本文利用人源LentiPlex混合文库和传统测序方法，鉴定促进细胞存活的基因靶点。我们展示了如何建立并解析LentiPlex筛选实验，并对结果进行验证。
本文内容
摘要
摘要
RNA干扰（RNAi）是一种细胞内源性的基因表达调控机制。利用该系统的固有功能，我们可以在基因功能缺失研究中实现基因表达水平的敲低。
进行RNA干扰主要有两种方法。第一种是使用化学合成的小干扰RNA（siRNA），第二种是利用质粒编码的短发夹RNA（shRNA）1。后者可直接转染进入细胞，也可包装成无复制能力的慢病毒颗粒。使用慢病毒shRNA的主要优势在于其易于导入多种不同类型的细胞，能够稳定整合到基因组中以实现长期的基因敲低和筛选，并且在进行高通量功能缺失筛选时具有高效性。为了促进此类研究，我们开发了LentiPlex混合shRNA文库。
MISSION LentiPlex 人 shRNA 混合文库是一种通过专有工艺制备的全基因组慢病毒混合物。该文库包含来自 TRC 文库的超过 75,000 个 shRNA 结构，靶向 15,000 多个人类基因2。在产品发布前，每个文库均经过 shRNA 表示度检测，以确保文库覆盖的充分性。该文库以即用型慢病毒形式提供，通过 p24 检测测定滴度至少为 5 × 108 TU/mL，并预先分为十个亚文库，每个亚文库约含 8,000 个 shRNA 构建体。同时提供扩增和测序引物，用于后续靶点鉴定。
既往研究已证实，TRAIL 与紫杉醇联合使用时，在 A549 细胞（一种人肺癌细胞系）中具有协同抗肿瘤活性3, 4。在本研究中，我们展示了利用混合型 LentiPlex shRNA 文库，对暴露于 TRAIL 和紫杉醇时参与 A549 细胞毒性的基因进行快速正向筛选的应用。高通量筛选常遇到的一个障碍是成本高昂且解码困难；我们还详细描述了一种经济高效的多克隆方法，利用传统测序技术实现基因鉴定。
方案
LentiPlex 混合筛选设置
为了鉴定感兴趣的shRNA序列，关键在于设置筛选条件，使大多数细胞仅获得一种shRNA构建体。通过使用较低的感染复数（MOI），可显著降低每个细胞内含多个整合拷贝的概率。然而，转导效率以及所需的MOI在很大程度上取决于靶细胞类型。因此，在新细胞类型中启动筛选前，必须首先确定最佳MOI。
1. 使用 Mission LentiPlex 混合 shRNA 文库转导靶细胞
- 实际使用的感染复数（MOI）会因不同细胞类型而异。若需设置重复，则应相应增加培养板的数量。此外，通常不建议将不同的亚文库混合，保持亚文库彼此分离有助于后续的去卷积分析。在转导过程中，务必对每个组织培养皿标注其所对应的亚文库编号。建议采用较低的MOI，以降低单个细胞内发生多次整合的概率。
- 第1天——根据所需数量，在60 mm培养皿中接种适量细胞，使次日细胞融合度约为70%（共10组，每组设3个重复，总计30个培养皿）。在本研究中，每个60 mm培养皿接种6 × 10⁵个A549细胞，以确保转导前细胞融合度达到70%，此时细胞仍处于指数生长期。不同细胞类型的生长速率存在差异，在开展筛选实验前需预先确定其生长特性。
- 让细胞贴壁，于过夜孵育 37°C 在含5% CO₂的湿润化培养箱中2.
- （可选）额外准备两块60-mm培养皿，用于转导阴性对照shRNA。将培养皿分别标记为“对照A”（SHC001H）和“对照B”（SHC002H）。
- 第2天——用LentiPlex病毒颗粒转导细胞。在转导当天，将慢病毒颗粒置于冰上解冻。
- 将解冻的颗粒转移至超净工作台中，若不立即使用，则置于冰上保存。
- 计算向每孔细胞中加入各病毒亚库的体积，以使所有细胞培养皿中的感染复数（MOI）达到1。
- 示例： 1 × 106 细胞/皿；病毒滴度 = 5 × 108 TU/ml；所需的感染复数（MOI）为1。i.) 1 × 106 细胞/皿 ×（感染复数为1）= 1 × 106 转导单位（TU）所需数量 ii.) 1 x 106 TU/(5.0 × 108 TU/ml）由C of A获得 = 2 μL 应将慢病毒原液的计算量加入相应的培养皿中。将计算量的病毒用100-200 μL培养基稀释后加入300 μL 以确保病毒加入细胞培养皿时分布更均匀。
- 移除预先接种细胞的培养基，向每孔中加入含有六甲基溴化铵溶液的完全培养基。培养基中六甲基溴化铵的推荐终浓度为 8 μg/ml如果发现聚六亚甲基溴化铵对目标细胞具有毒性，则减少其使用量。
- 根据预先确定的实验设计，将shRNA慢病毒颗粒加入相应的培养皿中。轻轻摇晃培养板，使病毒在细胞中均匀分布。
- 37 °C，孵育18-20小时 37°C 在含5% CO₂的湿润化培养箱中2.
- （可选）在对照皿A中以相同的感染复数（MOI）重复步骤3-8，使用SHC001H（空载体shRNA对照），在对照皿B中使用SHC002H（随机shRNA对照）。在整个实验过程中，对这些对照皿的处理应与实验组皿完全相同。
- 第3天——更换培养基。吸除含病毒的培养基，加入新鲜的完全培养基（不含六甲溴铵）。将细胞在 37°C 过夜。
2. 用治疗组分/试剂处理已接种的细胞
- 第4天——吸去孔板中的培养基，加入含有治疗成分的新鲜培养基，治疗成分浓度应为最佳浓度。与培养条件类似，处理方式会有所不同，应预先确定合适的浓度和处理时间。在本研究中，我们使用了100 ng/mL的TRAIL和1 μM的紫杉醇。细胞处理时间为48小时。
- 存活的细胞应重新接种至T75培养瓶中，并培养至接近100%汇合。
- （可选）在筛选结束时，检查对照皿A和对照皿B。对照皿A和对照皿B中的克隆数量应均少于至少一个文库混合组培养皿中的克隆数量。如果对照皿A中克隆数量异常增多，则可能是因为转导过程影响了与目标表型相关的通路，或者选择压力不足，需要重新优化实验条件。如果对照皿B中存在过多克隆，则表明shRNA的表达及RNAi通路的激活可能影响了目标表型。若出现此情况，应使用SHC001H重复实验，以确认该效应并非SHC002H特有。
3. 从多克隆细胞群体中进行去卷积
- 从每个亚群中收获异质性细胞群体并分离基因组DNA。在本实验中，细胞用PBS短暂洗涤并经胰蛋白酶消化后，使用GenElute哺乳动物基因组小量提取试剂盒及其配套方案（Sigma-Aldrich, G1N70）提取基因组DNA。或者，也可使用市场上现有的其他任何基因组纯化试剂盒进行DNA提取。重要的是需遵循试剂盒推荐的起始培养细胞数量。
- 靶序列的PCR扩增。shRNA模板回收程序可实现从筛选后的细胞群体中扩增全部shRNA插入片段，或从单独挑取并扩增的克隆中回收单个shRNA模板。在对对照组和筛选后的靶细胞中的shRNA插入片段进行PCR扩增后，可对扩增产物进行测序。
- 本PCR扩增步骤使用Sigma ReadyMix（目录号P2893）进行了优化。也可使用其他扩增试剂，但可能需要调整循环条件和/或镁离子浓度以实现有效扩增。扩增引物以20 mM浓度随LentiPlex试剂盒提供。
- 按照表1所述设置PCR反应体系，按所列顺序加入各组分。所述体积适用于一个50 μL的反应体系。若需进行多个反应，应将主混合液各组分按所需反应数同比放大，并额外增加10%的过量体积。建议使用的DNA模板量为50–100 ng。
- 强烈建议将MISSION shRNA人源阳性对照载体稀释至适当浓度后作为单个反应的模板。该模板的成功扩增表明PCR试剂和循环条件均合适。注意：为防止实验样品和试剂间的交叉污染，建议在与后续PCR反应设置区域不同的位置稀释阳性对照。
- 将表2中列出的PCR程序保存至您的热循环仪中。
- 对每个样本，取3 μL PCR产物与1 μL上样染料混合，与5 μL DirectLoad™ PCR 100 bp Low Ladder（目录号D3687）一同在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，以确认是否存在309 bp的扩增片段。
- PCR扩增产物的亚克隆：按照制造商说明书（Invitrogen, K4575-01），使用TOPO-TA克隆试剂盒对PCR产物进行TOPO克隆。结果为每个载体中含有一个PCR扩增产物。
- 挑取250个单个细菌菌落（每个含有一个独立的PCR扩增片段），在含100 mg/mL氨苄青霉素的2 mL LB培养基中培养。随后使用GenElute质粒小量提取试剂盒（Sigma-Aldrich, PLN70）提取质粒DNA。
- 用EcoRI酶切纯化的质粒DNA，并进行电泳，以确认插入片段的存在。
- 对质粒DNA样本进行测序，并利用LentiPlex文库配套提供的LentiPlex shRNA序列搜索数据库鉴定shRNA插入序列。
4. 靶点鉴定与验证
- shRNA 序列以 5'-GAAACACCGG-3' 开始。将接下来至少 10 个但少于 21 个核苷酸作为查询序列，输入到随附的 shRNA 序列搜索 Access 数据库表单中的搜索框内。
- 选择混合 shRNA 的物种。可选地，选择发现该序列的子文库。
- 现在点击“查找潜在匹配”按钮以执行搜索。此操作应能识别出与测序数据相匹配的相应 TRC shRNA 序列。有关已识别 TRC shRNA 序列及其对应基因靶点的更多信息，可访问 Sigma-Aldrich 的“您最喜爱的基因”网站：http://www.sigma.com/yfg
- 应通过使用原始 TRC 克隆以及至少另外两个靶向同一基因的 shRNA，以 1 个 shRNA 对应 1 个孔的格式重复原始筛选实验，来验证所鉴定的靶基因。真实阳性结果将在多数孔中表现出相同的表型。
5. 代表性结果
图1详细展示了LentiPlex混合筛选实验的工作流程。在TRAIL和紫杉醇存在条件下增殖的转导细胞被允许持续扩增，直至培养瓶中的细胞达到汇合状态。提取基因组DNA，并按照图1A所示进行PCR扩增和克隆，随后进行测序及shRNA鉴定，具体步骤如图1C所述。共对250个克隆进行了测序，其中25个由多个克隆代表，其余225个仅由单个克隆代表，后者在本次研究中未作进一步分析。
如图2所示，多个候选基因（包括TBX3、PPP2CA和AKT2）由多个克隆子代表。T-box转录因子TBX3共出现在四个克隆子中，已被证实与肿瘤迁移相关5。研究表明，PPP2CA的下调可通过解除雄激素剥夺诱导的细胞周期阻滞并抑制凋亡，从而维持在雄激素缺乏条件下培养的LNCaP细胞的生长6。AKT2是一种RAC-β丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为一种潜在的癌基因，已被证明在癌症发生发展中发挥多种作用7, 8。
*溶液中 Mg2+ 的终浓度为 3 mM；其中 1.5 mM 来自 Taq ReadyMix，另外 1.5 mM 来自氯化镁溶液。
表 1. Lentiplex PCR 反应条件
表 2. Lentiplex PCR 扩增程序
图1. (A) LentiPlex混合筛选，(B) 多克隆解卷积工作流程，以及(C) shRNA靶点的鉴定。
A. LentiPlex 混合筛选。 首先接种细胞，然后加入shRNA亚文库（共10个文库，每个文库设三个重复，总计30个培养皿）。接着，加入治疗组分/试剂（在本实验中分别为TRAIL和紫杉醇）。随后，将存活的细胞重新接种至培养瓶中并使其扩增。从每个亚文库中收获细胞的异质群体，并提取基因组DNA。
B. 多克隆去卷积。 通过PCR扩增含有shRNA插入片段的DNA。PCR产物大小均一，但由于模板基因组DNA为多克隆序列，因此PCR产物在序列上是多克隆的。将PCR产物克隆至载体中，然后转化感受态细菌。
C. shRNA 靶点的鉴定。 分离单个菌落并提取质粒 DNA。每个克隆含有携带单个 PCR 片段的克隆载体。通过酶切消化质粒 DNA 以确认插入片段的存在，并进行测序。使用 LentiPlex shRNA 序列搜索数据库鉴定 shRNA 插入片段。
图 2. 鉴定出的候选基因。 共鉴定出 25 个具有多次命中的候选基因。另有 225 个候选基因仅被命中一次，未作进一步研究。有关每个候选基因对应的单个克隆的详细信息，请参见补充表 1。
补充表 1. 通过多克隆测序基因ID检测结果鉴定出的个体TRC文库克隆。
讨论
本研究中，我们采用全基因组筛选方法，鉴定在紫杉醇/TRAIL处理后参与A549细胞毒性的相关基因。全基因组筛选中采用混合筛选策略，可减少传统阵列式筛选通常所需的时间、成本和设备投入。筛选成功的关键在于预先进行的优化实验，其中转导条件和感染复数（MOI）必须通过实验经验确定。
筛选方法应能够稳健地筛选出表现出目标表型的细胞（例如，存活、表面蛋白表达等）。优化这些参数将减少检测到的假阳性数量。
在此实验中，从所选细胞的群体中提取基因组DNA（gDNA），随后通过TOPO克隆技术鉴定单个shRNA插入序列。本实验的一个可能改进方案是使用荧光激活细胞分选（FACS）对活细胞进行分选，以确保仅收集活细胞。所鉴定出的靶点将通过在筛选实验中转导靶点特异性的shRNA进行验证。真正的阳性结果将在大多数孔中表现出相应的表型。
LentiPlex 混合文库在应用上具有灵活性，可兼容多种下游应用，并可用于阳性或阴性筛选策略。根据筛选条件的不同，可通过 PCR/克隆、微阵列或新一代测序技术对 shRNA 插入片段进行解卷积分析9, 10。尽管这些技术在解析RNAi筛选结果方面的强大功能和高效性已得到充分证实，但微阵列和新一代测序方法的一个顾虑在于，正确分析和解释实验结果所需的生物信息学资源和专业知识可能不易获得。这些技术相关的成本常常成为开展全基因组范围筛选的障碍。基于PCR/克隆的方法虽然在通量上不及微阵列和新一代测序，但仍是有效且成本较低的替代方案。
安捷伦现提供基于TRC shRNA文库的定制芯片，以进一步支持LentiPlex筛选。这些选项使研究人员能够利用LentiPlex研究多种多样的细胞功能。
披露
Matthew J. Coussens、Courtney Corman、Ashley L. Fischer、Jack Sago 和 John Swarthout 任职于 Sigma-Aldrich 公司，该公司生产本文所用的工具和试剂。
致谢
MISSION 是 Sigma-Aldrich Biotechnology L.P. 的注册商标。
LentiPlex 是 Sigma-Aldrich Biotechnology L.P. 的商标。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LentiPlex 混合阵列 |  Sigma-Aldrich | SHPH01 | |
| A549 细胞 | ATCC | CCL-185 | |
| TRAIL | Sigma-Aldrich | T5694 | |
| 紫杉醇 | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| Topo TA 克隆试剂盒 | Invitrogen | K4575-01 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893 | |
| GenElute 质粒小量提取试剂盒 | Sigma-Aldrich | PLN70 | |
| EcoR1 | 新英格兰生物实验室 | R0101 | |
| 六亚甲基双胍溴化物 | Sigma-Aldrich | H9268 |
参考文献
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