一种基于PCR的基因分型方法以区分白茅（Imperata cylindrica）的野生型与观赏型品种

摘要

我们提供一种经济高效且快速的分子基因分型方案，该方案采用特异性PCR引物，靶向Imperata cylindrica（茅草）叶绿体trnL-F间隔区内的DNA序列差异，以区分仅靠形态特征无法鉴别的不同品种。这些品种包括被列为联邦有害杂草的茅草，以及与其亲缘关系密切且广泛栽培的观赏品种I. cylindrica var. koenigii（日本血草）。

摘要

野生型I. cylindrica（芒草）是全球十大最严重的入侵植物之一，已对非洲、亚洲、欧洲、新西兰、大洋洲和美洲共73个国家的农业及自然资源造成负面影响^1-2。芒草可迅速扩展并形成单一优势群落，排挤多种本地植物物种，进而威胁依赖这些被取代的本地植物获取饲料和庇护的本土动物。此外，一种观赏品种[I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] 以Imperata cylindrica 'Rubra'、红男爵（Red Baron）和日本血草（JBG）等名称被广泛销售。该品种被认为不育且无入侵性，因其红色叶片而被视为理想的观赏植物。然而，在适宜条件下，JBG可产生具有活力的种子（Carol Holko，2009年私人通讯），并可恢复为具有侵略性的绿色表型，其特征与野生型入侵品种相似，外观上通常难以与芒草区分⁴（图1）。这使得即使受过良好训练的植物分类学家也难以通过形态学进行准确鉴定。JBG恢复为具侵略性的绿色表型并非罕见现象。通过核DNA和叶绿体DNA中编码区与可变区的序列比对，我们已证实JBG在美国马里兰州、南卡罗来纳州和密苏里州境内已恢复为绿色入侵型。在美国大陆几乎所有尚未发生芒草侵染的州，JBG均已被销售和种植。由于恢复后的植株未被记录且常被清除，其恢复问题的严重程度尚不明确。

应用该分子实验方案可提供一种鉴定 JBG 恢复株的方法，有助于防止这两种类型共存并可能发生杂交。黄顶草为专性异花授粉植物，当其与不同基因型个体杂交时，可产生具有活力且能通过风力传播的种子，从而将黄顶草扩散至广阔区域^5-7。JBG 的基因型与野生型黄顶草略有不同，可能能够与黄顶草形成具有活力的杂交后代。更为严重的是，JBG 比黄顶草具有更强的耐寒性和耐荫性^8-10，这两种类型之间的基因流动很可能产生比野生型黄顶草更具侵袭性、更耐荫且更耐寒的杂交种。目前，野生型黄顶草在全球范围内已入侵超过 4.9 亿公顷的土地，在美国东南部已入侵超过 50 万公顷，并因其广泛的生态位和地理适应潜力，正迅速向北扩散，有能力占据美国大部分地区^3,7,11。基因杂交的可能性已引起美国农业部动植物卫生检验局联邦有害杂草项目（USDA-APHIS Federal Noxious Weed Program）的严重关注。目前，美国农业部动植物卫生检验局已在黄顶草严重入侵的州（如佛罗里达州、阿拉巴马州、密西西比州）禁止种植 JBG。然而，随着黄顶草和 JBG 分布范围的持续扩展，阻止二者结合将变得更加困难。此外，JBG 恢复株的分布现状尚不明确，且由于无法通过形态学特征准确识别这些类型，部分黄顶草的入侵可能实际上源于 JBG 恢复株。遗憾的是，当前常用的分子鉴定方法通常依赖于扩增片段长度多态性（AFLP）分析和 DNA 测序，这两种方法均耗时较长且成本较高。在此，我们首次提出一种经济高效且可靠的基于 PCR 的分子基因分型方法，可准确区分黄顶草与 JBG 恢复株。

方案

1. 标本采集与保存

该方法使用新鲜、冷冻以及近期干燥的叶片组织进行开发和测试。

1. 在专门从事禾本科植物鉴定的分类学家帮助下，识别芒草和/或观赏型JBG组织。由于观赏型JBG具有鲜红色叶片，因此可轻易与野生型芒草及JBG回复体在视觉上区分开来；然而，野生型芒草与JBG回复体之间几乎无法区分。芒草和JBG回复表型均具有绿色、较长的叶片，明显更大更长的根状茎，以及比JBG更大的叶面积¹²（图1）。
2. 新鲜叶片组织可提供最丰富且质量最高的DNA，可采自田间或温室种植的I. cylindrica植株。若使用新鲜组织，应在采集后3小时内提取DNA，以防止降解。否则，应准备组织进行储存，并保持组织低温且避免阳光直射。
3. 如需将组织保存以备后续DNA提取，最佳方法是立即在-80°C下冷冻并储存组织。在DNA提取前不得使冷冻组织解冻。在进行DNA提取的研磨步骤前，应将冷冻组织转移至液氮中，以防解冻。
4. 若无-80°C冰箱，应立即干燥组织。进行干燥储存时，将组织放入纸袋中，并将纸袋置于干燥的硅胶或其他活性干燥剂中，在室温下保存。在非指示型硅胶中混入少量指示型硅胶，可确保硅胶完全脱水，适合用于植物组织干燥。
5. 硅胶用量应至少为新鲜叶片组织重量的10倍。植物组织应在24小时内完成干燥。随着时间推移，干燥储存会导致DNA的质量和产量下降（如标本馆标本的情况）。

2. DNA 提取

提取植物组织DNA时，请按照DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA；货号# 69104或69106）的生产商说明书操作，仅作一处微小修改。每根吸附柱所用材料无需局限于建议的少于100 mg新鲜组织或少于20 mg干燥组织，而应研磨超过100 mg的组织，然后从新鲜或冷冻组织中转移100 mg（或从干燥组织中转移> 20 mg）至相应的提取管中。核DNA和质体DNA将被同时提取。

1. 开始这些操作之前，请确认已在缓冲液 AP3/E 和 AW 中加入乙醇。
2. 使用液氮分三轮在预冷的研钵和研杵中将 >100 mg 的新鲜或冷冻叶片组织（或 >20 mg 的干燥叶片组织）研磨成细粉。起始材料破碎不充分或裂解不完全可能导致 DNA 产量降低。请仔细研磨组织，并避免向柱子中加入过多组织造成过载。
3. 将 100 mg 来自新鲜或冷冻组织的冻粉（或 20 mg 来自干燥组织的粉末）转移至含有 400 μl 缓冲液 AP1 和 4 μl RNase A 的 1.5 ml 微离心管中。可将每根试管置于天平上的小架中，以监测每管组织的准确重量。
4. 涡旋或振荡样品以混匀，并在 65°C 下孵育 10 分钟，孵育期间翻转试管 2–3 次。
5. 向每个样品中加入 130 μl 缓冲液 AP2。通过反复翻转试管混匀，然后在冰上孵育 5 分钟。
6. 将每份裂解液转移至一个独立的 QIAshredder Mini 离心柱中，并将每根柱子放入一个 2 ml 收集管（试剂盒中提供）中。在 20,000 x g（约 14,000 rpm）下离心 2 分钟，将每份穿流液转移至新的试管（试剂盒未提供）中，注意不要扰动形成的沉淀。
7. 加入 1.5 倍体积的缓冲液 AP3/E，并用移液器吹打混匀。
8. 将 650 μl 混合液转移至置于 2 ml 收集管中的 DNeasy Mini 离心柱中。在 6,000 x g（约 8,000 rpm）下离心 1 分钟，弃去穿流液。对每个样品的剩余混合液重复此步骤。
9. 将离心柱放入新的 2 ml 收集管中，向每根柱子顶部加入 500 μl 缓冲液 AW。在 6,000 x g（约 8,000 rpm）下离心 1 分钟，弃去穿流液。
10. 向每根柱子顶部再加入 500 μl 缓冲液 AW。在 20,000 x g（约 14,000 rpm）下离心 2 分钟。此步骤可干燥柱子，从而去除缓冲液中可能抑制 PCR 的残留乙醇。
11. 将每根离心柱转移至新的 1.5 ml 微离心管中。向每根柱子顶部加入 100 μl 缓冲液 AE 进行洗脱，并在室温下孵育 5 分钟。在 6,000 x g（约 8,000 rpm）下离心 1 分钟以收集 DNA。
12. 重复一次上述洗脱步骤，将 DNA 洗脱至同一根 1.5 ml 微离心管中，最终获得 200 μl 样品。将 DNA 样品储存于 -20°C 直至使用。DNA 浓度取决于组织类型和储存条件。使用总共 200 μl 缓冲液 AE 洗脱时可获得最佳产量；然而，若将洗脱体积减少至最低 50 μl，浓度可进一步提高。

3. DNA 质量与数量的验证

1. 在进行PCR体系构建之前，使用分光光度计或荧光计以及凝胶电泳检测所提取DNA的质量和数量。这有助于确保后续步骤的成功。
2. 使用分光光度计检测DNA的质量和数量。理想的DNA浓度应在50至150 ng/μl之间，且260/280和230/280比值应接近2.0。例如，图2展示了使用NanoDrop分光光度计（ThermoScientific, Wilmington, DE）获得的高质量结果。
3. 采用标准的1%琼脂糖凝胶进行电泳。确认存在相对较大的条带（>10 Kb），且无或仅有少量由RNA污染引起的拖尾现象（图3）。
4. 如果DNA浓度过高，应将DNA样品稀释至70 ng/μl，用于后续步骤。

4. PCR 引物

本实验方案中使用的PCR引物基于黄苞茅和JBG基因型叶绿体trnL-F间隔区序列的差异。这些差异以单核苷酸多态性（SNPs）和插入/缺失（InDels）的形式存在，通过将引物定位在特有序列位点，从而设计出品种特异性的引物（图4）。

1. 引物的质量可能对PCR结果产生显著影响。应从信誉良好的公司订购引物。我们通常从美国阿拉巴马州亨茨维尔的Oblique Bio, Inc.公司订购（http://www.obliquebio.com/web/），仅要求进行标准的脱盐处理。
2. trnL-F阳性对照引物： 该引物组可扩增大多数禾本科分类群的质体trnL-F间隔区^11-13，适合作为良好的阳性对照（产生一条890 bp的条带）。
   

   名称	序列
   trnF(GAA)-F	5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3'
   trnL(5' exon)-C	5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'

3. 野生型黄苞茅引物： 该引物组特异性针对黄苞茅，不会扩增JBG基因型的trnL-F区域。该引物组扩增产物为595 bp的条带。
   

   名称	序列
   trnLF-C-F1	5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3'
   trnLF-C-R1	5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 '

4. JBG及JBG回复突变体引物： 该引物组特异性针对JBG基因型，不会扩增黄苞茅的trnL-F区域。该引物组扩增产物为594 bp的条带。
   

   名称	序列
   trnLF-R-F2	5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3'
   trnLF-R-R2	5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3'

5. 用适量无核酸酶的ddH₂O溶解每种引物，配制成100 mM的储存液，并可长期保存于-20°C。
6. 在进行PCR体系构建前，将每种引物储存液稀释至12 mM。

5. PCR 反应体系的建立

使用上述每对引物在PCR反应中扩增DNA提取物。需设置阳性对照，以确保所有PCR试剂均能正常工作并产生条带。还需设置阴性对照，以确保任何试剂均未被外源DNA污染。阴性对照不含模板DNA，不应产生任何条带。

1. 使用薄壁PCR管配制所有反应体系，以促进PCR仪金属块与样品之间的热传导。建议使用市售的防气溶胶污染移液器吸头，以避免污染。
2. 针对每个已提取的DNA样品，在0.2 ml薄壁PCR管中，于冰上按以下顺序加入试剂，配制50 μl PCR反应体系。若需处理多个样品，可预先配制除DNA模板外的所有试剂混合液（预混液），以确保各反应条件一致。
   

   PCR试剂	使用体积	终浓度
   无核酸酶ddH2O	40.5 μl
   10X Advantage 2 PCR缓冲液（Clonetech, CA）	5.0 μl	10% (v/v)
   Advantage UltraPure PCR dNTP混合液（各10 mM，Clonetech, CA）	1.0 μl	0.2 mM
   引物1（12 μM，溶于ddH2O）	1.0 μl	0.24 μM
   引物2（12 μM，溶于ddH2O）	1.0 μl	0.24 μM
   Advantage 2聚合酶混合液（Clonetech, CA）	0.5 μl	1% (v/v)
   DNA提取物（70 ng/反应；根据需要调整ddH2O体积）	1.0 μl	1.4 ng/μl
   	总计：50.0 μl

3. 为确保所有PCR试剂性能良好，使用阳性对照引物设置阳性对照反应。该引物组对白茅、JBG、JBG回复株及其他禾本科植物均有效，扩增产物为890 bp的条带。
4. 使用与阳性对照相同的引物组设置阴性对照，以ddH₂O替代DNA提取物。若所有试剂均无DNA污染，该反应应无扩增条带。
5. 若DNA浓度较低，可向每管反应中加入更多DNA，并相应调整无核酸酶ddH₂O的用量，使总体积保持为50 μl。每反应中DNA体积不得超过5 μl（占总体积的10%），因为DNA样品中可能含有的杂质会抑制PCR反应。

6. PCR 循环

1. 使用配备加热盖的热循环仪进行PCR扩增，PCR循环参数如下。我们使用Eppendorf（Hauppauge, NY）的Mastercycler pro S热循环仪，并设置为标准升降温条件。任何高质量的热循环仪均可获得良好结果。
   

   循环	变性 退火	延伸
   1	95°C 下 2 分钟
   2	95°C 下 30 秒	61°C 下 30 秒，68°C 下 90 秒，共 35 个循环
   3		68°C 下 5 分钟
   样品取出前，保持在 4°C 保存

2. 根据所用DNA质量、引物、Taq DNA聚合酶或热循环仪类型，按需优化PCR条件（包括引物退火温度、延伸时间及循环次数）。我们建议在确定最佳退火温度时使用具备梯度功能的热循环仪。
3. 若所用热循环仪无加热盖，则在每个样品液面上方加入一滴矿物油，以防止PCR循环过程中液体蒸发。

7. PCR产物的凝胶电泳

为了直观展示分析结果，使用标准电泳方法在1%琼脂糖凝胶上分离PCR产物。

1. 取2 μl标准DNA上样缓冲液（通常为5x或6x溶液）与5 μl每种扩增后的PCR产物混合。
2. 将样品加入含有EtBr（用于DNA染色的溴化乙锭）的1%琼脂糖凝胶中，凝胶使用TAE或SB（硼砂）缓冲系统制备¹⁶。我们每100 ml 1%琼脂糖凝胶加入1 μl浓度为10 mg/ml的EtBr储备液（终浓度0.1 μg/ml）。
3. 以约120V电压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶总长度的3/4处。
4. 在紫外光下（例如短波紫外透射仪），观察产生的条带，确认是否扩增出目标片段。
5. 使用可用的凝胶成像系统或相机记录凝胶及条带结果。

8. 典型结果

在观察PCR产物时，茅草与JBG或回复突变的JBG相比具有独特的条带模式（图5）。对于每个DNA样本，trnL-F阳性对照引物组应产生一条约890 bp的单一高亮度条带，这表明所有PCR试剂均工作正常。同样，阴性对照（无模板）反应中，任何引物组均不应出现条带，以证实所用试剂均未受到污染。

如果DNA样本来源于野生型茅草，使用茅草特异性引物组进行PCR反应将产生一个约595 bp的单一条带，而使用JBG特异性引物则不会产生条带。同样，如果DNA样本来源于JBG或恢复型JBG，则使用JBG特异性引物组进行PCR反应将产生一个约594 bp的单一条带，而茅草特异性引物则无扩增条带。由于JBG与恢复型JBG具有相同的核酸序列，因此它们的电泳条带模式也完全相同。若需在同一凝胶上同时比较多个样本，我们建议将同一引物组扩增的所有样本相邻排列，以便更方便地扫描各样本中的阳性结果。

JBG及其回复突变体之间的形态学差异较为明显（例如，JBG叶片呈红色且植株较矮小，而回复突变体叶片为绿色、植株更高大且生长更具侵略性），因此尽管PCR结果相同，仍可通过植物形态特征轻松区分JBG的不同类型。

图1. 温室培养的Imperata cylindrica var. koenigii（日本血草）、回复突变的I. cylindrica var. koenigii（JBG回复株）与I. cylindrica（野生型茅草）的比较。

图 2. 使用NanoDrop分光光度计验证DNA样品的示例。请注意，无论使用何种分光光度计，260/280比值应接近1.8，260/230比值应接近2.0。

图3. 采用1%琼脂糖凝胶进行标准凝胶电泳检测DNA样品。使用商业DNA标记物进行大小分析。第4泳道为低质量DNA样品的示例，显示弥散条带及部分RNA污染。

图 4. Imperata cylindrica var. koenigii（日本血草）、回复型I. cylindrica var. koenigii（JBG回复型）和I. cylindrica（野生型黄茅草）的trnL-F区段序列比对。垂直黑色箭头表示由SNP和InDel引起的序列差异。水平绿色箭头表示用于黄茅草特异性PCR的野生型黄茅草引物位置。水平红色箭头表示用于JBG特异性PCR的JBG及JBG回复型引物位置。请点击此处查看该图的放大版本。

图5. 利用白茅、JBG及JBG回复体DNA样本，结合白茅特异性引物、JBG特异性引物、trnL-F阳性对照以及无模板阴性对照进行PCR扩增后，凝胶电泳的代表性结果。

讨论

美国的苗圃和园林产业依赖于培育和销售外来及新奇的植物物种。这与日益增长的全球贸易一体化相结合，增加了入侵性植物物种进入、定殖并扩散到美国境内的可能性。对这类植物进行联邦监管的能力依赖于一些通常无法获得的信息，包括其成为入侵物种的潜力、正确的分类学地位，以及与本地种和归化种在遗传上的区别。由于我们对入侵植物的认识往往有限，一些具有隐蔽入侵特性的进口植物曾被主动引入，但后来才发现它们会侵入我们的农业和自然资源。本方案旨在解决与I. cylindrica品种相关的此类问题，提供首个简化的分子方法，能够准确区分野生型黄茅草（cogongrass）与其观赏品种JBG的返祖形式。

本实验方案所用的野生型五节芒于2008年6月从佛罗里达州杰伊市附近圣罗莎县庞德克里克林业区的自然种群中采集。2008年6月，日本血草（JBG）购自一家商业苗圃（Bluebird Nursery, Inc.），同时也采集自密苏里州哥伦比亚市一位居民的种植样本。JBG返祖植株分别于2008年6月采自南卡罗来纳州克莱姆森大学坎贝尔地质博物馆的庭院，于2009年6月采自马萨诸塞州里弗代尔的大学公园，以及于2009年采自密苏里州哥伦比亚市一位居民的前院（由Leland Cseke鉴定）。所有植株均栽培于阿拉巴马大学亨茨维尔分校（亨茨维尔，阿拉巴马州）的温室中进行养护。

对从这些植物中采集的DNA进行基因测序，包括对9个常用于植物条形码的独立DNA区域进行深入比对²。在所有情况下，JBG的序列与其恢复绿色表型的JBG revert完全一致，从而证实JBG确实会恢复为具有入侵性的绿色形态。只有核ITS区域和叶绿体trnL-F区域存在可用于在遗传上区分茅草与JBG的差异。ITS区域在茅草与JBG之间共有3个SNP（单核苷酸多态性），而trnL-F区域则有2个SNP和2个InDel（插入和缺失）。这些遗传差异使得能够开发出品种特异性的PCR引物，以区分野生型茅草与JBG恢复株。迄今为止最可靠的结果来自基于质体trnL-F区域设计的引物。因此，本实验方案基于茅草、JBG及其恢复株的叶绿体基因组中trnL-F区域之间的序列差异（图4）。

为了帮助设计出对目标品种更具特异性的引物，并避免来自近缘物种的假阳性结果，所有已知的 trnL-F 序列 I. cylindrica 品种之间进行了比较 trnL-F 来自近缘禾本科物种的序列（29个物种的43条独立序列， 例如, 香茅（Cymbopogon citratus）、不完整高粱草（Sorghastrum incompletum）、薏苡（Coix lacryma-jobi）、芒（Miscanthus sinensis）、甘蔗（Saccharum officinarum）、约翰逊草（Sorghum halepense））。尽管我们已在29种禾本科植物中检测了品种特异性引物序列，但这些品种特异性引物能否扩增大多数其他禾本科植物的DNA，其特异性尚未得到全面验证。因此，用于DNA提取的组织应被谨慎鉴定为 I. cylindrica 在开始本方案之前。如果无法将该草种鉴定为芒草或JBG，则建议对PCR产物进行测序，以确认其序列与芒草或JBG完全匹配。目前，验证特定草类样本身份最准确的方法是对两者均进行PCR扩增 trnL-F 和ITS区域，随后对PCR产物进行测序验证，并将所得序列与准确鉴定分类单元的已知序列进行比对。可使用本方案中详述的对照引物扩增DNA（用于 trnL-F 区域）或其他文献中提供的引物^13-15测序比使用我们的简化流程更加耗时且成本高昂。

PCR 所用引物的质量对实验的成功至关重要。本实验所用的引物可从 Oblique Bio, Inc. 获取（http://www.obliquebio.com/web/，美国阿拉巴马州亨茨维尔）。从 Oblique Bio 订购引物的优势在于，他们保存了与我们在实验室优化过程中所用引物来自同一批次生产样品的大量分装 aliquot。因此，这些引物不仅序列相同，而且与本方案中使用的引物完全来自同一批次生产。使用同一批次的引物有助于避免因 PCR 引物质量差异而引入的额外变量。同样，尽管其他 Taq 聚合酶在 PCR 中也应能正常工作，但所用 Taq 聚合酶的质量将直接影响 PCR 结果的质量。为了提高 PCR 试剂的一致性，本方案已使用 Clontech 公司的试剂进行优化。Advantage 2 Polymerase（Clontech，美国加利福尼亚州芒廷维尤，货号# 639201 或 639202）是一种强效的热启动 Taq 聚合酶与校读酶的混合物，有助于实现高特异性和更准确的扩增。

由于本实验方案依赖于叶绿体DNA，而叶绿体DNA在禾本科植物中为母系遗传，因此本分子鉴定程序可能无法检测到黄顶草与JBG基因型之间的杂交事件。当怀疑存在杂交时，我们建议使用来自双亲遗传的核基因区域。在植物基因分型中，最常用的非质体可变区域是核糖体ITS区^13-15,17。目前，我们正在推进在同一PCR反应管中同时扩增叶绿体trnL-F区和核ITS区的多重扩增技术。将质体DNA区域与核DNA区域联合进行多重扩增，有望克服单独使用任一区域的局限性；然而，此类方法需要针对具体案例进行优化和进一步评估以确定其可行性。此外，定量实时PCR（qPCR）以及分子信标（荧光引物探针）等新技术也正在被评估作为可靠且准确的植物基因分型方法。

本文提供的方案能够快速、可靠地区分JBG回复突变体与野生型茅草。我们鼓励使用本方案的研究人员与我们联系，报告使用该方案所获得的结果。此类共享信息将有助于了解JBG回复突变体的分布情况，同时也有助于美国农业部（USDA）的监管机构做出科学决策，以采取必要措施防止高度入侵性的茅草品种扩散及其潜在的杂交风险。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DNeasy 植物微量提取试剂盒	Qiagen	69104 或 69106	任何可提取高质量 DNA 的可靠植物基因组 DNA 试剂盒均适用于本实验流程。
trnF(GAA)-F	Oblique Bio, Inc.	3-0578	正向阳性对照引物
trnL(5’ 外显子)-C	Oblique Bio, Inc.	3-0579	反向阳性对照引物
trnLF-C-F1	Oblique Bio, Inc.	3-0864	野生型黄茅草正向引物
trnLF-C-R1	Oblique Bio, Inc.	3-0865	野生型黄茅草反向引物
trnLF-R-F2	Oblique Bio, Inc.	3-0866	JBG 及 JBG 回复体正向引物
trnLF-R-R2	Oblique Bio, Inc.	3-0867	JBG 及 JBG 回复体反向引物
Advantage UltraPure PCR dNTP 混合液	Clontech Laboratories	639125
Advantage 2 聚合酶	Clontech Laboratories	639201 或 639202	性能优良的具有校对功能的热启动 Taq 聚合酶