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通过显微注射实现嗜尸线虫Pristionchus pacificus的RNAi介导基因敲低与转基因

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DOI：

10.3791/3270

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2011年10月16日

 , 
1Biology Department, California State University

本文内容

摘要

在模式生物中，转基因技术可操控基因功能，而RNA干扰（RNAi）则可降低特定mRNA转录水平1-2。本实验方案旨在介绍将稳定遗传的DNA和瞬时双链RNA导入嗜尸线虫Pristionchus pacificus所需的技术，以用于进化生物学、发育生物学和行为生物学的研究。

摘要

尽管新兴模式生物的全基因组测序成本正日益降低，但由于这些生物特有的解剖结构和分子细胞生物学特性，利用RNA干扰和稳定转基因技术进行更深入的基因功能与表达分析在许多物种中仍然受限。例如，在冠群以外 秀丽隐杆线虫 包括 秀丽隐杆线虫 elegans3，可在非秀丽隐杆线虫 该物种丰富的门类（Nematoda）中尚未见报道，仅有一种例外 粪类圆线虫 stercoralis4 和 Pristionchus pacificus5. 为了促进不断拓展的作用 P. pacificus 在发育、进化和行为研究中6-7，本文介绍了利用显微注射技术制备转基因动物以及通过RNAi实现基因敲低的现有方法。如同性腺的 秀丽隐杆线虫 以及其他大多数线虫一样，其生殖腺的 P. pacificus 是合胞体结构，当通过直接显微注射递送时，能够将DNA和RNA整合到卵母细胞中。与 秀丽隐杆线虫 然而，外源基因的稳定遗传和体细胞表达在 P. pacificus 需要加入经与目标转基因和共注射标记物末端互补的内切酶消化的自身基因组DNA5加入载体基因组DNA与转基因表达所需条件类似 粪类圆线虫4 以及生殖细胞中的 秀丽隐杆线虫。然而，目前尚不清楚对动物自身基因组DNA的特定需求是否因为 P. pacificus 胞体在沉默非复杂多拷贝基因或染色体外阵列方面效率非常高 P. pacificus 需要基因组序列以在有丝分裂期间正确组装动粒。在雌雄同体中，双臂型（双子宫型）性腺的腹侧迁移进一步增加了对单条线虫个体的两个性腺进行显微注射的难度。8我们还展示了利用显微注射技术敲低一种显性突变基因（roller，tu92) 通过向性腺注射双链RNA（dsRNA）以获得非滚动型F代1 子代。与 秀丽隐杆线虫，但与大多数其他线虫一样， P. pacificus PS312 无法通过饲喂或浸泡方式接受系统性 RNAi，因此必须通过显微注射将 dsRNA 注入合胞体性生殖腺。在本研究中，我们旨在描述实现转化所需的显微注射过程 Ppa-egl-4 启动子::GFP融合报告基因与敲降显性滚筒表型 prl-1 (tu92) 在一种视觉信息丰富的方案中的突变体。

方案

1. 转基因：DNA 制备

  1. 显性共注射标记 pRL3 [Ppa-prl-1(tu92)]
    的 pRL3 质粒是一种显性的共注射标记，用于通过视觉识别成功转化事件。该质粒编码一种显性突变等位基因（tu92的 Ppa-prl-1 与基因密切相关 sqt-1 胶原蛋白基因在 秀丽隐杆线虫 并将野生型正弦波状运动转变为沿虫体轴的顺时针扭曲运动1,5转化后的动物与常用的显性筛选标记非常相似 rol-6 (su1006) 使用于 C. elegans 20年来。
  2. 靶向报告转基因 Ppa-egl-4p::gfp
    目的基因可在转录水平或翻译水平上与GFP编码序列相连9在本研究中， Ppa-egl-4启动子::gfp (egl-4，cGMP依赖性蛋白激酶）用于检测翻译起始位点上游2 kb的片段是否能够驱动GFP表达 P. pacificus PS312。该GFP载体包含一个经过修饰的GFP编码区
    内含子与多功能性 Ppa-rpl-23 3' UTR 终止子5 由 Xiaoyue Wang 和 Ralf J. Sommer（德国图宾根马克斯·普朗克研究所，欧盟）惠赠提供。
  3. 基因组DNA：PS312
    野生型的添加 P. pacificus PS312 基因组 DNA 对于获得稳定的转基因遗传是必需的，特别是来自转基因 F 代的遗传1 动物与其 F2 后代5目前尚不确定基因组DNA是否与两个转基因（共注射标记）形成复杂的染外染色体阵列。 pRL-3 以及 Ppa-egl-4p::gfp 报告基因) 与在稳定 F 中观察到的相似2 转基因品系在 秀丽隐杆线虫3然而，基因组DNA与转基因必须具有相同的黏性末端这一要求，强烈提示会形成宿主细胞可识别的复杂染色体外阵列，以实现DNA的正确传递（基因组DNA使用Sigma G1N10试剂盒制备）。
  4. DNA 消化
    限制性内切酶用于使 Ppa-egl-4p::gfp 载体DNA，并产生与共注射标记物相容的黏性末端 pRL3 以及 PS312 gDNA。通过轻敲混匀，切勿涡旋。在 37℃ 下孵育一小时°C.
pRL34 μg
10x缓冲液10 μl
PstI (10 U/μl)4 μl
dH2O~
总量：100 μL
Ppa-egl-4p::gfp4 μg
10x缓冲液10 μl
SalI (10 U/μl)4 μl
dH2O~
总量：100 μl
gDNA PS31210 μg
10x缓冲液10 μl
Pst I 和 Sal I (10 U/μl)8 μl
dH2O~
总量：100 μl

表1. 限制性内切酶消化反应体系。

  1. DNA 沉淀与制备
    1. 向消化产物中加入 1:10 体积的醋酸钠（3 M NaCOOCH3，pH 5.2）和 2.5 倍体积的 100% 乙醇；加入 20 ng/μl 的糖原以便更易观察沉淀。
    2. 在 4°C 下以 14,000 rpm 离心 15 分钟。
    3. 将离心管缓慢倒置，轻轻倾去上清液，然后轻敲滤纸以去除残留液体，确保沉淀牢固地附着在管底角落且无乙醇残留。
    4. 加入 1 ml 的 75% 乙醇。
    5. 立即在 4°C 下以 14,000 rpm 离心 5 分钟。
    6. 将离心管缓慢倒置，倾去上清液，然后轻敲滤纸，确保沉淀牢固地附着在管底角落且无乙醇残留。
    7. 在真空离心浓缩仪中，于 25–30°C、14,000 rpm 下干燥沉淀 5 分钟，直至完全干燥且无乙醇残留。
    8. 加入 30 μl TE 缓冲液或无菌 dH2O，4°C 过夜孵育，随后短暂涡旋混匀。
    9. 表 2 描述了如何从每种纯化的 DNA 制备用于显微注射的混合物。
    10. 储存于 -20°C。使用前将注射混合物解冻，并在 14,000 rpm 下离心 5 分钟，以去除可能堵塞注射针头的杂质颗粒。
遗传物质浓度
Ppa-egl-4p::gfp (SalI)>5 ng/μl (0.1-10 ng/μl)
pRL3 (PstI)>1 ng/μl
gDNA PS312 (PstI + SalI)>60 ng/μl
dH2O~
总计：30 μl

表2. Ppa-prl-1 注射混合物

2. RNA干扰：体外双链RNA合成

  1. 采用PCR扩增目的基因。使用引物RHL091 5'- agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3'（BamHI位点）和RHL092 5'- tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3'（PstI位点）从含有pRL3载体的Ppa-prl-1(tu92)等位基因中扩增一段464 bp的基因组片段（位置3-466）。
  2. 用BamHI和PstI酶切PCR产物。
  3. 将该片段连接至经BamHI/PstI双酶切的pL4440 RNAi饲喂载体2中。
  4. 将插入载体转化至感受态细胞，并在含氨苄青霉素的LB培养基平板（50 μg/ml）上培养。
  5. 使用T7引物通过PCR筛选成功插入的载体。
  6. 利用含有prl-1基因且两侧为T7启动子的PCR产物，使用BLOCK-IT RNAi合成试剂盒（Invitrogen）制备双链RNA（dsRNA）。
  7. 用于注射的dsRNA浓度最好 >200 ng/μl，最高可达1 μg/μl。
  8. 储存于-20°C。注射前将混合物解冻后，在14,000 rpm下离心5分钟，以去除可能堵塞注射针头的碎片颗粒。

3. 显微注射：转基因和/或dsRNA注射方案

  1. 注射针头
    1. 设置Narishige针头拉制仪（型号：PC-10）的温度：
      1. 将底部旋钮转至“No.2 Heater”。
      2. 调节“No.2 Heater Adj.”旋钮，使面板显示温度为55.0–60.0°C，以制备不同长度的锥形针尖。
    2. 将底部旋钮转回“Step 1”（一步拉制针头）。
    3. 将针毛细管装入腔室，并确保固定牢固。
    4. 按下“Start”按钮（红色按钮），启动拉针程序，利用全部配重将针头拉制（此过程将在相反方向生成两根相同的针头）。
    5. 从腔室中取出针头，并将其存放于塑料培养皿中，用培乐多（Play-Doh）固定以防止灰尘积聚在针头上。
  2. 制备载样垫
    1. 在1.5 ml离心管中，加入0.02 g Noble琼脂和1 ml H2O，配制成2% Noble琼脂溶液。琼脂溶液可在4°C保存长达一年。
    2. 充分混匀后，置于设定温度＞88°C的加热块中熔化琼脂。
    3. 使用1 ml微量移液器，将一滴液态2% Noble琼脂置于载玻片（Fisher, 12-544-F）中央。
    4. 将另一张载玻片盖在液滴上，压平琼脂。
    5. 重复“滴加步骤”，直至形成五层载玻片厚度的琼脂层。
    6. 通过滑动方式逐张移除上层载玻片。
    7. 将压平的琼脂垫连同载玻片置于70°C真空烘箱中干燥4小时至过夜（或在室温下过夜）。
    8. 制备多个注射垫，以供后续使用。
  3. 对雌雄同体性腺进行显微注射

figure-protocol-1
图1. P. pacificus 解剖结构示意图。 透明的有核细胞为雌性生殖细胞（卵母细胞），灰色阴影部分为肠道。图中仅显示一个前端远端性腺，但请注意两个远端性腺在体中部背侧相互交叉。

figure-protocol-2
图2. 显微注射图像。 （A）注射针尖与毛细管拉制后最右侧线条对焦。轻轻将针尖接触该边缘，针尖应断裂但仍保持尖锐。 （B）第一次注射时，针头插入肠道弯曲上方的上部性腺。 （C）第二次注射时，针头插入肠道弯曲下方的下部性腺。

    1. 确保相差显微镜和微分干涉相衬（DIC）剪切设置处于观察雌雄同体性腺的最佳状态。
    2. 将 1.0–2.0 μl 注射混合物吸入拉制好的毛细玻璃针中。
    3. 将针头装入显微注射操纵器；氮气罐的压力表应调节至理想条件（0.5–1 秒内 10–20 psi）。
    4. 通过轻轻触碰载玻片上一滴油中的细拉毛细管边缘来折断针尖（图 2A）。
      1. 针尖断裂载玻片：将拉制毛细管最细的部分置于载玻片上的油滴中
    5. 针尖折断后，可将其置于待机位置，同时挑选线虫移至垫上（P. pacificus 在干燥死亡前仅有约 5 分钟的注射窗口期）。
    6. 取一个布满 J4 至年轻成虫期线虫的培养皿，加入足量重石蜡油，刚好覆盖 OP50 细菌菌苔中的所有线虫。
    7. 挑选一条线虫并将其放置在注射垫上。
    8. 将带有线虫的载玻片置于显微镜下；调整线虫位置，使其性腺朝向针头，而阴门远离针头（图 2B、2C）。
    9. 将针头下降至显微镜视野中的合适位置。
    10. 调整上部性腺与针头处于同一焦平面（图 2B）。
    11. 轻柔地刺入线虫并注入混合物；若观察到卵母细胞向远端移动，则表明注射成功（为优化转基因或 dsRNA 的递送效果，注射时应看到性腺内出现扩张波，持续传播至远端）。
    12. 重新定位针头以注射下部性腺并重复操作；但由于该性腺位于肠道下方，卵母细胞的扩散不易观察，因此更难实现有效注射（图 2C）。
    13. 注射后，线虫外观正常表明注射成功；不应出现性腺损伤（如从阴门突出或陷入体腔内）。
    14. 将针头移回待机位置。
    15. 准备回收线虫。
    16. 在已注射线虫所在的垫上加入一滴 M9 缓冲液（0.5 μl）。
    17. 用挑虫针蘸取少量 OP50 细菌，轻触线虫使其粘附；我们不使用口吸移液。
    18. 将线虫转移至接种有 50 μl OP50 菌斑的培养皿中，每皿可回收 2–4 条线虫。
  2. 注射后储存与转基因筛选
    1. 将注射后的线虫（P0）在 20°C 下培养约 4 天，使其产卵并发育出 F1 代。
    2. 在第 4 天筛选具有目标表型的线虫（为筛选转基因个体，寻找表达 Ppa-prl-1 显性标记的滚动表型个体）。
    3. 挑选单个独立的、具有目标表型的 F1 个体转移至新的接种培养皿，并在 25°C 下培养；此温度有助于从 F1 代建立稳定的转基因品系。
    4. 从各个独立的 F1 品系中获得单个 F2 代。各独立 F2 品系的转基因传递率相似。我们通常每只转化成功的 F1 个体可获得 >15 个 F2 品系。
    5. 后续世代均在 25°C 下保存。
    6. 滚动表型的传递率通常在 F4 代后趋于稳定，因此此时需测定每个独立品系中目标转基因（Ppa-egl-4p::gfp）的表达水平。GFP 表达水平可能与显性滚动表型的外显率程度不一致。
  3. 注射后储存与 RNAi 表型筛选
    1. 将注射后的线虫（P0）在 20°C 下培养约 4 天，使其产卵并发育出 F1 代。
    2. 在第 4 天筛选 F1 代线虫的目标表型（为筛选 RNAi 沉默表型，寻找与目标基因功能丧失相关的完全外显表型；在本案例中即 Ppa-prl-1 表型的缺失）。
    3. 根据我们的经验，非滚动表型的 RNAi 沉默效应在 >97% 的 F2 代中会消失。

4. 代表性结果：

1. 转基因结果

实验批次注射的 P0F1 转辊个体数F2 转基因比例F2 后代平均遗传率
1602(品系 1) 0%
(品系 2) 13%		NA
13%±10
2401*(品系 3) 0%NA
34000%NA
4401(品系 4) 0%NA
52000%NA
6401(品系 5) 26%22%±10

* 未交配的雄性滚轴果蝇；NA：不适用

表3. 注射 PS312 与 Ppa-egl-4p::gfp（经 Sal I 消化）、pRL3（roller）（经 Pst I 消化）以及 gDNA PS312（经 PstI 和 SalI 消化）的结果。

figure-protocol-3
图3. (A) 野生型 (B, C) 一个稳定的 F4 pRL3; Ppa-egl-4p::gfp 转基因株系，显示头部神经元中GFP的表达。

2. RNA干扰结果

figure-protocol-4
图 4. 注射 RNA 的 prl-1 突变体表现出“滚动”运动的完全敲低。 （A）prl-1 增强功能突变体 tu92。（B）“被敲低”的 prl-1 突变体表现出正常的野生型体态和运动方式。（C）注射 prl-1（下）的个体体长也比 prl-1 突变体（上）更长。（D）注射 prl-1（下）的个体体长也长于野生型 PS312（上）。在 C. elegans N2 的 rol-5 (sqt-1) RNAi 敲低实验中也观察到了体长增加的表型（数据未显示）。

 滚动非滚动
A prl-1 dsRNA (200 ng/μl)1321
B prl-1 dsRNA (1000 ng/μl)916
对照202

表4. Ppa-prl-1 dsRNA 注射结果汇总。(A) [dsRNA] = 200 ng/μl；(B) [dsRNA] = 1000 ng/μl。根据双尾Fisher精确检验，200 ng/μl 和 1000 ng/μl 注射组的P值分别为 0.0019 和 0.041。

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讨论

P. pacificus 种群在全球范围内与多种鳃金龟甲虫密切相关，是介于自由生活线虫与寄生性线虫之间的模式线虫。其优势在于 P. pacificus 作为一种新兴的模式生物，其优势在于遗传图谱与物理图谱的整合，这有助于对通过无偏向前向遗传筛选获得的突变体进行定位作图。即 不仅限于先前在候选基因中已鉴定的基因 秀丽隐杆线虫)6,10。然而， 秀丽隐杆线虫 遗传技术不易转移应用于 P. pacificus 由于器官形态、主要DNA序列以及对异源DNA反应存在显著差异。本研究详细阐述了如何引入先前由Schlager等人描述的稳定报告基因 al5 以及如何通过RNAi敲低相同的显性卷叶突变体。本实验方案不预设使用者具备转基因或RNAi方面的先验知识。 秀丽隐杆线虫.

F1 本研究中显示的转化率（˜2%）与先前使用该方法所得结果相当 prl-1 标记物...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者非常感谢RJ Sommer和X Wang在显微注射方面的协助，以及匿名审稿人提出的宝贵意见。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目SC2GM089602支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMI3000 显微注射镜Leica MicrosystemsDMI3000
显微注射操纵器（直接驱动）Tritech Research, Inc.Narashige BC-3 球形接头
玻璃针拉制仪Tritech Research, Inc.Narashige PC-10
MicroInjector™ 全数字多压力系统Tritech Research, Inc.Narashige MINJ-D
GeneElute™ 哺乳动物基因组DNA小量提取试剂盒Sigma-AldrichG1N70
pJet 克隆连接试剂盒FermentasK1231
GeneJET 质粒小量提取试剂盒FermentasK0502
DNA Clean & Concentrator™Zymo Research Corp.D4005
BLOCK-IT™ RNAi TOPO® 转录试剂盒InvitrogenK3500-01 & K3650-01
Difco™ Noble琼脂Fisher ScientificDF0142-15-2
显微镜盖玻片（厚度1.5 - 0.16至0.19 mm；尺寸：50 × 45 mm）Fisher Scientific12-554-F
玻璃毛细管（带丝）A-M Systems615000
石蜡油（重质）Fisher ScientificO122-1
KH2PO4Fisher ScientificP386-500
Na2HPO4Fisher ScientificAC20651-5000
NaClFisher ScientificBP3581
MgSO4Fisher ScientificM80-500

参考文献

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标签

RNAi RNA DNA F1

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