DT40 是一种模式脊椎动物遗传系统，为分析蛋白质功能提供了强有力的工具。本文介绍一种简单的方法，可在单分子水平上对 DT40 细胞 S 期期间影响 DNA 合成的参数进行定性分析。
本文内容
摘要
摘要
维持复制叉的稳定性对于分裂细胞至关重要，以保证细胞存活并防止疾病发生。相关过程不仅能够在内源性和外源性DNA损伤存在的情况下确保基因组的准确复制，还能防止基因组不稳定——这是公认的肿瘤发生的重要致病因素。
在此，我们介绍一种基于荧光显微镜的简单且经济高效的方法，用于在禽类B细胞系DT40中可视化DNA复制过程。该细胞系为研究蛋白质功能提供了强有力的工具 在体 通过反向遗传学在脊椎动物细胞中1在缺失特定基因的DT40细胞中进行DNA纤维荧光标记，可揭示该基因产物在DNA复制和基因组稳定性中的功能。传统方法通过检测脉冲标记细胞群体中DNA合成的总体速率来分析脊椎动物细胞中复制叉动态，属于定量分析，无法对影响DNA合成的参数进行定性评估。相比之下，DNA纤维技术可直接追踪活性复制叉的移动速率。2-4在此方法中，新生DNA被标记 体内 通过掺入卤化核苷酸实现（图1A）。随后，将单个DNA纤维拉伸至显微镜载玻片上，利用特异性抗体对标记的DNA复制轨迹进行染色，并通过荧光显微镜观察（图1B）。通过连续使用两种不同修饰的类似物，可确定复制起始位点及复制叉的方向性。此外，双标记方法可对S期DNA合成过程中影响合成效率的多种参数进行定量分析，例如正在进行或停滞的复制叉、复制起始点密度以及复制叉终止事件等。最后，该实验流程可在一天内完成，仅需常规实验室设备和荧光显微镜。
方案
本文所述方法已用于以下出版物：Schwab 等，EMBO J.，29(4):806-185。
1. DT40 细胞培养
材料：胎牛血清（FBS）、鸡血清、青霉素/链霉素、2-巯基乙醇、RPMI
- 准备细胞培养基：在 RPMI 培养基中加入 7% 胎牛血清（FBS）、3% 鸡血清、1× 青霉素/链霉素和 10 μM 2-巯基乙醇。
- DT40 细胞在 38 °C、5% CO2 的湿润化培养箱中的无菌细胞培养瓶中培养。每天将细胞传代至密度为 5 × 105 个细胞/mL6。
2. 在体 标记
材料：IdU, CldU
- 制备核苷酸类似物的储备液：将IdU溶解于培养基中至5 mM，CldU溶解于培养基中至2.5 mM。将两种溶液短暂加热至60 °C，并涡旋振荡直至核苷酸类似物完全溶解。
- 将IdU加入对数生长的DT40细胞中，使其终浓度为25 μM，并充分混匀细胞悬液。于38 °C、5% CO2条件下孵育细胞20分钟。
- 完成第一种标记物孵育后，加入CldU至终浓度250 μM，并按照上一步所述方法处理细胞。
- 用预冷的PBS洗涤细胞，并将细胞重悬于冷PBS中，浓度为7.5 x 105 个细胞/ml。将标记后的细胞置于冰上保存。
所述标记步骤仅为建议，可根据具体研究问题进行修改。有关实验设计的更多信息，请参见讨论部分。
3. 细胞裂解与DNA铺展
材料： 玻璃载片、纤维裂解液
- 制备纤维裂解液：在 200 mM Tris-HCl（pH 7.5）中加入 50 mM EDTA 和 0.5% SDS
- 取 2 μl 细胞悬液点样至载玻片一端。室温晾干 5 分钟，或直至液滴体积显著缩小但未完全干燥。
- 在细胞悬液上加入 7 μl 裂解液，用移液器吸头轻轻搅拌以混匀溶液。孵育 2 分钟，使细胞裂解进行。
- 将载玻片倾斜至 15°，使纤维沿玻片表面伸展。
- 当裂解液流至玻片底端时，将其平放并空气干燥。干燥后，玻片上应可见一条细而半透明的线条。此时需用铅笔标记纤维延伸的起始位置，因为染色后该线条将不再可见。此标记有助于后续在显微镜下定位纤维。
4. 免疫荧光染色
材料：甲醇、乙酸、盐酸、PBS 中的 5% BSA、染色缸、抗 BrdU（小鼠）抗体、抗 BrdU（大鼠）抗体、Cy3 标记的羊抗小鼠抗体、Alexa Fluor 488 标记的 goat anti-rat 抗体、Vectashield 封片介质、盖玻片、指甲油
- 将载玻片浸入染色缸中的甲醇/乙酸（3:1）溶液中，孵育10分钟。
- 用蒸馏水清洗载玻片2然后在 2.5 M HCl 中浸泡 80 分钟。
- 用 PBS 清洗载玻片三次，每次 5 分钟。
- 从染色缸中取出载玻片，用纸巾吸去多余的 PBS。将载玻片水平放置，用移液器将 5% BSA 滴加到每张载玻片表面。轻轻覆盖盖玻片，使 BSA 均匀分布于载玻片上，室温孵育 20 分钟。
- 用5% BSA稀释一抗，浓度如下：1:25 anti-BrdU（小鼠）和1:400 anti-BrdU（大鼠）。
- 轻轻将盖玻片沿载玻片表面移下以取下。若盖玻片粘附在载玻片上，切勿用力强行取下。可将载玻片置于PBS中重新水化，直至盖玻片松动并可轻松移除。用纸巾吸去多余的BSA，将载玻片水平放置。用移液器 50 μl 将一抗溶液加到每张载玻片上，再次加盖盖玻片以使抗体溶液均匀覆盖载玻片，于湿盒中孵育2小时。
- 移除盖玻片后，用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 5 分钟
- 用5% BSA稀释二抗，浓度如下：1:500 羊抗小鼠Cy3和1:400 山羊抗大鼠Alexa Fluor 488。
- 应用 50 μl 按照一抗的方法加入二抗溶液。避光孵育1小时。
- 移除盖玻片后，用 PBS 清洗载玻片三次，每次 5 分钟。
- 在每张载玻片上滴加一滴 Vectashield 封片剂，盖上盖玻片。轻轻按压盖玻片，并用纸巾吸去周围多余的液体。用透明指甲油封固盖玻片，待其干燥。将载玻片置于 -20 °C.
5. 图像采集
材料：荧光显微镜、相机
在靠近铅笔标记的载玻片上滴加一滴浸油，开始寻找纤维。通常会存在一个主要的纤维束，但这些纤维过于缠绕，无法在后续进行分析。需远离主纤维束，寻找纤维彼此明显分离的区域（图2）。我们将仅选择使用单一颜色通道的图像，以避免偏差。然后，对每个时间点、浓度或细胞系大约拍摄10张图像。然而，拍摄图像的数量取决于每张图像中可计数的纤维数量。应在载玻片上移动位置拍摄不同图像，因为载玻片的某一区域可能无法提供具有代表性的纤维长度或复制结构。
6. 数据分析
材料： 图像分析程序，例如 ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/)
将图片导入图像分析程序。测量纤维束的长度和/或计数不同的复制结构（图3）。仅计数清晰可见且未延伸至图片边缘的纤维。我们通常测量约100根纤维的长度，并计数150-200个复制结构，且每个实验至少重复三次。
7. 代表性结果：
新复制的DNA可显示为抗体标记的核苷酸类似物形成的条带。在我们的实验中，正在延伸的复制叉表现为相邻的红色和绿色信号（图3）。双重标记方法还可用于定义四种主要的复制结构类型：1）新起始事件可分为两类：一类是在细胞与第一种标记物孵育期间激活的复制起始位点，另一类是在与第二种标记物孵育期间激活的复制起始位点。前者表现为相邻的绿色-红色-绿色信号，后者仅表现为一条绿色条带。2）终止事件表现为相连的红色-绿色-红色信号。3）密集分布的起始位点是指基因组中多个复制起始位点紧密排列的区域，这类区域由连续的起始信号和终止信号组成。4）根据实验设计的不同，停滞或崩溃的复制叉可表现为仅有红色信号7，或一条红色条带后跟随一段较短的绿色条带8,9。
根据此处所述条件，野生型 DT40 细胞的平均复制叉速度为 0.4 μm/min。我们可检测到约 63% 的正在进行的复制叉、10% 的复制起始点、16% 的停滞复制叉（仅红色区段）、8% 的复制终止点以及 3% 的交错纤维。
图1. （A）图示左侧展示了DNA标记实验的第一步：将IdU加入指数生长的DT40细胞后，该核苷类似物会迅速掺入新合成的前导链和后随链DNA中。通过特异性抗体可对该过程进行检测，在显微镜下呈现为红色条带。随后，如图右侧所示，重复上述步骤使用CldU进行标记。在与第二种核苷类似物共孵育后，活跃的复制叉在显微镜下表现为相邻的红色-绿色条带。平均纤维长度与核苷类似物的孵育时间成正比。（B）裂解DT40细胞后释放的DNA通过重力作用在显微镜载玻片上拉伸，利用特异性抗体结合及荧光显微镜观察，可对已掺入的核苷类似物进行可视化检测。
图 2. 一张代表性荧光图像显示了来自野生型 DT40 细胞的纤维，随后分别用 IdU 和 CldU 各标记 20 分钟。大多数纤维彼此分离良好，因此可轻松进行分析。白色标尺代表 10 μm。
图3. 双标记纤维技术可用于区分不同的复制结构：1 - 活跃复制的复制叉，2 - 新的DNA复制位点（新复制起始点的激活），3 - 复制叉终止（两个相向而行的复制叉相遇），4 - 交错分布的纤维（起始点间距较近的区域）以及5 - 停滞的复制叉（仅显示红色信号）。
讨论
我们描述了一种可在单分子水平上对S期DNA合成过程中影响参数进行定量分析的方法。在过去十年中，已开发出多种版本的DNA纤维荧光显影技术，用于可视化活细胞内单个复制叉的移动。所有这些技术的关键参数在于如何实现DNA在玻璃表面的最佳伸展，从而获得彼此分离良好的DNA纤维。实现这一目标的关键步骤是细胞悬液在显微镜载玻片上的孵育时间以及裂解时间。这些参数依赖于特定实验室的温度和气流条件，需通过实验经验确定。DNA纤维实验的操作部分通常可在一天内完成，但后续的图像采集与分析较为耗时，且需要实践经验。
该标记方案可针对不同的科学问题进行调整：在第二次脉冲标记期间使用干扰复制的试剂，可监测复制叉在复制应激条件下的延伸/停滞情况。在此情况下，由于第二次核苷酸是过量加入的，因此无需洗去第一次标记物。或者，也可在加入第一种标记物的同时或之后立即使用阻碍复制的药物。但此方法要求在添加第二种核苷酸类似物之前，先去除第一种标记物和药物。该流程可用于确定各种DNA修复因子在复制应激条件下（即复制叉停滞和/或崩塌）对复制叉稳定性/恢复的重要性。值得注意的是，通过结合DNA梳状技术与荧光原位杂交的替代方法，可对DNA复制程序的具体细节进行更深入的分析。然而，该方法在技术上更具挑战性，且需要昂贵的设备。
对DNA复制的特定细节进行定性和定量分析的能力，为研究DNA复制本身的缺陷以及抑制与复制叉相关的基因组不稳定的通路提供了重要工具。毫无疑问，该检测方法将有助于进一步阐明复制介导的DNA修复机制，这些机制使正常细胞能够响应和适应环境变化，同时也揭示癌细胞如何利用这些机制来抵抗靶向复制叉药物的毒性作用。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢T. Helleday博士和E. Petermann博士在纤维技术方面提供的帮助，以及实验室其他成员的有益讨论。WN获得了国际癌症研究协会高级国际研究奖学金以及波兰国家科学研究委员会基金（N301 165935）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清金（FBS） | PAA Laboratories | A15-151 | |
| 鸡血清 | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| 青霉素/链霉素 | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 21875 | |
| 5-碘-2’-脱氧尿苷（IdU） | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-氯-2’-脱氧尿苷（CldU） | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| SuperFrost 载玻片 | VWR international | 631-0910 | |
| 盖玻片 No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield 封片剂 | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| 抗 BrdU 抗体（小鼠） | BD Biosciences | 347580 | |
| 抗 BrdU 抗体（大鼠） | Abcam | ab6326 | |
| 羊抗小鼠 Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| 山羊抗大鼠 Alexa Fluor 488 抗体 | Invitrogen | A110060 |
参考文献
- Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40. Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).
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- Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells. EMBO. J. 29, 806-818 (2010).
- Saribasak, H., Arakawa, H. Basic cell culture conditions. Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).
- Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses. Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).
- Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair. Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).
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