对侧边缘，使其朝向可将光束向下反射90度。使用调节螺丝确保光束的垂直高度不发生变化。按照步骤1.4的方法设置两个光阑，并依照步骤1.5的指导调节这两个反射镜，使光束在两个光阑中心对准。
2. 保持光阑位置不变，将扫描透镜置于光路中，并调节其水平和垂直位置，使激光光斑在第一个光阑上居中。在距离该透镜75 mm + 300 mm的位置（位于两块反射镜之间），小心放置大尺寸的2英寸管镜，并调节其水平和垂直位置，使光束在第一个光阑上居中。为便于今后维持光路对准，建议保留这些光阑；在本应用中，可将带有合适孔径的名片粘贴在支架上，并插入光路中作为替代。
3. 在所有反射镜和透镜均已就位后，开始驱动谐振振镜和标准扫描振镜。在本系统搭建中，标准扫描振镜最终将通过定制的控制电路（如图3所述）与谐振振镜的扫描速率同步，从而实现更优的垂直与水平方向同步。然而，在对准过程中以及许多成像应用中，也可直接使用函数发生器输出的锯齿波信号驱动振镜进行扫描。使用一张名片，在管镜后方300 mm处定位激光光束。尽管光束在显微镜其他部分同时在垂直和水平方向上扫描，但在该位置附近光束应完全静止。此处即为物镜后孔径的放置位置。如果水平和垂直方向的静止平面在光路中未能重合于同一平面，则需小心松开管镜夹具，并沿光轴方向平移管镜，以尽可能使两个静止平面重叠。重新调节管镜的垂直和水平位置，并牢固夹紧固定。
4. 将物镜置于光路中，确保物镜的后孔径尽可能靠近上述静止平面。由于不同制造商的设计差异，物镜的实际后孔径位置可能并不总是位于物镜物理后端开口处。因此，最好始终向制造商核实以确定真实后孔径的位置。
5. 安装样品台，并确保用于实现z轴移动的平移装置可在其全行程范围内运动，且不会与物镜镜座发生碰撞。

4. 设置并校准共聚焦针孔与检测器

1. 断开所有电源和光纤，旋转显微镜组件，使其再次放置在承载共振扫描镜的光学平台（面包板）上。将光学平台牢固夹紧，然后重新连接光纤与准直器，并重新连接两个检流计及其控制电缆。与之前相同，将0伏电压施加到驱动标准扫描检流计的控制电压端。
2. 在样品载物台上放置一张名片或少量高亮度染料，置于物镜焦点处，并夹在两块盖玻片之间。染料的选择取决于所用激光器和二向色镜；在此我们使用白色名片的荧光发射来校准共聚焦检测系统。量子点也可用于校准，因其亮度高且不易发生光漂白。其他可选方案包括荧光微球和/或经衣物增白剂处理的织物样品，二者均具有强烈荧光。打开激光光源，使用平移载物台将样品移入显微镜焦点。一旦聚焦，样品产生的荧光应可在二向色镜后方观察到，如下一步所述。将激光功率调至最大，以使荧光尽可能明亮。
3. 使用名片，追踪样品通过物镜和扫描系统返回至二向色镜的荧光发射路径。二向色镜将透射荧光发射，同时反射激光束；在二向色镜的另一侧找到该荧光信号。现在，在二向色镜后方放置一面镜子，并用它将发射光以90度角反射。取一个光阑（如步骤1.1中所做），配合镜子使用，尽可能使荧光光束沿直线且平行于光学平台传播。此步骤最好在较暗光线下进行。
4. 按照图2所示设置共聚焦针孔单元。我们发现ThorLabs公司的空间滤波器笼式安装组件非常适合此任务。选择合适的针孔尺寸至关重要，以确保共聚焦系统达到最佳分辨率，同时不过度损失信号。对于本定制显微镜，选用100 μm的针孔尺寸。将空间滤波器单元沿荧光光路对准安装，注意将第一个聚焦透镜安装座对准荧光发射光束中心。在单元内安装短焦距透镜（也可使用显微物镜）后，滑动z轴平移安装座，直至在针孔表面观察到清晰的焦点。确保整个单元沿荧光光束设定的精确直线方向对齐。将该单元夹紧固定在光学平台上。
   即使在黑暗环境中，大多数样品的发射光强仍远低于环境光水平。因此，必须在发射光路中使用充分的遮光/挡光装置，以防杂散光污染。此外，高环境光水平可能使许多光电倍增管（PMT）过载甚至损坏，尤其是无电流保护功能的型号。因此强烈建议读者使用透镜管封闭发射光路；一个屏蔽良好的系统（如本例所示）可在普通室内光照下运行，几乎不受杂散光干扰。
5. 现在，使用平移台上的调节旋钮，系统性地移动共聚焦针孔，寻找使通过针孔的荧光信号最大的位置。该位置可通过在针孔安装面进行二维搜索，迭代调节两个轴向来最易确定。一旦找到信号最大位置，在针孔后方的笼式安装座上放置准直透镜。使用名片找到通过共聚焦单元的荧光发射，沿支架滑动准直透镜，直至发射的荧光信号尽可能准直。光束准直后，务必在透镜管中的光路中插入适当的滤光片。
6. 设置光电倍增管（PMT）组件。在荧光发射光路中放置一个焦距为50 mm的透镜，并使用名片找到其焦点位置。在光学平台上标记该位置。现在，完全关闭激光器——这一点非常重要，因为杂散光或未衰减的激光可能永久损坏大多数PMT。将PMT定位，使其感光区域尽可能接近所标记的焦点位置。使用可调透镜管将PMT组件与聚焦透镜连接，并仔细用黑色胶带包裹针孔后所有暴露的光路部分。
7. 打开激光器，但务必保持其功率极低，使荧光发射 barely visible（勉强可见）。开启PMT，随着控制电压升高，仔细在示波器上读取其输出电压。PMT通过一系列电子倍增级产生信号；若光电流相对于入射光强过高，管体可能遭受不可逆损坏。因此强烈推荐使用带电流限制电路的PMT，特别是对未使用过此类探测器的用户。
   逐步提高PMT控制电压，直至在示波器屏幕上观察到尖峰状信号和/或直流偏移；对于大多数PMT，该信号相对于地为负值。通过关闭激光器观察信号是否消失，确认该信号确实来源于荧光。
8. 最后，通过先调节聚焦透镜的z轴位置，再调整yz平移台，迭代优化针孔位置，使示波器上的信号达到最大。
9. 视频速率显微镜的硬件部分已完成！现在按照图3所示连接扫描镜、自定义控制电路板和计算机。与上述类似，建议先使用成像系统观察一个已知尺寸的标准样品，以确定显微镜的最佳分辨率，并计算成像系统的像素-分辨率常数。可选用多种尺寸标准，例如具有已知字母大小的白色名片、荧光或反射式空军靶标，以及荧光微球。

5. 准备共聚焦扫描微内窥镜系统

在此构建中，我们使用一种相干图像光纤，它由数千根光纤纤芯组成；这种结构能够将图像通过光纤传输，并可在另一端轻松重建和/或放大（图4）。用于制造该内窥镜的相干光纤束两端均经过抛光处理，因此属于所谓的“接触式”微型内窥镜。只有当微型内窥镜探头与物体紧密接触时，才能形成聚焦清晰的图像。在这种伪共聚焦结构中，显微镜的扫描动作将激光逐次聚焦到单根光纤纤芯上，同时共聚焦针孔可确保来自周围纤芯的离焦光线无法通过到达探测器。针对不同的成像应用，可在远端探头处添加一组透镜，以实现前向、长距离的荧光成像。微光学透镜以及梯度折射率（GRIN）透镜均可方便地适配用于此目的，并可通过光学级胶水固定在光纤远端端面。

1. 为搭建显微内窥镜成像系统，小心移除样品台，并更换为光纤固定台（图5）。将光纤束的一端浸入稀释的染料溶液中，使所有光纤纤芯均产生均匀的荧光发射。开启扫描系统，并调节光纤固定装置，使光纤束的另一端（近端，即靠近显微镜光学系统的那一端）处于焦平面上。首先，使用平移调节螺钉将光纤在扫描视野中居中。然后，在扫描过程中观察近端光纤尖端的荧光发射图像。当整个微内窥镜表面处于物镜的焦平面时，各光纤纤芯的荧光发射将尽可能均匀。使用角度调节旋钮调整光纤端面，使所有纤芯亮度一致。在此调节过程中，可能需要重新调整平移位置，以再次将光纤居中于扫描视野中。反复进行上述调节，直至整个光纤尖端准确聚焦。
2. 使用微内窥镜前，用经HPLC级甲醇轻微润湿的镜头清洁纸轻轻擦拭远端尖部。与之前相同，使用已知尺寸的标准样品测量并计算微内窥镜成像系统的分辨率。

6. 代表性结果：

图6展示了一个用于显微内窥镜的直立式共聚焦扫描显微镜的完成示例。图中激光束和发射光束以示意图形式标出，便于观察。在显微内窥镜操作过程中，光纤支架用于固定成像光纤。该光纤支架可方便地替换为xy或xyz平移台，从而用作直立显微镜平台。ThorLabs公司的PT3部件（xyz平移）或两个堆叠的PT1部件（xy平移）均适用于此用途，配合使用如ThorLabs AP90型号的直角支架效果更佳。

使用视频速率帧抓取卡从输入信号生成图像。图7显示了采用视频速率显微镜扫描系统拍摄的、印在白色名片纸上小写字母“m”的代表性测试图像。漂白的白纸含有可被紫外光和蓝光激发的荧光团，从而在暗色字母“m”后方形成明亮的背景。选择中心波长为515 nm的发射滤光片来收集该荧光发射信号。图像中可观察到轻微的畸变，尤其在图像帧的侧边缘区域较为明显。这种畸变源于8 kHz振镜的正弦扫描模式，下文将对此进行详细讨论。

图1. 展示共聚焦显微镜工作原理的示意图。从物镜焦点发出的光线经系统反射后，通过共聚焦针孔（红色）聚焦。从物镜焦点上方（蓝色）或下方（绿色）发出的光线无法以平行光束形式从物镜射出，因此不能有效通过共聚焦针孔。

图 2. 显示光束扫描系统中所有光路的示意图。扫描镜位于与固定的物镜后焦平面共轭的远心平面。固定平面之间的成对透镜用于传递扫描后的光束。前两片中继透镜具有相等的焦距，构成一个1:1的望远系统。第二对透镜，正式称为扫描透镜和管镜，其焦距不必相等，通常作为光束扩束望远系统，以确保物镜后光阑被充分填充。从样品发出的光沿原路返回，穿过扫描系统，并通过二向色镜。一个短焦透镜将发射光聚焦通过共聚焦针孔，随后由另一透镜准直。最后一个透镜将经过共聚焦滤波的发射光聚焦到光电倍增管上。 点击此处查看该图像的完整尺寸版本。

图3. （a）扫描电子系统设置的示意图。显微镜的整体参考信号和时基来自快速轴谐振检流计镜的“同步”TTL输出，该输出在每行扫描结束时产生一个TTL脉冲（即，当检流计完成一次扫描周期时）。该信号作为H同步信号输入至图像采集卡。检流计的同步输出同时也连接至V同步控制板，该控制板在接收到每个H同步脉冲后逐步增加其输出电压，从而生成驱动慢速扫描轴的锯齿波形。当所有扫描行完成之后，V同步板将重置锯齿波形，并产生一个TTL脉冲，作为图像采集卡的V同步信号。图像采集卡的最后一个输入信号来自光电倍增管（注意：许多光电倍增管产生负电压输出；请务必据此设计电路并选择相应硬件）。视频速率的图像由Matrox图像采集软件生成并显示。（b）示例控制电路。在此设计中，每个H同步脉冲的电压通过运算放大器积分器进行“累加”或积分，以生成锯齿波的上升沿；同时，在TTL计数器阶段对脉冲进行同步计数。当达到预设的扫描行数时（即，光栅扫描完成），计数器产生一个低电平有效的“进位输出”脉冲，触发施密特触发器生成一个用于重置积分器的脉冲。该脉冲同时重置计数器和运算放大器积分器，使电路准备进入下一个周期。通过合理选择元件参数，该电路可广泛适用于多种光栅尺寸。此仅为一种实现方式，其他多种实现方式亦可能存在，并在特定条件下更优。此外，该电路专为Matrox图像采集卡设计，此类采集卡可自动检测并校正图像相位。若将该电路用于其他图像采集卡，则可能需要额外的相位校正电路或软件支持。 点击此处查看该图像的完整尺寸版本。

图 4. 通过相干光纤束的图像传输。在此示意图中，光纤束两侧的透镜按比例缩放，既用于调节投射到光纤束输入端的图像，也用于放大光纤束输出端的图像。

图5. 安装在五轴支架上的光纤束示例。使用一个直径为1英寸的小型铝块，将其钻孔以便插入成像光纤束。为确保稳定性，光纤在铝块的顶部和底部均用环氧树脂固定。

图6. 完成的显微系统图像，其中已连接微型内窥镜。为更清晰地显示光路，激发光光路以蓝色标示，而经过二向色镜后的发射光光路则以红色线条表示。

图7. 视频速率共聚焦扫描显微系统生成的示例图像。在白色名片明亮的荧光背景上，出现一个深色的小写字母“m”。

讨论

该视频速率成像系统采用一个工作频率约为8 kHz的谐振检流计镜。谐振镜在满功率运行时可能产生较大噪音，其高音调在足够长时间暴露下可能令人不适甚至有害。尽管此处未作演示，但仍建议将谐振检流计镜置于透明外壳内，以显著降低系统噪声，和/或佩戴适当的听力保护装置（如耳塞）。

共振振镜以正弦波模式进行扫描。然而，图像采集卡在读取信号时，假设水平和垂直方向的扫描速度完全呈线性。由于正弦扫描在扫描范围边缘处速度变慢，因此在快速（水平）图像轴上可能出现图像压缩伪影。减小该问题的一种方法是，有意将共振振镜的扫描范围驱动得显著大于中继透镜的直径。通过这种方式，仅有正弦扫描模式中接近线性的中央扫描区域通过样品，从而最小化图像畸变。另一种方法是对采集的图像进行后处理，以实现快速轴的线性化。这可以通过对一个已知的荧光图案（例如网格）成像，并利用该已知图案的尺寸信息编写图像处理脚本，对采集的图像进行去扭曲来实现。

该特定扫描系统专为体内成像而设计，此类成像通常需要直立取向的视频速率显微镜。对于细胞成像实验，更常使用倒置显微镜。此处介绍的设计可轻松改造为构建此类倒置显微镜，仅需旋转最终直径为2英寸的反射镜即可。无需将反射镜定向以使扫描光束向下传播，而是可将其调整为向上反射光束。将物镜与样品台置于距反射镜相同距离的位置，即可实现倒置光路结构下的成像。若成像系统仅用于微型内窥镜成像，则完全无需在垂直方向上折叠显微镜设计。相反，整个扫描系统可构建于同一水平光学平台之上，物镜方向与光学台面平行。

请注意，本构建中使用的显微镜采用固定的针孔配置；虽然这种设计可最大程度地简化构建过程并便于对准，但对于希望获得更高灵活性的用户，可考虑采用可变针孔，如同大多数商用共聚焦显微镜中所配备的那样。通过允许用户调节针孔大小以适应不同发射光强度的样品，可更有效地优化特定样品在信号强度与分辨率之间的权衡。

为显微镜选择的光纤成像束至关重要。我们推荐使用住友（Sumitomo）相干光纤，因其光纤芯间距紧密且相对自体荧光较低。已发现藤仓（Fujikura）制造的光纤具有较强的自体荧光¹⁰，可能掩盖样品微弱的荧光信号，从而限制微型内窥镜的最终灵敏度。住友公司生产的光纤（例如本实验装置中使用的8-30N型号）其自体荧光水平明显低于藤仓同类产品。尽管拉丝式光纤束在微型内窥镜应用中可能具有吸引力，但其设计通常使单根光纤芯之间的间距过大，导致对物体的采样稀疏，遗漏大量潜在感兴趣的区域。

最后需要指出的是，尽管本文所述显微镜在多种体外（in vitro）和体内（in vivo）应用中均具有实用价值，且其成本仅为功能齐全的商业系统的很小一部分，但它不具备透射光检测、目镜观察或非共聚焦宽场落射荧光的光路等功能。虽然理论上可以从零开始构建包含这些功能的系统，但希望获得此类系统的读者可能更倾向于改造现有的商业系统以满足其需求，而非从头开始全新搭建。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
515 nm 带通滤光片	Chroma Technology Corp.	HQ515/50M	46 FWHM
消色差双合透镜，25.4 mm 直径 × 50 mm 焦距，MgF₂ 涂层	Edmund Scientific	NT49-766
消色差双合透镜，25.4 mm 直径 × 76.2 mm 焦距，MgF₂ 涂层	Edmund Scientific	NT49-768
消色差双合透镜，25.4 mm 直径 × 88.9 mm 焦距，MgF₂ 涂层	Edmund Scientific	NT49-769
50 mm 直径 x 300 mm 焦距氟化镁（MgF2）镀膜消色差双合透镜	Edmund Scientific	NT45-179
8 kHz R 高频光学扫描仪	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	SC-30	8 kHz
AGC 驱动器	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	ACG：8K
H7422-PA 光电传感器模块	滨松公司	H7422-PA	建议限流
M9012 电源	滨松公司	M9012	适用于 H7422-PA 的使用
HC PL APO CS物镜	Leica Microsystems	11506284	10x/0.40
Solios eA/XA 图像采集卡	Matrox	Solios eA/XA	需要 MIL 软件； –M互连建议
12V 电源供应器	明纬	LPV-100-12	+12V，8.5A
5x 显微镜物镜	Newport Corp.	M-5X	0.10 NA，25.4 mm 焦距
相干成像光纤	住友电木有限公司	8-30N
1/4"-20 内六角螺钉及五金套件	Thorlabs 公司	HW-KIT2
100 μm 装载针孔	Thorlabs 公司	P100S	适用于构建空间滤波器
30 mm 笼式立方体夹具	Thorlabs 公司	B6C
30 mm 笼系统立方连接器，四通	Thorlabs 公司	C4W
406 nm，5 mW，B类PIN码，单模光纤尾纤激光二极管，FC/PC接口	Thorlabs 公司	LPS-406-FC	产品已停产，由 LP405-SF10 取代
5分钟环氧树脂，1盎司	Thorlabs 公司	G14250
6轴运动学光学支架	Thorlabs 公司	K6X
8-32内六角螺钉及紧固件套装	Thorlabs 公司	HW-KIT1
8-32 内六角螺钉及配件套装	Thorlabs 公司	HW-KIT3
带外置RMS螺纹和内置SM1螺纹的转接器	Thorlabs 公司	SM1A4
调整式FC/PC和FC/APC准直器，焦距 = 2.0 mm，增透膜：400–600 nm	Thorlabs 公司	CFC-2X-A	f = 2.0 mm
可调光纤准直器适配器，SM1 螺纹	Thorlabs 公司	AD9.5F
铝制光学平台，12" × 18" x 1/2"	Thorlabs 公司	MB1218	1/4"-20 螺纹
台式激光二极管/热电冷却器控制器	Thorlabs 公司	ITC4001	1 A/96 W
DMLP 425 nm 长波通二向色镜	Thorlabs 公司	DMLP425
用于1的运动学支架" 光学	Thorlabs 公司	KM100
ThorLabs 光纤耦合激光二极管的 LD/TEC 安装座	Thorlabs 公司	LM9LP
18 mm光学元件镜头安装座	Thorlabs 公司	LMR18	包含一个卡环
用于2的镜头支架" 光学	Thorlabs 公司	LMR2S	带有内螺纹和外螺纹；包含固定环
迷你系列笼具组装杆，6 根" 长，4 mm，数量 1	Thorlabs公司	SR6
1.0" 带8-32螺纹孔的立柱支柱" 长	Thorlabs 公司	RS1P8E
1" 支柱延长段，长度=0.5	Thorlabs 公司	RS05
1" 支柱延长段，长度=0.75"	Thorlabs 公司	RS075
1" 受保护银镜，3.2 mm 厚	Thorlabs 公司	ME1-P01
1" SM1 旋转可调聚焦元件，L = 1"	Thorlabs 公司	SM1V10
2" 保护型银镜，3.2 mm 厚	Thorlabs 公司	ME2-P01
P100S - 100 μm 聚焦针孔	Thorlabs 公司	P100S
Polaris 低漂移 1" 运动学镜架	Thorlabs 公司	POLARIS-K1	低漂移
SM1透镜管，L = 1"	Thorlabs 公司	SM1L-10	包含一个卡环
SM1螺纹30毫米笼板，0.35" 厚	Thorlabs 公司	CP02
SM1至M25光学元件螺纹转接器	Thorlabs 公司	SM1A24	外螺纹 SM1 和内螺纹 M25.5×0.5
小光束直径振镜系统	Thorlabs 公司	GVSM001
小型夹持叉	Thorlabs 公司	CF125	1/25" 沉头槽，通用型
空间滤波系统	Thorlabs 公司	KT310	针孔单独出售
5.6 的热电冷却安装座 &和 9 mm 激光器	Thorlabs 公司	TCLDM9
面包板垂直支架	Thorlabs 公司	VB01	每个
平场复消色差物镜	卡尔·蔡司股份公司	1101-957	20x/0.75 数值孔径