方法文章

使用 MISSION Target ID 文库进行全基因组 miRNA 靶点筛选

18.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/3303

⸱

2012年4月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sigma-Aldrich

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

靶标ID文库是一种基于质粒的全基因组克隆cDNA集合，用于鉴定miRNA靶标。本文将展示其使用方法与应用。

摘要

靶标ID文库旨在协助发现和鉴定微小RNA（miRNA）的靶标。该靶标ID文库是一种基于质粒的全基因组cDNA文库，将cDNA克隆至双筛选融合蛋白胸苷激酶-杀稻瘟菌素（TKzeo）的3'非翻译区（3'UTR）下游。筛选分为三步：首先筛选稳定转化子，随后引入感兴趣的miRNA，最后筛选含有该miRNA靶标的cDNA。通过测序鉴定被筛选出的cDNA（参见图1-3了解靶标ID文库的工作流程及详细信息）。

为确保对人类转录组的广泛覆盖，采用寡核苷酸-dT引物，以多种人组织和细胞系来源的总RNA混合物为模板，构建了靶标鉴定文库的cDNA。所获得的cDNA片段大小范围为0.5至4 kb，平均长度为1.2 kb，并已克隆至p3΄TKzeo双筛选质粒中（质粒图谱见图4）。该文库所包含的基因靶标信息可在Sigma-Aldrich公司网页查询。Illumina测序结果（表3）显示，该文库覆盖了UCSC RefGene数据库中21,518个独特基因中的16,922个（占79%），其中14,000个基因的测序读数达到10条或以上（占66%）。

方案

1. 使用靶标ID文库进行转染并筛选稳定细胞系

1. Zeocin 杀灭曲线

Zeocin 用于筛选稳定转染的细胞。然而，过量的 Zeocin 会导致大多数细胞类型产生非预期的表型反应。因此，必须进行杀灭曲线分析，以确定最小致死剂量。

  1. 在120 μl培养基中，将1.6 × 104个细胞接种至96孔板的各孔中。
  2. 次日，向相应孔中加入浓度递增的zeocin，范围为50 μg/ml至1 mg/ml。
  3. 每2天观察一次细胞存活情况。
  4. 每3天更换含zeocin的培养基。应选用在目标时间内导致细胞完全死亡的最低筛选试剂浓度，用于该细胞类型及实验。我们的结果表明，500 μg/ml zeocin对A549、HeLa和MCF7细胞最为适宜。

2. 通过核转染进行文库转染及筛选

  1. 选择一种不表达或低表达您感兴趣的 miRNA 的细胞系。在实现 Target ID 文库的稳定表达后，将在 B 部分中引入该 miRNA 以进行靶点筛选。
  2. 培养并扩增细胞。我们每轮文库转染使用 2 × 107 个细胞获得了良好的效果。
  3. 用胰酶消化汇合度 >80% 的细胞，并将 2 × 107 个细胞转移至 15 ml 无菌螺口离心管中。
  4. 在 200 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀胰酶消化后的细胞。
  5. 弃去上清液，并用 HBSS 或 1× PBS 洗涤细胞沉淀。
  6. 在 200 × g 条件下离心 5 分钟，吸除洗涤液。
  7. 重复洗涤细胞沉淀一次。
  8. 将 6 孔板预先加入 2 ml 完全培养基，在 37 °C 下预热。
  9. 每个 0.5 ml 离心管中加入 2 μg Target ID 文库（体积不超过 10 μl），用于每次转染。
  10. 按照每 2 × 106 个细胞加入 100 μl Amaxa 核转染溶液（细胞类型特异性）的比例，重悬上述 15 ml 离心管中的细胞。例如，进行 10 次核转染时，加入 1 ml 试剂。
  11. 每次进行一个反应，将 100 μl 细胞悬液加入含 2 μg 质粒的离心管中，用移液器混匀。
  12. 将混合物转移至核转染杯中。
  13. 将转染杯插入核转染仪，运行针对该细胞系优化的程序（优先选择高转染效率而非细胞存活率）。
  14. 用预热的培养基填充转移用移液管，用同一支移液管吸取细胞，转移至 6 孔板中。每孔进行一次核转染，依次重复操作。
  15. 将细胞放回培养箱中，过夜孵育。
  16. 次日更换培养基，让细胞恢复生长 3–5 天。
  17. 根据杀灭曲线分析结果，更换为含有适当浓度 zeocin 的完全培养基。
  18. 观察细胞在 zeocin 筛选下的状态（细胞死亡情况）。
  19. 每 2–3 天更换一次含 zeocin 的培养基。
  20. 当 6 孔板中细胞达到汇合状态时，进行传代，合并细胞并在更大的培养瓶中扩增。
  21. 细胞扩增所需时间因操作者和细胞系而异，但强烈建议扩增 zeocin 抗性细胞，以制备冻存株用于后续筛选（约 2–3 周，具体时间取决于细胞系）。

2. 用miRNA表达载体转染文库细胞，筛选稳定细胞系，并选择miRNA靶标

注意：不再需要或不建议使用 Zeocin 筛选。在 miRNA 表达和更昔洛韦（靶向）筛选期间使细胞暴露于 Zeocin 可能导致 miRNA 靶标丢失。

3. 嘌呤霉素、G418 和更昔洛韦杀灭曲线

  1. 对稳定表达靶标ID文库的细胞进行更昔洛韦杀灭曲线实验，对野生型细胞使用嘌呤霉素或G418进行筛选。
  2. 将1.6 × 104个细胞接种至96孔板的各孔中，每孔加入120 μl新鲜培养基。 次日，向选定孔中加入0.1至10 μg/ml的嘌呤霉素/G418，或2至32 μM的更昔洛韦。
  3. 每隔2天观察细胞存活情况。每3天更换含筛选试剂的新鲜培养基。应选用在目标时间内导致完全细胞死亡*的最低筛选试剂浓度用于该细胞类型及实验。我们的结果显示，对于A549、HeLa和MCF7细胞，0.25至1 μg/ml的嘌呤霉素为最佳浓度；MCF7细胞使用0.3 μg/ml G418为佳；而A549、HeLa和MCF7细胞使用8–16 μM更昔洛韦为最佳。

    *注：在更昔洛韦筛选过程中，可能观察到细胞生长缓慢或无生长，但未必出现完全细胞死亡。需持续观察数天以确认细胞是否停止分裂。若确实如此，则培养基中的酚红将保持红色。如果观察到细胞敏感性发生变化，可能还需对转染了靶标ID文库的细胞进行杀灭曲线分析。然而，这需要根据具体的细胞类型来确定。

4. 通过核转染进行miRNA转染及靶点筛选

  1. 培养/扩增目标 ID 文库细胞，使其达到 2 × 107 个细胞，并在细胞融合度 >80% 时进行胰酶消化。
  2. 将 2 × 107 个细胞转移至 15 ml 无菌螺口离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟以收集细胞沉淀。
  3. 弃去上清液，并用 HBSS 或 1× PBS 洗涤细胞沉淀。
  4. 在 200 × g 条件下离心 5 分钟，吸除洗涤液。
  5. 重复洗涤细胞沉淀一次。
  6. 将 6 孔板每孔加入 2 ml 完全培养基，于 37 °C 预热。
  7. 每个转染反应（每 0.5 ml 体系）加入 2 μg miRNA 表达质粒（体积不超过 10 μl）。已成功使用的质粒包括 Origene miRNA 表达质粒（新霉素抗性——G418 筛选）或克隆至 pBABE-Puro 载体中的自建 miRNA 基因（质粒编号 1764；Addgene）。对于后者，miRNA 发夹结构及其两侧约 200 bp 序列通过 PCR 从人基因组 DNA 中扩增并克隆获得。
  8. 按每 2 × 106 个细胞加入 100 μl Amaxa 核转染溶液（细胞类型特异性）重悬上述 15 ml 管中的细胞。例如：进行 10 次核转染时，加入 1 ml 试剂。
  9. 每次一个反应，将 100 μl 细胞悬液加入含 2 μg 质粒的管中，用移液器轻轻混匀。
  10. 将混合液转移至核转染杯中。
  11. 将转染杯插入核转染仪，运行针对该细胞系优化的程序（优先选择高转染效率而非细胞存活率）。
  12. 用预热的培养基填充转移用移液管，吸取细胞后直接转移至 6 孔板中。每个核转染反应对应一孔，依次重复操作。
  13. 将细胞放回培养箱中过夜孵育。
  14. 更换新鲜培养基，使细胞恢复生长 3–5 天。
  15. 根据转染 miRNA 构建体前进行的杀灭曲线实验结果，更换为含有适当浓度嘌呤霉素或 G418 的完全培养基。
  16. 观察细胞在嘌呤霉素/G418 中的筛选情况（细胞死亡）。
  17. 每 2–3 天更换一次含嘌呤霉素/G418 的培养基。
  18. 当 6 孔板中细胞长满时，进行传代，合并并转移至更大的培养瓶中扩增。
  19. 细胞扩增时间由使用者决定，但强烈建议将嘌呤霉素/G418 抗性细胞扩增至足够数量，以制备冻存株用于后续筛选（约 2–3 周，具体时间取决于细胞系）。
  20. 根据转染 miRNA 构建体前进行的杀灭曲线实验结果，更换为含有适当浓度更昔洛韦（GCV）和嘌呤霉素/G418 的培养基。
  21. 监测筛选效果（细胞死亡，miRNA 靶向并敲低 TK-ZEO）。
  22. 在含 GCV 和嘌呤霉素/G418 的培养基中继续扩增细胞。
  23. 从经 GCV 筛选的细胞中提取基因组 DNA。
  24. 使用试剂盒引物进行插入片段的 PCR 扩增（参见 PCR 扩增部分）。
  25. 将扩增产物克隆至 TOPOTA 载体（Invitrogen）进行常规测序，或直接提交 PCR 产物进行深度测序。

3. PCR 扩增选定文库插入片段并测序

注意：本步骤用于对在更昔洛韦筛选中存活的文库目标片段进行PCR扩增。

5. 收集更昔洛韦筛选的细胞，使用 GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit（目录号 G1N10）或等效试剂盒制备染色体DNA。我们建议从不含靶标ID文库的亲本细胞系中制备DNA，作为阴性对照，用于与靶标筛选细胞的DNA在PCR中进行比较。

  1. 使用扩增引物1和扩增引物2对基因组DNA进行PCR扩增。推荐使用JumpStart REDTaq ReadyMix反应混合物（目录号P0982）进行PCR扩增。若使用其他聚合酶，可能需要优化反应条件。PCR反应体系设置示例参见表1，PCR扩增循环条件参见表2。
  2. 取2–5 μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。预期产物应呈现弥散条带并伴有部分可见的DNA条带。与未转染靶标ID文库细胞的基因组DNA对照PCR产物进行比较。
  3. 对PCR产物进行克隆和/或深度测序。若未观察到扩增产物或产物与对照DNA一致，需优化PCR扩增条件（如引物浓度、退火温度和循环次数）。

6. 克隆与测序

注意：我们强烈建议对PCR产物进行克隆，然后使用试剂盒中提供的扩增引物对至少96个克隆进行标准测序。该操作已成功应用于96孔板过夜培养物及质粒纯化系统。即使计划进行深度测序，也可先通过克隆和标准测序获得初步结果，作为质量控制手段，以判断是否值得投入深度测序的额外费用。

  1. 按照TA克隆试剂盒制造商的说明书，对上述PCR扩增产物进行克隆。
  2. 将克隆转化至感受态细菌细胞中，并在含抗生素的培养基中过夜培养进行筛选。
  3. 挑取单个菌落，在含有适当抗生素的液体培养基中培养扩增。
  4. 提取并纯化质粒DNA。 6.5. 使用扩增引物进行测序反应。
  5. 通过将测序结果与人类转录组（用于已知转录本）和人类基因组（用于新转录本）进行BLAST比对，确定基因靶标。*

*克隆问题排查：如果测序结果中大量插入片段为质粒序列，请优化克隆/测序条件，方法如下：

  • PCR 扩增产物（插入片段）的质量与数量
  • 连接反应
  • 质粒制备（质量与数量）
  • 测序反应条件

4. 代表性结果

miR-373 靶基因的文库筛选
为评估 Mission Target ID 文库的性能，从表达 miR-373 的 MCF-7 文库细胞中筛选其靶基因。选择 MCF-7 细胞系是因为其内源性 miR-373 表达极低或无法检测（数据未显示）。选择 miR-373 是因其具有重要的生物学意义：miR-373 的表达可促进 MCF-7 细胞（通常为非转移性细胞系）的肿瘤侵袭和转移[2]。此外，小鼠 miR-290 基因簇中的 miR-373 同源物参与小鼠胚胎干细胞的维持[3]，而 miR-373 家族成员 miR-372 可促进成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞[4]。最后，我们利用锌指核酸酶将 PGK 启动子驱动的 miR-373 表达载体插入 MCF-7 细胞的 AAVS1 位点，并通过 RNA 微阵列分析获得一组潜在的 miR-373 靶基因列表（数据未显示）。

将靶标ID文库转染至MCF-7细胞中，并在含zeocin的培养基中筛选并扩增获得稳定的细胞群体。将所得细胞（MCF-7文库）稳定转染表达miR-373的构建体，并在含更昔洛韦（ganciclovir）的培养基中进行筛选，以富集表达miR-373靶标的细胞。我们观察到，阴性对照MCF-7文库细胞（不含miR-373）并未像预期的死亡细胞那样脱落并变圆。然而，这些细胞确实停止了增殖，这一点可明显观察到，因为含酚红的培养基未出现表达miR-373细胞所表现出的橙黄色变化（图5）。随后在含更昔洛韦的培养基中扩增细胞，并利用引物通过PCR扩增靶标序列，这些引物位于靶标ID文库cDNA插入片段的侧翼，模板DNA来自存活细胞。PCR产物进行Illumina测序。

如表4所示，我们获得了17,740,719条cDNA读段，这些读段比对到11,076个独特的基因。在这些独特基因中，有2,898个基因的读段数超过40条，因此被视为可靠的检出结果。检测到13,106,469条载体读段是预期之中的，因为用于扩增cDNA插入片段的PCR引物距离插入位点分别为40和300个碱基。因此，与传统的基因组材料深度测序不同，大多数测序结果来源于载体序列。另有14%的读段未能比对到载体或cDNA，但可与NCBI的非冗余核苷酸数据库比对上（即NR比对成功），仅有1%的克隆未插入cDNA片段。

初步比较发现，利用靶标鉴定文库鉴定出的特有基因中有10个也出现在TarBase数据库先前鉴定的miR-373靶基因列表中（表5）。这10个miR-373靶基因先前通过转染合成miR-373模拟物的HeLa细胞RNA进行微阵列分析而被鉴定[5]。此外，我们在MCF-7细胞中检测到这10个基因的表达下调，这些细胞在AAVS1位点表达miR-373（数据未显示）。因此，这10个基因很可能是miR-373的真实靶标。目前正在进行的工作包括对潜在靶基因列表进行特征分析，并通过RT-qPCR、Western印迹和荧光素酶报告基因实验对部分候选靶标进行实验验证。

基因表达工作流程图：转染、筛选、基因组DNA提取、PCR、测序方法。
图1. 靶标ID文库的工作流程。A-C部分：对应实验步骤中的相应章节。每个步骤在图2和图3中均有图示并详细描述。

基因编辑示意图；转染、整合、转录、博来霉素筛选过程示意图。
图 2. 转染与博来霉素筛选。 靶标 ID 文库是一组质粒池（A），每个质粒均在胸苷激酶-博来霉素融合蛋白（TKzeo；图 4）的 3′-非翻译区（UTR）插入了人源 cDNA。将靶标 ID 文库转染入细胞（B），并让细胞恢复培养 3–5 天。在此恢复期间，质粒可整合至基因组中（C），并表达所编码的转录本（D）。恢复培养后，对细胞施加博来霉素处理（E）。那些因稳定整合了靶标 ID 构建体而表达 TKzeo 融合蛋白的细胞可在博来霉素筛选中存活（F）。未转染的细胞则会死亡（G）。此外，任何含有被细胞内源性 miRNA 或其他抑制 TKzeo 表达因子所靶向的构建体的细胞也将死亡（H）。

miRNA筛选流程示意图；转染、整合、筛选；基因表达分析。
图3. miRNA转染与更昔洛韦筛选。 含有靶标ID文库的细胞（即经杀稻瘟菌素筛选的细胞）被转染入一种可筛选的miRNA表达载体（A）。在恢复培养期间，miRNA表达载体可能发生整合（B），并表达miRNA载体上编码的可筛选标记。在筛选获得稳定整合的细胞（C）并扩增后，细胞用更昔洛韦处理（D）。在更昔洛韦存在下表达胸苷激酶（TK）的细胞（即表达未被miRNA靶向的TKzeo载体的细胞）将会死亡（E）；而另一方面，含有带miRNA靶位点文库载体的细胞不会产生TK，因此可在更昔洛韦筛选中存活（F）。存活的细胞可进行培养，提取基因组DNA，并使用靶标ID扩增引物通过PCR扩增含有miRNA靶位点的cDNA片段。PCR产物可进行测序，并与人类基因组比对，以鉴定miRNA靶基因。

质粒图谱：p3’TKzeo，5190 bp，限制性酶切位点，基因扩增引物位置。
图4. 质粒图谱及扩增引物位置。 Sfi I 为cDNA克隆位点。

引物序列

MISSION 靶标 ID 扩增引物 1

5΄ ACGACGTGACCCTGTTCATC 3΄

MISSION 靶标扩增引物 2

5΄ TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3΄

细胞活力检测结果；MCF7细胞系，更昔洛韦处理，96孔板，剂量反应。
图5. 更昔洛韦对细胞生长的影响。在24孔板中接种二十万个MCF-7细胞或含有靶标ID文库的MCF-7细胞。24小时后，将培养基更换为含有0、8或16 μM更昔洛韦的培养基。15天后，对孔板进行拍照（上方6个孔），然后用HBSS洗涤各孔，并用亮蓝R染色液（B6529）染色（下方6个孔）。请注意，更昔洛韦对不含文库的MCF-7细胞无影响，因为这些细胞不表达胸苷激酶（TK）。相反，含有文库的MCF-7细胞表达TK，但在8或16 μM更昔洛韦处理下并未被完全杀死，这可通过吸收亮蓝染料的存活细胞观察到。然而，文库细胞在更昔洛韦存在下确实停止了增殖，这可通过培养基中酚红染料的颜色变化来证明。这些生长停滞的细胞不会使培养基酸化，因此颜色保持微红色，而不会变为橙黄色。

试剂每反应体积
Jumpstart REDTaq ReadyMix 反应混合液10 μl
扩增引物 1（25 μM）0.2 μl
扩增引物 2（25 μM）0.2 μl
基因组 DNA50–200 ng
分子生物学级水加至 20 μl

表1.

步骤温度时间循环数
初始变性95 °C5 min.1
变性95 °C30 sec.40 cycles
退火*62 °C30 sec.
延伸68 °C2 min.
最终延伸68 °C5 min.1
保存4 °CHold 

表2.

*退火温度可能有所不同，但我们观察到退火温度在53至64 °C之间时扩增产物最佳。

基因测序数据表；计数、百分比分析；Illumina、载体、cDNA 读长、唯一基因。

表3. 通过Illumina测序获得的靶标ID文库内容。

显示读数计数、百分比和唯一基因指标的RNA测序数据表

表4. 通过Illumina测序筛选的miR-373靶基因。

显示不同基因读数计数的基因表达表格；RNA测序分析中的关键数据。

表5. 通过RNA微阵列先前鉴定出的10个靶点。

讨论

microRNA 是一类长度为 20-24 个核苷酸的 RNA 分子，通过抑制 mRNA 的翻译来转录后调控基因表达，且通常还会导致靶向 mRNA 的不稳定（详见文献[6]）。单个 microRNA 可调控数百个 mRNA，从而控制细胞对发育信号和环境信号的响应。识别并验证靶 mRNA 对于明确 microRNA 在这些通路中的作用与功能至关重要。然而，靶标识别并非易事，因为在动物中，microRNA 与其靶位点之间并不完全互补。“种子”区域（即 microRNA 5′端第 2 至第 7 位碱基）通常与其靶标互补，但该规则存在诸多例外，下游碱基配对可弥补种子区配对的不完全匹配。目前已有多种计算机算法被开发用于预测 microRNA 靶标，这些算法基于种子区匹配与下游补偿、靶标结构与位置、序列保守性，以及其他在实验验证靶标中观察到的多种参数（详见文献[7]）。尽管基于计算机的预测方法使用便捷，并能识别出许多真实的 microRNA 靶标，但大多数预测基因无法通过实验验证，同时许多真实靶标却未被预测出来。此外，由于计算机算法依赖于先前已知的靶标特征，因此难以发现偏离已有认知的新靶标。

已有多种实验系统被成功用于在活细胞中鉴定或发现功能性 miRNA 靶标。这些全局筛选方法包括微阵列和 RNA 测序、RNA 共免疫沉淀（RIP）以及细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC），后者是一种蛋白质组学方法（详见文献[7]综述）。每种方法均有其优缺点。由于 miRNA 靶向作用常导致 mRNA 不稳定并引发其降解，因此分别通过引入 miRNA 模拟物或抑制剂后检测 mRNA 水平的降低或升高，可识别 miRNA 靶标。这种 mRNA 水平的变化可通过微阵列或深度测序轻松检测。尽管 mRNA 检测方法比蛋白质检测方法更简便且更灵敏，但该方法会遗漏那些未发生降解的 miRNA 靶标。Bartell 实验室近期发表的研究比较了通过 RNA 检测与 SILAC [8] 或核糖体图谱分析 [9] 获得的 miRNA 靶标结果，表明哺乳动物 miRNA 主要通过降低靶标 mRNA 水平发挥作用。然而，许多其他实验室在研究特定 miRNA 靶标时发现蛋白质水平发生变化而 mRNA 水平无变化。报道中显示存在翻译调控但无明显 mRNA 水平下降的案例包括：miR-10b 对 HOXD10 的调控 [10]，miR-221/222 对 p27kip1 的调控 [11]，miR-21 对 Pdcd4 的调控 [12]，miR-126 对 p85β 的调控 [13]，miR-34 对 SIRT1 的调控 [14]，miR-21 对 PTEN 的调控 [15]，miR-302d 对 Arid4b 的调控 [16]，miR-200c 对 JAG1 的调控 [17]，以及 miR-299、297、567 和 609 对 VEGFA 的调控 [18]。此外，Clancy 等人 [19] 近期报道指出，只有当选择性检测含有 let-7 靶位点的特定 mRNA 异构体时，才能观察到 let-7 介导的翻译调控。这表明，在某些情况下，翻译调控可能在综合分析谱中被忽略——即当所有 mRNA 异构体被检测为单一 mRNA 时，这正是许多微阵列和序列分析所采用的方式。通过 Argonaute 蛋白（通常为 ago2）或其他相关蛋白对 miRNA-mRNA 复合物进行共免疫沉淀（RNA 免疫沉淀，RIP）可分离 miRNA 靶标，且不受调控机制限制。此外，RIP 可检测内源性且可能具有生物学意义的相互作用。然而，目前尚不清楚是否所有 miRNA-mRNA 相互作用都具有功能，且 RIP 会遗漏那些仅短暂结合或迅速降解的 mRNA 靶标。此外，由于所有共沉淀的 miRNA-mRNA 配对混合在一起，其具体配对关系必须通过生物信息学手段推断。最后，SILAC 可直接识别 miRNA 调控的最终产物——蛋白质本身，但其灵敏度较低，因此会遗漏低丰度蛋白以及蛋白质水平的微小变化。

鉴于现有miRNA靶点鉴定方法的局限性，我们认为有必要开发一种通过替代机制来鉴定功能性miRNA靶点的全局性检测方法。为满足这一需求，我们获得了伦敦国王学院Joop Gaken和Azim Mohamedali发明的一项技术授权。该技术基于一种双筛选融合蛋白，具体为胸苷激酶-杀稻瘟菌素（thymidine kinase-zeocin）融合蛋白，其表达受插入于3′非翻译区（3′UTR）的潜在miRNA靶序列cDNA文库调控。如图2所示，稳定转染并表达TKzeo-cDNA构建体的细胞可通过杀稻瘟菌素（zeocin）进行筛选。在表达特定miRNA后，该miRNA的靶点可通过更昔洛韦（ganciclovir）进一步筛选，如图3所示。更昔洛韦可杀死表达胸苷激酶的细胞，即所有表达TKzeo-cDNA但不含该miRNA靶点的细胞。存活于更昔洛韦处理的细胞中所含的靶向cDNA可通过PCR扩增获得，使用位于cDNA两侧的引物进行扩增，所得PCR产物经测序即可鉴定miRNA靶点。

我们将国王学院的技术开发成一种用于全球性识别和发现功能性人类miRNA靶点的新工具——MISSION靶点鉴定文库。利用该靶点鉴定文库，用户可通过一系列哺乳动物细胞培养、转染及药物筛选步骤来分离miRNA靶点。该文库具有高度全面性，包含人类基因的66%-79%。初步结果表明，无论是先前已发现的靶点还是全新的靶点，均可从MISSION靶点鉴定文库中分离获得。

尽管该实验方案篇幅较长，但使用靶标鉴定文库（Target ID Library）仅需标准的分子生物学实验技术——哺乳动物细胞培养、转染、药物筛选、PCR 和测序，因此大多数生物学家均具备实施条件。我们建议充分重视合理的实验设计，优化培养条件，尤其重要的是，在使用靶标鉴定文库前应对每种新细胞类型进行预实验，通过杀灭曲线（kill-curves）确定筛选步骤的最佳药物浓度，以确保实验成功。

与所有miRNA靶标鉴定方法一样，强烈建议通过第二方法验证Target ID文库筛选出的靶标，例如微阵列、qRT-PCR、报告基因检测（如荧光素酶）或蛋白质印迹分析。

披露

作者声明与对所提交作品有利益关系的商业实体存在财务往来。

致谢

我们感谢Sigma Life Science Mission Target ID文库开发团队的全体成员，特别感谢Kevin Gutshall发现该技术并协商许可条款，以及Heather Holemon在富有成效的故障排查讨论中提供的支持与参与。我们还要感谢伦敦国王学院的Joop Gäken博士无偿分享未发表的研究结果和建议，感谢RxBiosciences公司的Qazi Hamid制备了高质量的cDNA并坚持不懈地完成克隆工作。我们谨向SAFC公司的Nan Lin和Scott Bahr致谢，感谢他们完成cDNA芯片实验及数据分析。

MISSION 是 Sigma-Aldrich Biotechnology L.P. 的注册商标。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
JumpStart REDTaq ReadyMixfigure-materials-1 Sigma-AldrichP0982
更昔洛韦Sigma-AldrichG2536
G418Sigma-AldrichG8168
嘌呤霉素figure-materials-2 Sigma-AldrichP9620
Topo TAInvitrogenKNM4500-01
GenElute 哺乳动物基因组 DNA 小量提取试剂盒figure-materials-3 Sigma-AldrichG1N10
细胞特异性核转染试剂盒Lonza Inc.
核转染仪Lonza Inc.AAD-1001
ZeocinInvitrogenR250-01
靶标 ID 文库Sigma-AldrichMREH01

参考文献

  1. Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from: http://www.sigma-aldrich.com (2012).
  2. Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis. Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).
  3. Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells. Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).
  4. Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).
  5. Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).
  6. Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).
  7. Thomas, M. Desperately seeking microRNA targets. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).
  8. Baek, D. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).
  9. Guo, H. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).
  10. Ma, L. Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer. Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).
  11. Visone, R., et al. MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle. Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).
  12. Lu, Z., et al. MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene. Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).
  13. Guo, C., et al. The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers. Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).
  14. Yamakuchi, M., et al. miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).
  15. Wickramasinghe, N. S., et al. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.
  16. Ciaudo, C., et al. Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation. PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).
  17. Vallejo, D. M., et al. Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells. EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).
  18. Jafarifar, F., et al. Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP. L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).
  19. Clancy, J. L., et al. mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation. RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).

重印与许可

标签

cDNA PCR microRNA Zeocin
使用 MISSION Target ID 文库进行全基因组 miRNA 靶点筛选
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。