通过活体视频显微镜追踪中性粒细胞在组织内的管腔内爬行、跨内皮迁移及趋化运动

摘要

我们描述了一种用于在中性粒细胞趋化因子刺激下，中性粒细胞募集过程中动态测量中性粒细胞与内皮细胞相互作用的明场活体显微镜技术方案。 体内通过延时视频显微摄影技术在小鼠提睾肌组织中可视化中性粒细胞管腔内爬行、跨内皮迁移及趋化运动，并使用ImageJ软件进行追踪分析。

摘要

白细胞从血液循环募集到炎症组织是炎症反应中一个关键而复杂的过程^1,2在炎症组织的毛细血管后微静脉中，白细胞首先在微静脉壁管腔表面发生黏附并滚动。滚动的白细胞在接收到微静脉表面趋化因子或其他趋化因子信号后，停止滚动，与内皮细胞牢固黏附。许多黏附的白细胞从初始黏附部位迁移至内皮细胞连接处的血管外渗位点，该过程称为管腔内爬行。³在爬行之后，白细胞穿过内皮（跨内皮迁移），并向趋化因子源方向在血管外组织中迁移（趋化作用）。⁴活体显微成像技术是观察白细胞与内皮细胞相互作用的有力工具 体内 揭示白细胞募集的细胞与分子机制^2,5在本报告中，我们全面描述了使用明场活体显微镜观察和确定中性粒细胞在小鼠提睾肌中响应中性粒细胞趋化因子梯度时招募过程的详细步骤。为诱导中性粒细胞招募，将一小块琼脂糖凝胶（约1毫米）³ 大小）含有中性粒细胞趋化因子MIP-2（CXCL2，一种CXC趋化因子）或WKYMVm（Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met，一种细菌肽的合成类似物）的琼脂糖凝胶被放置在靠近所观察微静脉的肌肉组织上。通过延时视频显微摄影结合计算机软件ImageJ，可对中性粒细胞在内皮腔内的爬行、跨内皮迁移以及在组织中的迁移和趋化行为进行可视化观察与追踪。该方案可实现对多种中性粒细胞募集参数的可靠且定量的分析，包括腔内爬行速度、跨内皮迁移时间、脱离时间、迁移速度、趋化速度及趋化指数等。我们证明，采用此方案可稳定测定上述中性粒细胞募集参数，并方便地追踪单个细胞的运动过程 体内.

方案

1. 制备琼脂糖凝胶中的趋化因子

1. 用移液器将10 mL的2×PBS加入50 mL锥形管中，并将该管放入盛有热水的烧杯中预热。
2. 用移液器取10 mL蒸馏水，加入0.4 g琼脂糖粉末至另一只50 mL锥形管中（管盖稍松），在微波炉中加热至刚刚沸腾（700瓦微波炉中约加热1分钟）。
3. 将预热的2×PBS加入琼脂糖溶液管中，轻轻旋转混匀，并将混合液置于热水烧杯中保温。
4. 用微量移液器将趋化因子溶液（例如：10 µL含0.5 µg的CXC趋化因子MIP-2，或12 µL含1 mM的WKYMVm）加入含有3 µL印度墨水的1.5 mL离心管盖中，用微量移液器反复吸打充分混匀（避免产生气泡）。
5. 剪去200 µL移液枪头的尖端，用微量移液器将110 µL 42°C的琼脂糖溶液加入管盖中，并立即用另一枪头充分混匀（避免产生气泡）。
6. 将含有趋化因子的凝胶在+4°C保存。

2. 活体显微镜观察用提睾肌的制备（图1）

1. 通过腹腔注射混合物麻醉成年雄性小鼠，混合物包含 10 mg/kg 赛拉嗪和 200 mg/kg 盐酸氯胺酮。
2. 使用电动剃须刀剃除右侧颈外静脉区域及阴囊前部的毛发。麻醉后，需特别注意并妥善护理麻醉状态下的小鼠。可使用加热灯防止小鼠体温过低。小鼠应无疼痛反射。
3. 作一横向切口，使用充满含 100 U/mL 肝素生理盐水的 PE-10 导管寻找并插管颈静脉。颈静脉插管用于必要时追加麻醉剂和其他药物的给药。
4. 用脐带绑带固定小鼠后肢，使小鼠仰卧于自制的提睾肌固定板上（图 1）。
5. 将固定板连接至 37°C 水循环系统，以保持提睾肌及小鼠体温。

注意：所有从 2.6 到 2.14 的步骤都必须极其轻柔地进行⁵。

6. 切开阴囊皮肤以暴露左侧提睾肌。仔细将肌肉从相关筋膜中分离出来。
7. 使用蠕动泵，以37°C预温的碳酸氢盐缓冲生理盐水（131.9 mM NaCl，4.7 mM KCl，1.2 mM MgSO₄，20 mM NaHCO₃，pH 7.4）灌流提睾肌。
8. 用4−0缝线结扎提睾肌远端，将其固定在提睾肌观察板的透明观察玻璃基座上。
9. 沿纵轴电灼提睾肌。使用4−0缝线将肌肉展平，并沿基座边缘固定。将睾丸和附睾从下方肌肉组织分离，并推入腹腔内。
10. 以约0.6 ml/min的速度，用37°C预温的灌流缓冲液持续灌流肌肉，并用22×22 mm的玻璃盖玻片覆盖暴露的肌肉组织。
11. 将提睾肌观察板置于显微镜载物台上，在显微镜下观察肌肉组织，选择一条合适的后微静脉（选择直且无分支、剪切率正常、直径在25−40 µm之间的静脉），并调整摄像机，使该静脉在电视监视器左侧或右侧垂直显示。
12. 平衡30分钟后，使用录像机记录所选后微静脉5分钟的视频图像，作为基线对照数据。
13. 停止灌流，并移除肌肉上的盖玻片。
14. 在预先选定的区域，于提睾肌表面放置一块约1 mm³大小、含有趋化因子的凝胶，该区域应距离观察的后微静脉350 µm且与其平行；加盖盖玻片以固定凝胶，并以极慢速度（≤10 µl/min）灌流肌肉组织，使凝胶缓慢释放趋化因子，形成稳定的浓度梯度。
15. 加入含趋化因子的凝胶后，连续录像90分钟。在录像过程中，持续调整并保持显微镜焦点，观察静脉内及肌肉组织中黏附、爬行、跨内皮迁移和趋化运动的白细胞。
16. 实验结束后，将视频文件导入计算机进行分析。

3. 使用 ImageJ 进行细胞追踪

1. 在计算机上提取视频并将其转换为 AVI 格式（例如，使用免费计算机软件 bitRipper 将 DVD 视频转换为 AVI 文件）。
2. 使用视频编辑软件生成延时视频。例如，使用 Windows Movie Maker 从原始实时视频中制作延时视频（以 30 帧/秒速率生成 1/512 或 1/1024 速度的延时视频）。将未压缩的延时视频转换并保存为 DV-AVI 格式。
3. 在相同的显微镜设置下拍摄校准微尺的图像， 将图像导入计算机，使用 ImageJ 打开图像。在 ImageJ 中，总像素数显示在屏幕左上角（例如，720）×480 像素）。测量屏幕在 X 轴和 Y 轴上的尺寸（例如，200×150 µ微米）。据此计算每微米的像素数量 µ米（例如，x = 720/200 = 3.6 像素/µm，且 y = 480/150 = 3.2 像素/µm
4. 再次打开 ImageJ，点击“文件−导入−使用 Quicktime 电影插件”，选择待分析的视频，然后在“QT 电影打开器”界面中点击“确定”。
5. 单击“Plugins−Manual Tracking”以追踪细胞。在开始追踪前，先在底部字段中填写相关信息。简要步骤如下，
   1. 时间间隔（秒）= 倍数-延时/30（例如，1020× 时间间隔为 1020/30 = 34 秒/帧。
   2. x/y 校准 = 该 µ使用微米尺图像的校准进行像素尺寸测量
   3. z轴校准 = 0（由于小鼠提睾肌是一层极薄的组织，在明场透射照明下，细胞爬行与迁移近似为二维运动）。
   4. 中心定位搜索方块大小 = 1。
   5. 点大小/线宽/字体大小：可根据需要进行调整。
6. 选择一个稳定且清晰的点作为参考点。该参考点可以是实验全程中保持不变且清晰可见的任意微小结构点。点击“Add Track”以追踪从第一帧到最后帧的参考点，然后点击“End Track”。数据将自动显示在结果表格中。
7. 逐一追踪爬行和迁移的中性粒细胞：点击“添加轨迹”以追踪细胞从在组织中出现到每一帧中消失的过程，然后点击“结束轨迹”以完成并保存结果至 Microsoft Excel。

4. 中性粒细胞募集参数的分析

1. 在 Microsoft Excel 中打开结果文件，并分析数据（将参考点的变化纳入分析）。
2. 管腔内爬行
   1. 爬行距离：细胞从初始黏附位点到最佳跨内皮迁移位点在管腔内爬行的总距离（µm）。
   2. 爬行速度：爬行距离/时间（µm/min）。
3. 跨内皮迁移
   1. 迁移时间：从细胞开始跨内皮迁移，至整个细胞体刚好移出微静脉且管腔内不可见细胞体为止的时间（min 或 sec）。
   2. 脱离时间：从整个细胞体刚好移出微静脉（跨内皮迁移刚完成）至细胞与微静脉失去接触（尾部回缩）的时间点（min 或 sec）。
4. 组织中的趋化迁移
   1. 迁移距离：细胞在组织中从迁移起点到终点所移动距离的总和（µm）。
   2. 迁移速度：组织中迁移距离/时间（µm/min）。
   3. 趋化距离：细胞在组织中沿 x 轴方向迁移距离的总和（µm）。
   4. 趋化速度：趋化距离/时间（µm/min）。
   5. 趋化指数：趋化距离与组织中迁移距离的比值。

5. 代表性结果：

尽管明场活体显微镜常用于研究白细胞与内皮细胞的相互作用，且不一定特指中性粒细胞，但我们通过组织学分析证实，在经中性粒细胞趋化因子处理的小鼠胫骨前肌中，超过95%的募集细胞确为中性粒细胞。本报告中，我们采用中性粒细胞特异性趋化因子，展示了追踪中性粒细胞募集过程的实验步骤 体内具体而言，我们描述了一种在麻醉小鼠的提睾肌组织中，利用延时活体视频显微镜和ImageJ软件追踪中性粒细胞管腔内爬行、跨内皮迁移及趋化运动的实验方案。将含有趋化因子的琼脂糖凝胶置于提睾肌上，可缓慢释放趋化因子，从而在组织中建立趋化因子浓度梯度。中性粒细胞趋化因子可诱导小鼠提睾肌后微静脉中中性粒细胞与内皮细胞之间的相互作用。整个实验过程通过直立式明场活体显微镜观察，彩色摄像机将图像投射至电视监视器，并由录像机记录。我们检测了在含有中性粒细胞趋化因子MIP-2和WKYMVm的琼脂糖凝胶刺激下，中性粒细胞在管腔内的爬行、跨内皮迁移以及在肌肉组织中的迁移和趋化行为（图2）。我们发现，MIP-2（在0.5 µM）和 WKYMVm（0.1 mM）诱导中性粒细胞在管腔内爬行的速度相似，中性粒细胞跨内皮迁移及从微静脉脱离的时间相近，在肌肉组织中的迁移速度几乎相同，且中性粒细胞趋化指数也相似P > 0.05，Student t 测试）。

图1. 活体显微镜系统的示意图。小鼠提睾肌被置于显微镜载物台上的提睾肌板透明观察平台上，并用37°C预温的碳酸氢盐缓冲盐溶液进行灌流。直立式显微镜连接一台CCD彩色视频摄像机，用于明场活体显微成像。另有一台黑白深冷CCD数字相机连接至显微镜端口，用于荧光活体显微成像，其图像由计算机直接处理。

图2. 明场活体显微镜下中性粒细胞募集参数。 通过在紧邻毛细血管后微静脉350 µm处放置的琼脂糖凝胶中逐步释放中性粒细胞趋化因子MIP-2或WKYMVm，诱导中性粒细胞募集。实验的实时视频记录经处理后，使用ImageJ分析延时视频数据。在C57BL/6小鼠（n = 3）的提睾肌上施用MIP-2或WKYMVm琼脂糖凝胶后，测定中性粒细胞管腔内爬行（A）、跨内皮迁移时间与脱离时间（B）、组织中的迁移速度与趋化速度（C），以及提睾肌中的趋化指数（D）（追踪细胞数：MIP-2组分别为22（A和B）和27（C和D），WKYMVm组分别为26（A和B）和44（C和D））。

讨论

活体显微镜是揭示炎症过程中白细胞募集的细胞和分子机制的关键工具。在提睾肌和肠系膜等透明组织的微血管中，对白细胞与内皮细胞相互作用进行定量可视化观察，仍是该技术应用的金标准^1,5。传统的明场活体显微镜具有多种独特的技术优势，且在这些组织中发现的白细胞募集机制可适用于大多数体内组织in vivo^1,2,6。然而，在肺、肝和脑等其他一些组织中，白细胞募集的机制已被发现与提睾肌和肠系膜中的机制显著不同¹。此外，在透明度较低的组织中，必须使用荧光显微镜进行观察。

与基于荧光的显微技术相比，后者因对活细胞功能造成光损伤而广为人知，而明场活体显微技术在观察活体动物中细胞动态行为需要长时间成像时，更具生理相关性，对细胞和组织的伤害更小（因此产生的假象也更少）⁷。此外，该方法更便捷、成本更低，且无需荧光标记。另一方面，在活体显微技术中使用透射照明成像时，目前市场上可用的商业成像软件无法实现细胞运动的自动追踪。然而，可以在同一台明场活体显微镜上轻松搭建独立的荧光活体成像系统（例如，通过将图像投射至...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙烯管，PE10	Becton Dickinson	427401	内径 0.28mm × 外径 0.61mm
印度墨水	Speedball Art	Super Black	100% 炭黑颜料，不含染料
电灼器	Aaron Medical	AA03
赛拉嗪	Bayer HealthCare, Bayer Inc.	DIN 02169592
盐酸氯胺酮	Bioniche Animal Health Canada, Inc.	DIN 01989529
小鼠重组 MIP-2	R&D Systems	452-M2
WKYMVm	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	072-12
琼脂糖	Invitrogen	15510-027	超纯
肝素	Sigma	H-3393
直立显微镜	Olympus	BX61WI
三芯片彩色视频摄像机	SONY	DXC-990
高清 DVD 视频录像机	LG Electronics Inc.	RH398H-M
电视监视器	LG Electronics Inc.	22LG30
水循环器	Thermo Scientific	HAAKE DC10
蠕动泵	Gilson; Pharmacia	Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3
提睾肌固定板	萨斯喀彻温大学		自制