小鼠副嗅觉系统急性组织切片中信息素感知的成像研究

摘要

在小鼠中，检测信息素的能力主要由犁鼻器（VNO）介导。本文介绍了一种用于进行钙成像的VNO急性组织切片制备方法。这种生理学方法可实现对活体组织中神经元亚群和/或单个神经元的观测，且便于进行受体-配体的鉴定。

摘要

Peter Karlson 与 Martin Lüscher 于 1959 年首次使用“信息素”（pheromone）一词¹，用以描述用于种内交流的化学物质。信息素是挥发性或非挥发性的短寿命分子²，由生物体液分泌和/或包含其中^3,4，例如尿液——已知是信息素主要来源的一种液体³。信息素介导的通讯参与多种关键的动物行为模式，如亲缘关系互动^5,6、等级结构组织³以及性行为互动^7,8，因而直接关联于特定物种的生存^9,10,11。在小鼠中，检测信息素的能力主要由犁鼻器（vomeronasal organ, VNO）介导^10,12，该器官成对存在，位于鼻腔底部，包裹于软骨囊内。每个 VNO 呈管状结构，具有管腔^13,14，可与外界化学环境接触。其感觉神经上皮主要由犁鼻双极感觉神经元（vomeronasal bipolar sensory neurons, VSNs）构成¹⁵。每个 VSN 延伸出一条树突至管腔，末端形成一个较大的树突结节，其上带有多达 100 条微绒毛，参与化学物质的检测¹⁶。VSNs 中存在多种亚群，它们因所表达的化学感受器不同而有所区分，因而可能识别不同的配体^17,18。两类主要的犁鼻感受器家族 V1Rs 和 V2Rs^19,20,21,22 分别包含 240²³ 和 120²⁴ 个成员，并在神经上皮的不同层中表达。此外，嗅觉受体（ORs）²⁵ 和甲酰肽受体（FPRs）^26,27 也在 VSNs 中表达。

目前尚不清楚这些神经元亚群是否使用相同的下游信号通路来感知信息素。尽管存在于成熟神经元微绒毛中的一种钙离子通透性通道（TRPC2）发挥了重要作用²⁸，但已有研究提出存在不依赖TRPC2的转导通道^6,29。由于神经元亚群数量众多，且该器官具有特殊的形态结构，对犁鼻器中信号分子进行药理学和生理学研究十分复杂。

本文介绍了一种用于进行钙成像研究的小鼠犁鼻器（VNO）急性组织切片制备方法。该生理学方法可在活体组织的自然环境中，观察先前加载了钙敏感染料Fura-2AM的一般或特定亚群的犁鼻感觉神经元（VSNs）。该方法也适用于研究任何带有GFP标签的信息素受体，并可调整用于其他荧光钙探针。作为示例，本文使用了一种VG小鼠品系³⁰，该品系采用多顺反子策略，使信息素受体V1rb2的翻译与GFP的表达相偶联。

方案

1. 小鼠犁鼻器的解剖

1. 使用成年小鼠。由于信息素感知涉及多种感觉模式，因此在品系、基因型、性别和年龄之间需仔细区分，这些因素会影响实验结果。此处，我们选用成年 VG 小鼠³⁰，该品系先前已被用于鉴定一种信息素-受体配对（2-庚酮-V1rb2）³¹（图 1A）。
2. 开始解剖前，准备新鲜的冷人工脑脊液（ACSF；NaCl 118 mM，NaHCO₃ 25 mM，D-葡萄糖 10 mM，KCl 2 mM，MgCl₂ 2 mM，NaH₂PO₄ 1.2 mM，CaCl₂ 2 mM；pH 7.4），并用含氧碳酸气体（95% O₂ : 5% CO₂）饱和。配制时，先混合除 CaCl₂ 外的所有 ACSF 成分，然后直接向溶液中通入含氧碳酸气体进行饱和。最后加入 CaCl₂，并用 ddH₂O 定容至所需体积。将 ACSF 溶液置于冰上保存，待用。
3. 小鼠的安乐死应优先采用颈椎脱位法，或在实验前通过吸入 CO₂ 实现。
4. 切下小鼠头部，将其置于持续通入含氧碳酸气体的冷 ACSF 中，并在解剖显微镜下操作。
5. 剪开下颌，调整头部位置以观察腭部（图 1B）。
6. 使用显微剪刀在腭部上端水平方向做一切口（图 1B），并用显微解剖镊去除腭部膜组织。用 ACSF 润湿并清洁暴露的腔体（图 1C）。
7. 剪除鼻中隔的上部和下部（图 1C），小心取出包含犁鼻器（VNO）的鼻中隔组织，并立即放入盛有 ACSF 的冰上（图 1D）。
8. 使用显微解剖镊垂直分离犁鼻器的两部分，并小心去除犁鼻器的软骨包膜（图 1E）。确保所有软骨碎片均被清除干净。

2. VNO 组织切片制备

本节2）所述的犁鼻器组织切片制备主要用于钙成像研究。犁鼻器切片也可用于漂浮切片上的免疫组织化学染色，以验证组织的结构完整性（详见本实验方案的第3）节）。

1. 准备低熔点琼脂（3% 溶于标准 PBS）并布置好工作区域。您将需要人工脑脊液（ACSF）、切片机及配套支撑架、显微解剖镊子、包埋模具（22 × 22 × 20 mm）、精密擦拭纸、毛刷、组织培养板、氰基丙烯酸酯胶水、冰和温度计。
2. 将3%低熔点琼脂注入包埋模具中。在垂直放置刚擦拭过的犁鼻器（VNO）之前，确保琼脂温度不超过41°C，以便获得冠状切片（图 2A）。
3. 将包埋模具置于冰上约1分钟，待其凝固后，从琼脂块上取下模具。将琼脂块修切成金字塔形状，并用胶水固定于切片机的支撑架上（图 2B）。
4. 在冷的ACSF中使用切片机进行冠状面VNO切片，切片速度为0.5 mm/s，振幅0.7 mm，厚度100 μm，并用毛刷收集组织切片，随后将其转移至盛有冷ACSF的组织培养板中。
5. 若您的切片中含有内源性荧光信号（如基因靶向神经元中的GFP），可在荧光体视显微镜下进行筛选（图 2C）。

3. VNO 漂浮切片的免疫组织化学

本实验步骤的目的是验证第2节中获得的犁鼻器组织切片的完整性。乙酰化微管蛋白是犁鼻器感觉神经元树突和微绒毛中表达的一种微管/细胞骨架标志物。如需进行钙成像实验，请直接进入本方案的第4节。漂浮式犁鼻器切片的免疫组织化学染色方法可适用于任何目的蛋白表达情况的评估。为此，我们建议在完成方案第1.7步后，将犁鼻器组织置于固定液（含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液，pH 7.6）中，于4°C固定1小时，并从此步骤开始使用pH 7.6的磷酸盐缓冲液（PBS），而非人工脑脊液（ACSF）。

1. 在培养板中，将感兴趣的组织切片置于固定液（含4%多聚甲醛的PBS溶液，pH 7.6）中，4°C下固定1小时。
2. 在含有10% NGS（正常山羊血清）和0.5% Triton X-100的PBS溶液中，4°C下封闭组织切片过夜。
3. 将切片在含5% NGS和0.25% Triton X-100的PBS溶液中，室温（RT）下与一抗（抗乙酰化微管蛋白，小鼠来源，1:2000）孵育16小时。
4. 用含2% NGS的PBS溶液洗涤3次，每次5分钟。
5. 在含2% NGS的PBS溶液中，避光条件下与二抗（Cy5标记的山羊抗小鼠IgG，1:200）室温孵育1小时。
6. 依次用含2% NGS的PBS、含1% NGS的PBS以及纯PBS各洗涤3次，每次5分钟。
7. 将切片置于疏水笔划定的疏水区域中央，用含或不含DAPI的荧光封片剂封片，并加盖盖玻片。
8. 使用共聚焦显微镜及支持三维重建的软件进行观察与图像采集（图2D-F）。

4. VNO切片上的钙成像

1. 以下操作均需在避光条件下进行。将VNO切片在含有Fura-2AM（7 μM；以DMSO配制的1 mM储备液）和Pluronic 0.1%（w/v；以ddH₂O配制的20%储备液）的冷ACSF溶液中，于37°C孵育1小时。
2. 将负载完成的切片置于冰上，并持续通入含氧碳酸盐混合气体，直至使用。负载后的切片可在该条件下保存3–4小时。
3. 用毛刷将负载后的切片转移至含有ACSF的灌流腔室中，并使用组织切片固定锚固定切片（图3A）。
4. 将灌流腔室置于钙成像显微镜的载物台上（图3B），并持续以室温的含氧碳酸盐混合气体饱和ACSF进行灌流。温度可通过双极温度控制器进行调节。
5. 使用倒置荧光显微镜观察负载后的VNO切片（图3C–E），配备25倍或63倍物镜及CooL SNAP-HQ相机。采用多色仪以340/380 nm波长交替激发，图像采集频率为5 Hz。发射光通过510 nm滤光片采集。使用专用软件监测细胞内钙离子比率变化（ΔF = 340 nm/380 nm）。
6. 化学刺激剂的选择应根据具体实验目的确定。本实验中采用含信息素混合物（异丁胺、2-庚酮、4-庚酮、2-庚醇、戊酸戊酯、二甲基吡嗪、α/β-法尼烯，浓度为10^-6 M）、2-庚酮（10^-6 M）或新鲜收集的雄性和雌性小鼠尿液（1:1混合，稀释100倍）的ACSF进行灌流³²。实验结束时使用ATP（125 μM）灌流作为细胞活性检测（图3F），应显示约80%的神经元具有活性。在此条件下，切片可在2小时内持续使用。
7. 通过特定激发光可观察标记GFP的感觉神经元亚群（本例中为表达V1rb2的神经元），并对其进行精确分析（图3G–I）。

5. 代表性结果：

为了建立一种功能性检测方法，以研究小鼠副嗅球（VNO）中发生的多种信号转导通路，或鉴定新的信息素-受体配对，我们利用了 VG 小鼠品系（图 1A）。在该品系中，240 种 V1R 受体之一——V1Rb2 受体被标记了 GFP，从而能够方便地可视化特定亚群的副嗅觉感觉神经元。在取出并解剖 VNO 后（图 1E），我们制备急性 VNO 切片（图 2C）。我们将其中一部分切片固定，以便通过针对乙酰化微管蛋白（acetylated-tubulin）蛋白的免疫组织染色来检查和验证组织制备的完整性（图 2D-F）。其余切片则用于钙成像实验。为此，将切片负载 Fura-2AM（图 3C-E），并以 ΔF 比值监测每个神经元的胞内钙水平（图 3F）。通过灌注 ATP（125 μM）评估神经元的活性，预期会出现 ΔF 比值的快速且短暂升高（图 3F）。由于尿液是信息素的主要来源之一，新鲜采集的小鼠尿液（1:100）灌注被用作内源性对照，可在约 50% 被记录的神经元中引发钙瞬变（细胞 1 和 2，图 3F）。在 GFP 照明下可观察到 V1Rb2 阳性神经元，灌注其已知的信息素配体 2-庚酮（2-heptanone）可引发细胞激活（细胞 1，图 3I）。有趣的是，在一部分不表达 V1Rb2 受体的神经元（GFP 阴性神经元）中也能观察到神经元激活（细胞 2，图 3I），这表明了副嗅球中信息素编码的复杂性。

图1. 小鼠犁鼻器的解剖。（A）VG品系的小鼠。（B）小鼠安乐死后，将整个头部置于体视显微镜下，去除下颌以暴露腭部，并做一小段水平切口（黑色虚线）。（C）去除腭部后，沿犁鼻器（VNO）衬里的鼻中隔在上部和下部进行切割（白色虚线），以便于取出VNO。（D）将VNO置于ACSF溶液中并分离成两部分（插图：两部分的高倍视野）。（E）小心去除VNO的软骨包膜，之后的实验均使用去除了软骨包膜的VNO。标尺：B–E，1 mm。

图2. 小鼠犁鼻器急性切片制备及组织完整性。（A）将小鼠犁鼻器（VNO）垂直包埋于3%琼脂溶液中，琼脂温度必须低于41°C。（B）将琼脂块切成锥形，并在人工脑脊液（ACSF）中切出100 μm厚的VNO切片（黑色虚线所示）。（C）可在荧光体视显微镜下筛选VNO切片，以观察特定标记的感觉神经元群体。（D-F）可通过乙酰化微管蛋白（acetylated-tubulin）免疫组织染色评估组织完整性；V1rb2基因靶向神经元的高倍视野显示制备过程得到了完美保存。可见神经元具有伸向管腔表面的长树突（E），以及树突末端和微绒毛中结构蛋白的表达（F）。标尺分别为：B，5 mm；C，60 μm；D，40 μm；E-F，20 μm。

图3. 犁鼻器急性组织切片中的钙成像与信息素检测。（A）经过Fura-2AM染色阶段后，将VNO切片置于灌流 chamber 中，并用特制的固定锚固定（高倍视野）。（B）实验在暗环境中进行，VNO切片通过真空系统持续以室温（RT）人工脑脊液（ACSF）灌流。温度可通过由双极Pelletier元件和热探头组成的温度控制系统进行调节。本实验在室温下进行。（C–E）可在Hoffman相差显微镜下观察VNO切片（C，Hv），或在神经元激活前（D）和激活期间（E，此处使用ATP）以Fura 380 nm光照观察。（F）通过灌注ATP（125 μM）评估神经元活性。此处，化学刺激采用尿液（Urine，1:100稀释）或小鼠信息素混合物（mix ph.，10^-6 M），以165 ml/h的恒定流速进行。每个细胞（细胞1至3）的胞内钙水平（ΔF）可单独记录。（G）在GFP光照下可观察到一个V1Rb2神经元（1）。（H）显示该V1Rb2神经元（1）以及一个不表达V1Rb2的神经元（2）的染色情况。（I）V1Rb2神经元可响应2-庚酮刺激，产生胞内钙水平升高。该特定的不表达V1Rb2的神经元（细胞2）也对2-庚酮产生响应。比例尺：C–E，20 μm；G–H，15 μm；ΔF = 340 nm / 380 nm。（F和I）刺激施加的持续时间由各曲线下方的条形表示。伪彩色标尺代表荧光强度。

讨论

本文介绍的钙成像方法能够在急性脑片制备中记录小鼠副嗅觉神经元对信息素的反应。通过该方法，从动物体内分离至副嗅觉神经元的过程经过一定练习后易于实现，并可获得存活性较长的组织样本。该方法适用于耗时较长的实验，如药理学研究或信息素编码机制的探讨。利用这一生理学技术，可特异性地分析大量神经元群体以及特定的神经元亚群。此外，该方法可轻松地与免疫组织化学技术或其他基于不同钙敏感染料的实验相结合。这些联合方法的应用必将有助于鉴定出小鼠副嗅觉器官中大量孤儿化学感受器所对应的新信息素配体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺苷-5’-三磷酸二钠盐溶液（ATP）	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO
琼脂	Sigma-Aldrich	A7002-100G	优先用于免疫组织化学
低熔点琼脂	Sigma-Aldrich	A0701-25G	优先用于钙成像
CL-100 双极温度控制器	Warner Instruments	W64-0352
共聚焦显微镜	Leica Microsystems	SP5 AOBS
Cy5-AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG	Jackson ImmunoResearch	115-175-071	避光保存
DMSO（二甲基亚砜）	Merck & Co., Inc.	317275-100ML
包埋模具，Peel-A-Way	Polysciences, Inc.	18646A-1	22 x 22 x 20 mm
荧光封片剂（含 DAPI 的 Vectashield，10 ml）	Rectolab	H-1200
FURA-2AM	Teflabs	0103	避光保存
Glisseal N（真空润滑脂，60 g）	Borer Chemie	Glisseal N
大型浴槽式记录室（RC-26G）	Warner Instruments	64-0235
MetaFluor（钙成像软件；v.7.6.5.0）	Visitron Systems
单克隆抗乙酰化微管蛋白小鼠抗体	Sigma-Aldrich	T6793-.2ML
正常山羊血清（NGS，10 ml）	Interchim	UP379030
记录室平台（P-1）	Warner Instruments	64-0277
Pluronic F-127，2 g	Invitrogen	P-6867
Roti Coll（定量瓶，10 g）	Carl Roth GmbH	0258.1
SC-20 双通道溶液加热/冷却装置	Warner Instruments	W64-0353
切片固定锚（SHD-26GKIT）	Warner Instruments	64-0266
体视荧光显微镜	Leica Microsystems	MZ16FA
Super PAP 笔（疏水笔）	Pelco International	22309
Triton X-100	Fluka	93420-250ML
振动切片机 VT 1200S	Leica Microsystems	14048142066
VisiChrome 高速多色光发生系统	Visitron Systems
三维数据可视化软件（Imaris；v.6.3.1）	Bitplane Scientific Software