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通过显微注射实现嗜尸线虫Pristionchus pacificus的RNAi介导基因敲低与转基因

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DOI：

10.3791/3270

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2011年10月16日

 , 
1Biology Department, California State University

本文内容

摘要

在模式生物中，转基因技术可操控基因功能，而RNA干扰（RNAi）则可降低特定mRNA转录水平1-2。本实验方案旨在介绍将稳定遗传的DNA和瞬时双链RNA导入嗜尸线虫Pristionchus pacificus所需的技术，以用于进化生物学、发育生物学和行为生物学的研究。

摘要

尽管新兴模式生物的全基因组测序成本正日益降低，但由于这些生物特有的解剖结构和分子细胞生物学特性，利用RNA干扰和稳定转基因技术进行更深入的基因功能与表达分析在许多物种中仍然受限。例如，在冠群以外 秀丽隐杆线虫 包括 秀丽隐杆线虫 elegans3，可在非秀丽隐杆线虫 该物种丰富的门类（Nematoda）中尚未见报道，仅有一种例外 粪类圆线虫 stercoralis4 和 Pristionchus pacificus5. 为了促进不断拓展的作用 P. pacificus 在发育、进化和行为研究中6-7，本文介绍了利用显微注射技术制备转基因动物以及通过RNAi实现基因敲低的现有方法。如同性腺的 秀丽隐杆线虫 以及其他大多数线虫一样，其生殖腺的 P. pacificus 是合胞体结构，当通过直接显微注射递送时，能够将DNA和RNA整合到卵母细胞中。与 秀丽隐杆线虫 然而，外源基因的稳定遗传和体细胞表达在 P. pacificus 需要加入经与目标转基因和共注射标记物末端互补的内切酶消化的自身基因组DNA5加入载体基因组DNA与转基因表达所需条件类似 粪类圆线虫4 以及生殖细胞中的 秀丽隐杆线虫。然而，目前尚不清楚对动物自身基因组DNA的特定需求是否因为 P. pacificus 胞体在沉默非复杂多拷贝基因或染色体外阵列方面效率非常高 P. pacificus 需要基因组序列以在有丝分裂期间正确组装动粒。在雌雄同体中，双臂型（双子宫型）性腺的腹侧迁移进一步增加了对单条线虫个体的两个性腺进行显微注射的难度。8我们还展示了利用显微注射技术敲低一种显性突变基因（roller，tu92) 通过向性腺注射双链RNA（dsRNA）以获得非滚动型F代1 子代。与 秀丽隐杆线虫，但与大多数其他线虫一样， P. pacificus PS312 无法通过饲喂或浸泡方式接受系统性 RNAi，因此必须通过显微注射将 dsRNA 注入合胞体性生殖腺。在本研究中，我们旨在描述实现转化所需的显微注射过程 Ppa-egl-4 启动子::GFP融合报告基因与敲降显性滚筒表型 prl-1 (tu92) 在一种视觉信息丰富的方案中的突变体。

方案

1. 转基因：DNA 准备

  1. 显性共注射标记: pRL3 [Ppa-prl-1(tu92)]
    的 pRL3 质粒是一种显性的共注射标记，用于通过视觉识别成功转化的事件。该质粒编码一种显性突变等位基因（tu92的 Ppa-prl-1 与基因密切相关 sqt-1 胶原基因在 秀丽隐杆线虫 并将野生型正弦波状运动转变为沿虫体轴线的顺时针扭曲运动1,5. 该转基因动物与常用的显性筛选标记非常相似 rol-6 （su1006）用于 秀丽隐杆线虫 20年来。
  2. 靶向报告基因转基因： Ppa-egl-4p::gfp
    一个目的基因可在转录水平或翻译水平上与GFP编码序列相连9. 在本研究中， Ppa-egl-4启动子::gfp (egl-4，cGMP依赖性蛋白激酶）用于检测翻译起始位点上游的2 kb片段是否能够驱动GFP表达 P. pacificus PS312。该GFP载体包含一个经过修饰的GFP编码区
    内含子与多功能性 Ppa-rpl-23 3' 非翻译区终止子5 由 Xiaoyue Wang 和 Ralf J. Sommer（德国图宾根马克斯·普朗克研究所，欧盟）惠赠。
  3. 基因组 DNA：PS312
    野生型的添加 P. pacificus PS312 基因组 DNA 对于获得稳定的转基因遗传是必需的，尤其是来自转基因 F 代的遗传1 动物至其 F2 子代5目前尚不确定基因组DNA是否会与两个转基因（共注射标记）形成复杂的染色体外阵列。 pRL-3 以及 Ppa-egl-4p::gfp 报告基因) 与在稳定 F 中观察到的相似2 转基因品系在 秀丽隐杆线虫3然而，基因组DNA与转基因必须具有相同黏性末端的要求，强烈提示会形成宿主细胞可识别的复杂染色体外阵列，以实现DNA的正确传递（基因组DNA使用Sigma G1N10试剂盒制备）。
  4. DNA 消化
    限制性内切酶用于使 Ppa-egl-4p::gfp 载体DNA，并产生与共注射标记物相容的黏性末端 pRL3 以及 PS312 gDNA。轻弹混匀，切勿涡旋。在 37°C 下孵育一小时 37°C.
pRL34 μg
10x缓冲液10 μl
PstI (10 U/μl)4 μl
dH2O~
总量：100 μL
Ppa-egl-4p::gfp4 μg
10x缓冲液10 μl
SalI (10 U/μl)4 μl
dH2O~
总量：100 μl
gDNA PS31210 μg
10x缓冲液10 μl
Pst I 和 Sal I (10 U/μl)8 μl
dH2O~
总量：100 μl

表1. 限制性内切酶消化反应体系。

  1. DNA 沉淀与制备
    1. 向消化产物中加入 1:10 体积的醋酸钠（3 M NaCOOCH3，pH 5.2）和 2.5 倍体积的 100% 乙醇；加入 20 ng/μl 的糖原以使沉淀更易观察。
    2. 在 4°C 下以 14,000 rpm 离心 15 分钟。
    3. 将离心管缓慢倒置，轻轻倾倒上清液，并在纸巾上轻敲管口，确保沉淀牢固地位于管底角落且无乙醇残留。
    4. 加入 1 ml 75% 乙醇。
    5. 立即在 4°C 下以 14,000 rpm 离心 5 分钟。
    6. 将离心管缓慢倒置，轻轻倾倒上清液，并在纸巾上轻敲管口，确保沉淀牢固地位于管底角落且无乙醇残留。
    7. 在 25–30°C 下以 14,000 rpm 使用真空离心仪干燥沉淀 5 分钟，直至完全干燥且无乙醇残留。
    8. 加入 30 μl TE 缓冲液或无菌 dH2O，4°C 过夜孵育，随后短暂涡旋混匀。
    9. 表 2 描述了如何将每种纯化的 DNA 制备成用于注射的混合物。
    10. 储存于 -20°C。使用前将注射混合物解冻，并在 14,000 rpm 离心 5 分钟，以去除可能堵塞注射针头的杂质颗粒。
遗传物质浓度
Ppa-egl-4p::gfp (SalI)>5 ng/μl (0.1-10 ng/μl)
pRL3 (PstI)>1 ng/μl
gDNA PS312 (PstI + SalI)>60 ng/μl
dH2O~
总计：30 μl

表2. Ppa-prl-1 注射混合物

2. RNA干扰：体外双链RNA合成

  1. 使用 PCR 扩增目的基因。采用引物 RHL091 5'- agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3'（BamHI 位点）和 RHL092 5'- tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3'（PstI 位点）从含有 pRL3 载体的 Ppa-prl-1(tu92) 等位基因中扩增出一段 464 bp 的基因组片段（位置 3-466）。
  2. 用 BamHI 和 PstI 酶切 PCR 产物。
  3. 将酶切后的片段连接至经 BamHI/PstI 酶切的 pL4440 RNAi 饲喂载体2 中。
  4. 将插入载体转化至感受态细胞，并在含氨苄青霉素的 LB 培养基平板（50 μg/ml）上培养。
  5. 使用 T7 引物通过 PCR 筛选成功插入的载体。
  6. 利用 T7 引物扩增出包含 prl-1 基因的 PCR 产物，使用 BLOCK-IT RNAi 合成试剂盒（Invitrogen）制备双链 RNA（dsRNA）。
  7. 用于注射的 dsRNA 浓度最好 >200 ng/μl，最高可达 1 μg/μl。
  8. 储存于 -20°C。解冻用于注射的样品后，以 14,000 rpm 离心 5 分钟，去除可能堵塞注射针头的杂质颗粒。

3. 显微注射：转基因和/或dsRNA注射方案

  1. 注射针头
    1. 设置 Narishige 针头拉制仪（型号 #: PC-10）的温度：
      1. 将底部旋钮转至“No.2 Heater”。
      2. 调节“No.2 Heater Adj.”旋钮，使面板显示温度为 55.0–60.0°C，以制备不同长度的锥形针尖。
    2. 将底部旋钮转回“Step 1”（一步拉制针头）。
    3. 将针头装入腔室，并确保其固定牢固。
    4. 按下“Start”按钮（红色按钮），启动拉针程序，使所有重物参与作用（应同时在相反方向拉出两根相同的针头）。
    5. 从腔室中取出针头，并将其存放于塑料培养皿中，用培乐多（Play-Doh）固定以防止灰尘积聚在针头上。
  2. 制备载样垫
    1. 在 1.5 ml 离心管中，加入 0.02 g Noble Agar 至 1 ml H2O 中，配制成 2% Noble Agar 溶液。琼脂可在 4°C 下保存长达一年。
    2. 充分混匀后，置于设定温度 >88°C 的加热块中熔化琼脂。
    3. 使用 1 ml 微量移液器，将一滴液态 2% Noble Agar 滴加至载玻片（Fisher, 12-544-F）中央。
    4. 将另一张载玻片覆盖在液滴上，压平。
    5. 重复“滴加步骤”，直至形成五层载玻片厚度的琼脂层。
    6. 通过相互滑动的方式逐张取下各载玻片。
    7. 将载玻片上的琼脂垫在真空烘箱中于 70°C 干燥 4 小时至过夜（或室温下过夜干燥）。
    8. 制备多个注射垫，并储存以备后续使用。
  3. 对雌雄同体性腺进行显微注射

秀丽隐杆线虫解剖图；线虫结构，生殖系统、消化系统。
图 1. P. pacificus 解剖结构示意图。 透明的有核细胞为雌性生殖细胞（卵母细胞），灰色阴影部分为肠道。图中仅显示一个远端前侧性腺，但请注意两个远端性腺在体中部背侧相互交叉。

在微流控分析下观察线虫的显微镜图像；关注其结构与形变。
图 2. 显微注射图像。 （A）注射针尖与毛细管拉制末端最右侧线条对齐。轻轻将针尖触碰该边缘，针尖应断裂但仍保持锋利。（B）第一次注射时，针头插入肠道弯曲上方的上部性腺。（C）第二次注射时，针头插入肠道弯曲下方的下部性腺。

    1. 确保对比度和微分干涉差（DIC）剪切设置适合观察雌雄同体的性腺。
    2. 加载 1.0-2.0 μl 将注射混合物注入拉制的毛细玻璃针中。
    3. 将针头置于显微注射操作器中；氮气罐的压力计应调节至理想条件（0.5-1 秒内 10-20 psi）。
    4. 通过将针尖轻轻接触置于载玻片上的细拉毛细管边缘来折断针尖（图2A）。
      1. 针式断裂载片：将拉制毛细管最细部分置于载玻片的油滴中
    5. 一旦针断裂，可将其置于闲置位置，然后将线虫挑至垫片上（P. pacificus 注射窗口期为5分钟，之后它们会因干燥而死亡。
    6. 使用一块布满 J4-年轻成虫期线虫的培养板，倒入足量的石蜡油（重质），使其刚好覆盖 OP50 菌苔中的所有线虫。
    7. 挑选一条线虫并将其置于注射垫上。
    8. 将带有线虫的玻片置于显微镜下，使线虫的性腺朝向针头，而阴门远离针头（图2B、2C）。
    9. 将针头降至显微镜视野位置。
    10. 将上部性腺与针置于同一焦平面上（图2B）。
    11. 轻轻触碰线虫并注入混合液；若观察到卵母细胞向远端尖端分离，则表明注射成功（为优化转基因或dsRNA的递送，注射时应看到性腺出现扩张波纹，持续延伸至接近远端尖端）。
    12. 将针头重新定位至下方性腺并重复注射；但由于该性腺位于肠道下方，无法观察到卵母细胞的扩散，因此操作难度更大（图2C）。
    13. 外观正常的线虫表明显微注射成功；不应出现任何受损的性腺（如从阴门突出或在体腔内破裂）。
    14. 将针头放回空闲位置。
    15. 准备拯救线虫。
    16. 加入一滴（0.5 μl将适量M9缓冲液滴加到放置已注射线虫的垫上。
    17. 用接种环挑取少量OP50细菌，接触线虫，线虫便会粘附。我们不使用口吸移液法。
    18. 将线虫放置到接种有菌的培养板上 50 μl OP50 菌落上，每块平板可挽救 2-4 条线虫。
  2. 注射后储存 & 转基因筛选
    1. 储存已注射的线虫（P0) 在 20°C 约 4 天以产卵并成长1.
    2. 第四天筛选具有特定表型的线虫（若筛选转基因个体，则寻找表达滚动表型并携带相应标记的动物） Ppa-prl-1 显性标记
    3. 挑选单个独立的 F1将具有观察到的表型的动物转移至新的接种平板，并储存于 25°C；该温度有利于从F中形成稳定的谱线1s.
    4. 单次 F2 来自独立的 F1 线条。单个 F2 转基因传递率相似的品系。我们经常获得 >15 F2 每转化F的线条数1 动物
    5. 将后续世代保存于 25°C.
    6. 滚筒的传输速率通常在F之后保持不变4 因此，此时有必要确定目标转基因的表达水平（Ppa-egl-4p::gfp每条线型需单独进行检测。GFP 表达可能与显性 Roller 表型的外显率程度不一致。
  3. 注射后储存 & RNAi 表型筛选
    1. 储存已注射的线虫（P0) 在 20°C 约 4 天以产卵并培养 F1.
    2. 屏幕 F1 第四天观察选定表型的线虫（为筛选RNAi敲低表型，需寻找与目标基因活性丧失相关的外显表型，在本实验中即为 Ppa-prl-1 表型
    3. 根据我们的经验，非翻滚型敲低表型会消失 >97% 的 F2.

4. 代表性结果：

1. 转基因结果

实验批次注射的 P0F1 代滚动表型个体转基因 F2 代比例F2 代后平均遗传比例
1602(品系 1) 0%
(品系 2) 13%		NA
13%±10
2401*(品系 3) 0%NA
34000%NA
4401(品系 4) 0%NA
52000%NA
6401(品系 5) 26%22%±10

* 未穿越的雄性滚轴果蝇；NA：不适用

表3. 注射含有经Sal I酶切的Ppa-egl-4p::gfp、经Pst I酶切的pRL3（roller）以及经PstI和SalI双酶切的PS312基因组DNA的PS312菌株的结果。

土壤中线虫的显微镜观察；用于生物体研究的明场（A，B）和荧光（C）成像。
图3. （A）野生型；（B，C）一个稳定的F4 pRL3; Ppa-egl-4p::gfp 转基因株系，显示头部神经元中GFP的表达。

2. RNA干扰的结果

显示不同发育阶段和形态的线虫显微镜图像，用于生物学研究。
图4. 注射RNA的prl-1突变体表现出“滚动”运动的完全敲低。 （A）prl-1滚动型功能获得性突变体tu92。（B）“敲低”后的prl-1突变体表现出正常的野生型体态和运动方式。（C）注射了prl-1（下）的个体体长也比未注射的prl-1突变体（上）更长。（D）注射了prl-1的个体（下）体长也长于野生型PS312（上）。在C. elegans N2品系中进行rol-5 (sqt-1) RNAi敲低时也观察到了体长增加的表型（数据未显示）。

 滚动非滚动
A prl-1 dsRNA (200 ng/μl)1321
B prl-1 dsRNA (1000 ng/μl)916
对照202

表4. Ppa-prl-1 dsRNA 注射结果汇总。(A) [dsRNA] = 200 ng/μl；(B) [dsRNA] = 1000 ng/μl。通过双侧Fisher精确检验，200 ng/μl和1000 ng/μl注射组的P值分别为0.0019和0.041。

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讨论

P. pacificus 种群在全球范围内与多种鳃金龟甲虫密切相关，是介于自由生活线虫与寄生性线虫之间的模式线虫。其优势在于 P. pacificus 作为一种新兴的模式生物，其优势在于遗传图谱与物理图谱的整合，这有助于对通过无偏向前向遗传筛选获得的突变体进行定位作图。即 不仅限于先前在候选基因中已鉴定的基因 秀丽隐杆线虫)6,10。然而， 秀丽隐杆线虫 遗传技术不易转移应用于 P. pacificus 由于器官形态、主要DNA序列以及对异源DNA反应存在显著差异。本研究详细阐述了如何引入先前由Schlager等人描述的稳定报告基因 al5 以及如何通过RNAi敲低相同的显性卷叶突变体。本实验方案不预设使用者具备转基因或RNAi方面的先验知识。 秀丽隐杆线虫.

F1 本研究中显示的转化率（˜2%）与先前使用该方法所得结果相当 prl-1 标记物...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者非常感谢RJ Sommer和X Wang在显微注射方面的协助，以及匿名审稿人提出的宝贵意见。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目SC2GM089602支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMI3000 显微注射镜Leica MicrosystemsDMI3000
显微注射操纵器（直接驱动）Tritech Research, Inc.Narashige BC-3 球形接头
玻璃针拉制仪Tritech Research, Inc.Narashige PC-10
MicroInjector™ 全数字多压力系统Tritech Research, Inc.Narashige MINJ-D
GeneElute™ 哺乳动物基因组DNA小量提取试剂盒Sigma-AldrichG1N70
pJet 克隆连接试剂盒FermentasK1231
GeneJET 质粒小量提取试剂盒FermentasK0502
DNA Clean & Concentrator™Zymo Research Corp.D4005
BLOCK-IT™ RNAi TOPO® 转录试剂盒InvitrogenK3500-01 & K3650-01
Difco™ Noble琼脂Fisher ScientificDF0142-15-2
显微镜盖玻片（厚度1.5 - 0.16至0.19 mm；尺寸：50 × 45 mm）Fisher Scientific12-554-F
玻璃毛细管（带丝）A-M Systems615000
石蜡油（重质）Fisher ScientificO122-1
KH2PO4Fisher ScientificP386-500
Na2HPO4Fisher ScientificAC20651-5000
NaClFisher ScientificBP3581
MgSO4Fisher ScientificM80-500

参考文献

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标签

RNAi RNA DNA F1

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