嗜碱性粒细胞活化试验是检测IgE依赖性过敏反应的有力工具 体外在此，采用一种优化的嗜碱性粒细胞活化试验方案来研究药物超敏反应。同时描述了一种高效制备共价药物-蛋白质偶联物的方法及其理化表征。
本文内容
摘要
摘要
针对丙苯沙酮（propyphenazone, PP）和双氯芬酸（diclofenac, DF）等非甾体抗炎药（NSAIDs）的超敏反应可表现为类似Ⅰ型的过敏反应1。在临床实践中，药物超敏反应的诊断主要依赖于患者病史，因为皮肤试验并不可靠，而口服激发试验则可能给患者带来危及生命的风险2。因此，很难获得支持其潜在IgE介导病理机制的确凿证据。
在此，我们介绍一种 体外 基于药物过敏患者来源的人嗜碱性粒细胞模拟过敏效应反应的方法 体内由于药物过敏患者的嗜碱性粒细胞携带针对致敏药物的特异性IgE分子，当IgE受体发生交联时，这些细胞即被激活并释放过敏效应分子。通过流式细胞术检测CD63表面表达的上调情况，可监测嗜碱性粒细胞的活化状态。 3.
对于小分子药物而言，设计其偶联物的目的是使嗜碱性粒细胞上的IgE受体发生交联。如图1所示，两种非甾体抗炎药（NSAIDs）代表物PP和DF通过羧基与赖氨酸残基的伯氨基发生反应，共价结合至人血清白蛋白（HSA）上。DF本身含有固有羧基，因此可直接使用4；而PP则需在研究前通过有机化学方法合成含羧基的衍生物1。
小分子化合物在蛋白质载体分子上的偶联程度及其空间分布对于确保两个IgE受体分子之间的交联至关重要。本方案采用配备连续示差折光（RI）和紫外（UV）检测系统的高效尺寸排阻色谱（HPSEC）来测定偶联程度。
由于所述方法学可应用于其他药物，嗜碱性粒细胞活化试验（BAT）有望用于确定药物超敏反应中的IgE介导机制。在此，我们通过BAT确定PP超敏反应为IgE介导，而DF超敏反应为非IgE介导。
方案
1. 药物偶联物的制备
- 将10 mg DF溶解于1 ml dH₂O中2在1.5 ml反应管中。后续操作中使用 95 μl 该DF溶液。将30.4 mg PP衍生物（304 g/mol）溶解于HSA中以进行PP与HSA的偶联。 500 μl 0.3 M 氢氧化钠（NaOH）。
- 添加 430.6 μl dH2O 和 100 μl 0.5 M 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液，pH 6.5 95 μl 溶解的DF。添加 33.1 μl dH2O 和 140 μl 加入2 M MES缓冲液（pH 2.9）至PP样品中。
- 添加 57.5 μl 新鲜配制的 N-ethyl-N盐酸-1-（3-二甲基氨基丙基）-3-碳二亚胺（EDC）储存液溶于去离子水2向DF样品中加入浓度为100 mg/ml的O，或 10 μl 将EDC溶液加入PP样品中。涡旋振荡样品1分钟。
- 添加 16.9 μl 向每个样品中加入浓度为118 mg/ml的HSA溶液。
- 室温下以300转/分钟振荡孵育样品2小时。
- 将DF和PP样品在2升磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中透析3次，每次数小时。所有透析步骤均在 4°C.
- 以 14,000 × g 离心 10 分钟，收集上清液，其中含有与 HSA 偶联的 DF 或 PP。
- 通过SDS-PAGE检测上清液中的蛋白质，使用12%凝胶。上样量约为 12 μg 将HSA偶联物加入一个凝胶孔中。
2. 确定药物偶联物的偶联率（图 2）
- 采用HPSEC分析DF与PP偶联物的偶联率时，使用含150 mM NaCl和0.05%叠氮化钠的100 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5）。使用7.8 × 300 mm TSK-Gel-G2000SWXL色谱柱。
- 采用在线联用的RI和UV检测器系统进行信号检测。
- 用dH2O配制浓度为1 mg/ml的HSA标准品溶液。为校准检测器，进样50 μl HSA标准溶液。
- 计算检测器的RI常数kRI和UV常数kUV。使用公式areaRI=kRI*[(dn/dc)HSA*c(HSA)] 和 areaUV=kUV*[(dA/dc)HSA*c(HSA)]，其中(dn/dc)HSA=0.185，(dA/dc)HSA=0.5185。
- 配制用于HPSEC的DF和PP衍生物标准品，确保可方便地进样5、10和30 nmol的两种标准品。
- 计算两种标准品的(dn/dc)drug和(dA/dc)drug平均值。对于DF，测得(dn/dc)为0.235 ± 0.010，(dA/dc)为39.000 ± 0.493。对于PP，测得(dn/dc)为0.328 ± 0.016，(dA/dc)为53.155 ± 2.464。
- 将药物偶联物注入HPSEC，测定其RI和UV峰面积。
- 通过求解以下两个方程，计算DF、PP衍生物和HSA的浓度：areaRI=kRI*[(dn/dc)drug*c(drug)+(dn/dc)HSA*c(HSA)] 和 areaUV=kUV*[(dA/dc)drug*c(drug)+(dA/dc)HSA*c(HSA)]，解出未知浓度。
3. 使用药物偶联物的 BAT
- 准备七个流式细胞仪管，根据其内容物进行标记：未染色对照、阴性对照、阳性对照和药物偶联物。
- 移液器 50 μl 将 B-CCR-STB 刺激缓冲液（Flow2 CAST，Bühlmann Laboratories，Schönenbuch，CH）加入预留用于未染色对照和阴性对照的试管中。阳性对照使用 50 μl 由Flow2 CAST试剂盒提供的抗FcεRI溶液。通过将浓度从0.02 - 逐步进行1:10倍比稀释，向预留用于药物偶联物的样品管中加入适量的偶联物溶液。20 μg/ml DF偶联物和PP偶联物（在测定体积中的终浓度） 200 μl）。这些滴定实验必须进行，以确定每个患者样本中嗜碱性粒细胞活化的最佳浓度。
- 添加 100 μl 向每管中加入刺激缓冲液 50 μl 患者的EDTA全血。小心混匀样品。
- 移液器 20 μl 向每管中加入含PE标记抗CCR3抗体和FITC标记抗CD63抗体的Flow2 CAST染色试剂，再次混匀。切勿将染色试剂加入未染色样本中！
- 将样品在37°C下孵育45分钟 37°C 水浴锅
- 冰上终止反应5分钟。
- 通过向每支小瓶中加入 2.0 ml Flow2 CAST 裂解试剂并轻轻涡旋振荡以裂解红细胞。将样品在室温下避光孵育 10 分钟。
- 将样品在500 × g离心5分钟，小心弃去上清液。
- 重悬细胞于 500 μl 流式细胞术洗涤缓冲液 Flow2 CAST 洗涤缓冲液，置于冰上保存直至进行流式细胞术。
- 在获取未染色样本时，调整流式细胞仪的前向散射光和侧向散射光（FSC、SSC）电压设置。
- 从SSC-FSC图中圈选预测为淋巴细胞的细胞，并将其门控至SSC-PE图。嗜碱性粒细胞通过PE标记的抗CCR3抗体鉴定为CCR3阳性细胞。你好 SSClo 并将其设门至FITC-PE图中。用于检测活化嗜碱性粒细胞的抗CD63抗体以FITC标记。
- 将嗜碱性粒细胞中 CD63 的阈值设定为最高 2.5%你好 在阴性对照中。若样本满足以下条件，则判定为嗜碱性粒细胞活化阳性： >5%的嗜碱性粒细胞为CD63阳性你好 且样品的平均荧光指数（MFI）与阴性对照的 MFI 之比大于 2 （图3）.
4. 代表性结果：
本实验评估了BAT作为检测IgE依赖性药物超敏反应的有效工具。使用NSAIDs的蛋白偶联物来激活嗜碱性粒细胞。通过配备RI和UV检测器的高效尺寸排阻色谱（HPSEC）测定偶联物的聚集状态、偶联度及有效产率。如图4所示，43.5%的双氯芬酸（DF）偶联物保持单体状态，偶联度为5.0 DF/HSA；对于聚集物，其偶联度为9.5。丙苯唑酮（propyphenazone, PP）偶联物中单体占68.5%，偶联度为21.2，其聚集物的偶联度为27.9。总体而言，DF偶联物的测定偶联度为7.6 DF，PP偶联物为23.2。
在优化条件（偶联物浓度、刺激时间）下使用偶联物进行嗜碱性粒细胞活化试验（BAT），可研究非甾体抗炎药（NSAID）超敏反应中IgE依赖性反应。如图5所示，仅PP偶联物能够触发嗜碱性粒细胞活化，表现为CD63表面表达上调：20.6%的嗜碱性粒细胞被活化，其特征为荧光强度出现对数偏移。MFI从386（阴性对照）增至1893，增长了4.9倍。相比之下，使用DF偶联物时仅有3.1%的嗜碱性粒细胞被活化，低于5%的截断值；MFI仅从197（阴性对照）增至210，增长倍数为1.1（阈值为2.0）。本检测的有效性依据如下：(i) 阴性对照中嗜碱性粒细胞活化率<5%；(ii) 嗜碱性粒细胞亚群出现荧光强度对数偏移；(iii) 阳性对照中活化嗜碱性粒细胞比例>50%。
图1. DF和PP衍生物与HSA的偶联。将药物溶解后，加入水、MES缓冲液和EDC（偶联试剂）。样品涡旋混匀1分钟，随后将HSA用移液器加入药物溶液中。在室温下振荡反应2小时内，药物共价结合至HSA。反应产物可能包括单体以及聚集体。
图 2. 偶联度的计算。首先，确定常数 kRI 和 kUV。为此，将已知浓度的人血清白蛋白（HSA）标准品注入高效尺寸排阻色谱（HPSEC）系统。(dn/dc) 和 (dA/dc) 的 HSA 取值分别为 0.185 和 0.5185。利用峰面积计算这两个常数。其次，对每种药物分别注入三个标准品，以确定该药物在特定浓度下的示差（RI）和紫外（UV）峰面积。由于上一步骤中已知 kRI 和 kUV 常数，因此可计算出该药物特异性的 (dn/dc) 和 (dA/dc) 值。第三步，将药物-HSA 偶联物注入 HPSEC 系统。利用所得的峰面积，通过求解含有两个未知数的两个方程，计算每个峰中药物和 HSA 的浓度。
图3. 嗜碱性粒细胞设门。预测为淋巴细胞的细胞在侧向散射与前向散射图（SSC-FSC 图）中设门。嗜碱性粒细胞被鉴定为 CCR3你好 SSClo 从门控的淋巴细胞（SSC-CCR3-PE 图）中分析嗜碱性粒细胞的活化情况（CD63）你好在CD63-FITC-CCR3-PE图中。阴性对照用于设定嗜碱性粒细胞残留CD63阳性的上限为2.5%你好.
图 4. 测定药物偶联物的偶联程度。RI 和 UV 信号显示两个峰，分别代表药物-HSA 偶联物的聚集体（在低保留体积处洗脱）和单体（在高保留体积处洗脱）。图中展示了单体和聚集体的百分比（由 RI 信号测定）及其偶联程度（n=1）。
图 5. 嗜碱性粒细胞活化试验。药物偶联物激活样本、阴性对照和阳性对照的结果显示在 CD63-FITC-CCR3-PE 散点图中（n=1）。
讨论
嗜碱性粒细胞活化试验（BAT）是一种已确立但尚未常规用于IgE介导的过敏性疾病诊断的方法6,7。然而，对于药物超敏反应，其应用受到限制，因为低分子量化合物无法交联IgE受体，而这是嗜碱性粒细胞活化所必需的前提条件8。因此，待研究的药物需要共价连接至合适的载体蛋白（例如人血清白蛋白HSA）。重要的是，必须控制偶联程度（即每个载体蛋白上的药物分子数），以确保偶联物具有免疫学活性（即能够交联IgE受体）。理论上，每个载体分子上两个半抗原就足以实现IgE受体的交联，已有研究表明每分子HSA上仅含五个双氟尼酸（DF）分子即可在基于细胞的检测中触发介质释放4。PP-HSA和DF-HSA两种偶联物均已通过高效尺寸排阻色谱（HPSEC）测定具有足够高的偶联程度，并证实具有免疫学活性，因此适合作为BAT中的试剂使用。另一个可能的问题是药物代谢产物可能发挥作用，即引发超敏反应的可能是代谢物而非原药。对于DF，此前已使用五种主要的I相代谢产物和一种连接变体对其可能性进行了详细评估4。成功掌握该技术的重要因素包括血液样本的质量（<采血后12小时内，检测到的嗜碱性粒细胞数量>500）以及刺激条件的优化（时间、剂量）。此外，还需识别所谓的“无应答者”，即对阳性对照（靶向IgE受体的抗体）也不产生反应的样本。因此，验证标准中必须包含抗FcεRI抗体作为阳性对照。使用药物偶联物的一个重要优势在于，与纯药物相比，它们似乎无毒性，这一点已在BAT中通过DF-HSA偶联物与抗FcεRI抗体共刺激实验得到证实4。相比之下，纯DF在浓度为1.25 mg/ml时表现出细胞毒性，从而影响BAT结果的可解释性9。通常，强烈建议对每一种新制备的药物偶联物进行潜在细胞毒性的检测。
在此，我们展示了PP-HSA偶联物在BAT中用于揭示IgE介导的超敏反应的潜力。相比之下，DF超敏反应与IgE无关，这一点通过DF-HSA偶联物未能引起嗜碱性粒细胞活化得以证实。重要的是，在对IgE介导机制存在疑问时，必须通过免疫学活性检测来评估偶联物的活性 体外 基于细胞的检测系统，这一点已在DF中得到证实4.
通过将小分子药物共价偶联至合适的蛋白质载体分子的所述方法，可研究多种药物超敏反应（包括抗生素、其他非甾体抗炎药、放射造影剂、肌松剂、麻醉药等）是否涉及IgE介导机制。因此，嗜碱性粒细胞活化试验（BAT）可作为现有诊断方法（如皮试、口服激发试验）的补充手段。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由奥地利科学基金（FWF）项目 P18820-B13 资助。
伦理声明：
该研究已获得萨尔茨堡大学涉及人类和/或动物实验伦理委员会的批准（批准编号：PLUS_Ethik_090514），符合1983年修订的《赫尔辛基宣言》，所有参与患者均签署了书面知情同意书。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-(N-吗啉代)乙磺酸 | Sigma-Aldrich | M3671 | - |
| 7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL 色谱柱 | Tosoh Corp. | 08540 | - |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | 338962 | - |
| 台式离心机 | Sigma-Aldrich | - | - |
| 双氯芬酸钠盐 | Sigma-Aldrich | D6899 | - |
| EDTA-Vacutainer | BD Biosciences | 368589 | - |
| Flow2 CAST 试剂盒 | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | 自2011年6月14日起，Flow2 CAST试剂盒现更名为Flow CAST |
| HP1100 高效液相色谱系统 | Hewlett-Packard | - | - |
| 人血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9511 | - |
| 实验室离心机 | Eppendorf | - | - |
| N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC） | Sigma-Aldrich | E6383 | - |
| PBS 片剂 | AppliChem | A9199 | - |
| 丙基苯偶氮酮衍生物 | 萨尔茨堡大学 | - | - |
| 振荡器 | Eppendorf | - | - |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S8032 | - |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S1679 | - |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | 90421C | - |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S5881 | - |
| 磷酸钠 | Sigma-Aldrich | 342483 | - |
| 三检测器阵列 | Viscotek | TDA302 | - |
| Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | - |
| 水浴锅 1012 | GFL | 1012 | - |
参考文献
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