方法文章

通过显微注射实现嗜尸线虫Pristionchus pacificus的RNAi介导基因敲低与转基因

16K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/3270

⸱

2011年10月16日

 , 
1Biology Department, California State University

本文内容

摘要

在模式生物中，转基因技术可操控基因功能，而RNA干扰（RNAi）则可降低特定mRNA转录水平1-2。本实验方案旨在介绍将稳定遗传的DNA和瞬时双链RNA导入嗜尸线虫Pristionchus pacificus所需的技术，以用于进化生物学、发育生物学和行为生物学的研究。

摘要

尽管新兴模式生物的全基因组测序成本正日益降低，但由于这些生物特有的解剖结构和分子细胞生物学特性，利用RNA干扰和稳定转基因技术进行更深入的基因功能与表达分析在许多物种中仍然受限。例如，在冠群以外 秀丽隐杆线虫 包括 秀丽隐杆线虫 elegans3，可在非秀丽隐杆线虫 该物种丰富的门类（Nematoda）中尚未见报道，仅有一种例外 粪类圆线虫 stercoralis4 和 Pristionchus pacificus5. 为了促进不断拓展的作用 P. pacificus 在发育、进化和行为研究中6-7，本文介绍了利用显微注射技术制备转基因动物以及通过RNAi实现基因敲低的现有方法。如同性腺的 秀丽隐杆线虫 以及其他大多数线虫一样，其生殖腺的 P. pacificus 是合胞体结构，当通过直接显微注射递送时，能够将DNA和RNA整合到卵母细胞中。与 秀丽隐杆线虫 然而，外源基因的稳定遗传和体细胞表达在 P. pacificus 需要加入经与目标转基因和共注射标记物末端互补的内切酶消化的自身基因组DNA5加入载体基因组DNA与转基因表达所需条件类似 粪类圆线虫4 以及生殖细胞中的 秀丽隐杆线虫。然而，目前尚不清楚对动物自身基因组DNA的特定需求是否因为 P. pacificus 胞体在沉默非复杂多拷贝基因或染色体外阵列方面效率非常高 P. pacificus 需要基因组序列以在有丝分裂期间正确组装动粒。在雌雄同体中，双臂型（双子宫型）性腺的腹侧迁移进一步增加了对单条线虫个体的两个性腺进行显微注射的难度。8我们还展示了利用显微注射技术敲低一种显性突变基因（roller，tu92) 通过向性腺注射双链RNA（dsRNA）以获得非滚动型F代1 子代。与 秀丽隐杆线虫，但与大多数其他线虫一样， P. pacificus PS312 无法通过饲喂或浸泡方式接受系统性 RNAi，因此必须通过显微注射将 dsRNA 注入合胞体性生殖腺。在本研究中，我们旨在描述实现转化所需的显微注射过程 Ppa-egl-4 启动子::GFP融合报告基因与敲降显性滚筒表型 prl-1 (tu92) 在一种视觉信息丰富的方案中的突变体。

方案

1. 转基因：DNA 制备

  1. 显性共注射标记 pRL3 [Ppa-prl-1(tu92)]
    的 pRL3 质粒是一种显性的共注射标记，用于通过视觉识别成功转化事件。该质粒编码一种显性突变等位基因（tu92的 Ppa-prl-1 与基因密切相关 sqt-1 胶原蛋白基因在 秀丽隐杆线虫 并将野生型正弦波状运动转变为沿虫体轴的顺时针扭曲运动1,5转化后的动物与常用的显性筛选标记非常相似 rol-6 (su1006) 使用于 C. elegans 20年来。
  2. 靶向报告转基因 Ppa-egl-4p::gfp
    目的基因可在转录水平或翻译水平上与GFP编码序列相连9在本研究中， Ppa-egl-4启动子::gfp (egl-4，cGMP依赖性蛋白激酶）用于检测翻译起始位点上游2 kb的片段是否能够驱动GFP表达 P. pacificus PS312。该GFP载体包含一个经过修饰的GFP编码区
    内含子与多功能性 Ppa-rpl-23 3' UTR 终止子5 由 Xiaoyue Wang 和 Ralf J. Sommer（德国图宾根马克斯·普朗克研究所....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

P. pacificus 种群在全球范围内与多种鳃金龟甲虫密切相关，是介于自由生活线虫与寄生性线虫之间的模式线虫。其优势在于 P. pacificus 作为一种新兴的模式生物，其优势在于遗传图谱与物理图谱的整合，这有助于对通过无偏向前向遗传筛选获得的突变体进行定位作图。即 不仅限于先前在候选基因中已鉴定的基因 秀丽隐杆线虫)6,10。然而， 秀丽隐杆线虫 遗传技术不易转移应用于 P. pacificus 由于器官形态、主要DNA序列以及对异源DNA反应存在显著差异。本研究详细阐述了如何引入先前由Schlager等人描述的稳定报告基因 al5 以及如何通过RNAi敲低相同的显性卷叶突变体。本实验方案不预设使用者具备转基因或RNAi方面的先验知识。 秀丽隐杆线虫.

F1 本研究中显示的转化率（˜2%）与先前使用该方法所得结果相当 prl-1 标记物.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者非常感谢RJ Sommer和X Wang在显微注射方面的协助，以及匿名审稿人提出的宝贵意见。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目SC2GM089602支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMI3000 显微注射镜Leica MicrosystemsDMI3000
显微注射操纵器（直接驱动）Tritech Research, Inc.Narashige BC-3 球形接头
玻璃针拉制仪Tritech Research, Inc.Narashige PC-10
MicroInjector™ 全数字多压力系统Tritech Research, Inc.Narashige MINJ-D
GeneElute™ 哺乳动物基因组DNA小量提取试剂盒Sigma-AldrichG1N70
pJet 克隆连接试剂盒FermentasK1231
GeneJET 质粒小量提取试剂盒FermentasK0502
DNA Clean & Concentrator™Zymo Research Corp.D4005
BLOCK-IT™ RNAi TOPO® 转录试剂盒InvitrogenK3500-01 & K3650-01
Difco™ Noble琼脂Fisher ScientificDF0142-15-2
显微镜盖玻片（厚度1.5 - 0.16至0.19 mm；尺寸：50 × 45 mm）Fisher Scientific12-554-F
玻璃毛细管（带丝）A-M Systems615000
石蜡油（重质）Fisher ScientificO122-1
KH2PO4Fisher ScientificP386-500
Na2HPO4Fisher ScientificAC20651-5000
NaClFisher ScientificBP3581
MgSO4Fisher ScientificM80-500

参考文献

  1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Ahringer, J. Reverse Genetics. Wormbook. , (2006).
  3. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

RNAi RNA DNA F1

相关文章