使用无限视野冲击器建立单侧颈段脊髓损伤的挫伤模型

摘要

本文介绍了一种使用Infinite Horizon撞击器制备颈段单侧脊髓损伤的可靠且可重复的方法。该方法利用定制设计的框架和夹具来稳定脊柱。标准化的操作流程和生物力学损伤参数可产生充分且稳定的损伤效果。

摘要

尽管大多数人类脊髓损伤发生在颈段脊髓，但绝大多数实验室研究采用的是胸段脊髓损伤（SCI）的动物模型。此外，由于大多数人类脊髓损伤是由钝性、非穿透性创伤（如机动车事故、运动损伤）引起的，其中脊髓受到移位的骨骼或软组织猛烈撞击，因此大多数SCI研究人员认为，最具临床相关性的损伤模型是脊髓受到快速挫伤的模型。¹ 因此，在新型治疗方法进入临床转化之前的临床前评估中，一个重要的步骤是评估其在颈段脊髓挫伤模型中的有效性。本文描述了一种采用Infinite Horizon脊髓损伤撞击器建立的单侧颈段脊髓挫伤模型的技术细节，以及该模型所产生的解剖学和行为学结果。

Sprague Dawley 大鼠在 C5 节段左侧进行单侧椎板切除术。为了优化损伤模型在生物力学、功能和组织学结果上的可重复性，我们采用 150 kdyn 的冲击力、22.5° 的冲击轨迹（动物旋转 22.5°）以及偏离中线 1.4 mm 的冲击位置对脊髓进行挫伤。通过圆筒直立实验、水平梯子实验、理毛实验和改良的 Montoya 阶梯实验评估长达 6 周的功能恢复情况，之后对脊髓进行组织学评估，以检测白质和灰质的保留情况。

本文介绍的损伤模型可向脊髓施加一致且可重复的生物力学力，这是任何实验性脊髓损伤（SCI）模型的重要特征。该操作导致脊髓外侧半部出现明确的组织学损伤，且主要局限于损伤同侧。动物对该损伤耐受性良好，但在损伤后的数周内会出现显著且持续的前肢功能缺陷。本文介绍的颈段单侧损伤模型可为研究人员在开展临床转化前评估潜在有效疗法提供参考。

方案

1. 准备：用于固定动物的框架和夹具设计

1. 用于固定动物的框架和夹具为定制设计，以适配 Infinite Horizon (IH) 脊髓损伤撞击器。
2. 框架底座为一块铝制平台，尺寸切割为 30.2 cm × 20.3 cm × 1.3 cm，以便适配 IH 设备标配的台面导轨支架（图 1A）。
3. 在平台上安装四个 Flexaframe 支撑脚板（Fisher Scientific，Toronto，ON），并使用八个 Flexaframe 支撑连接件组装八根 Flexaframe 支撑杆（Fisher Scientific，Toronto，ON，30.5 cm）（图 1B）。
4. 两个额外的 Flexaframe 支撑连接件安装在中间两根支撑杆上，用于固定定制的夹具安装座（图 1B）。
5. 通过保持一根水平杆位置不变，调节另一根水平杆的高度，从而确定动物脊髓相对于垂直方向的旋转角度（图 2）。
6. 该夹具长 35.6 mm，高 25.4 mm，钳口宽 7.6 mm，设计用于从 C4 至 C6 节段牢固夹持横突下方结构（图 1C）。有关夹具设计的更多细节已在 Choo et al., 2009 年的研究中描述。

2. 手术

1. 使用异氟烷（诱导浓度4%，维持浓度2%）在氧气（1 L/min）中对体重为300-350 g的雄性Sprague Dawley大鼠（Charles River Laboratories）进行麻醉。
2. 待动物达到麻醉平面后，将其固定于立体定位仪（Kopf, Tujunga, CA）中。
3. 为减少手术过程中的出血，在背部颈部手术区域周围肌肉内注射0.4 mL含肾上腺素的利多卡因（20 mg/mL；Bimeda-MTC Animal Health Inc., Cambridge, Ontario, Canada）。
4. 使用无菌手术刀（#15）从颅底开始向尾侧做一条4-5 cm长的背部正中切口。
5. 使用无菌Adson镊子钝性分离背部肌肉组织以暴露脊柱，并插入无菌Alm牵开器（Fine Science Tools, North Vancouver, BC）以保持肌肉分离状态。
6. 使用#15无菌手术刀从正中线开始，向外侧刮除覆盖C4-C7椎板的肌肉组织。
7. 为使夹具能够置于C4至C6横突下方，使用无菌手术刀（#15）在脊柱两侧附着于横突的肌肉上做切口。
8. 使用无菌细尖Friedman-Pearson咬骨钳（Fine Science Tools, North Vancouver, BC）小心去除左侧C5椎板，以暴露硬膜和脊髓。
9. 将一根直径为1.5 mm的金属棒插入动物双侧腋下，支撑起动物身体，从而轻微抬高脊柱，便于夹具插入。
10. 将无菌夹具的钳口安装至C4至C6节段的外侧横突上，并拧紧螺钉固定。
11. 移除Alm牵开器。

3. 脊髓损伤

1. 将夹具安装到动物身上后，将动物移至 IH 撞击器上。
2. 将夹具插入已固定在与水平方向成 22.5° 角的框架中间两根金属杆上的金属固定座中（图 2）。
3. 使用提供稳定高度调节的剪式千斤顶（VWR，密西沙加，安大略省）将动物抬升至平躺位置。
4. 通过在夹具顶部放置小型圆柱水平仪并拧紧螺丝，确保夹具处于水平状态。必须确保所有螺丝均已拧紧，整个装置稳固无任何松动。
5. 后续操作均在显微镜（Leica MZ8）下进行。
6. 使用 IH 撞击器上的垂直调节旋钮和两个水平调节旋钮，降低并调整撞击头（直径 15 mm，边缘圆滑），直至撞击头中心位于 C6 棘突顶点正上方。
7. 当撞击头居中后，将 y 轴调节旋钮顺时针旋转一又五分之二圈（1.4 mm），使撞击头向左侧横向移动，再调节 x 轴水平旋钮，将撞击头移至 C5 椎体中心位置。
8. 降低撞击头，使其刚好位于硬脊膜上方，以确认撞击头对准灰质的外侧半部分。
9. 将垂直调节旋钮旋转两圈，使撞击头抬高至硬脊膜上方 4 mm 处。
10. 使用棉签或棉棒确保撞击区域干燥。
11. 在程序中设定目标冲击力为 150 kdyn，点击“开始实验”以触发撞击器。
12. 损伤完成后，用 5-0 薇乔缝线逐层缝合伤口。术前及术后两天内每日两次皮下注射布托啡诺（0.03 mg/kg SC，Temgesic；Schering-Plough Corporation，肯尼沃斯，新泽西州）和生理盐水（10 mL）。术后两周内每天观察两次动物状态，之后六周内每周观察一次。

4. 代表性结果

29只雄性Sprague Dawley大鼠（Charles River Laboratories），体重300-350 g，在150 kdyn的力设置下进行损伤造模。撞击针尖定位在中线外侧1.4 mm处，与垂直方向成22.5°角。实际平均作用力为155.55 ± 0.73 kdyn，平均位移为1512.72 ± 27.86 μm，速度为120.24 ± 0.52 mm/s（图3）。

行为结果测量

通过水平梯子试验、圆筒直立试验、理毛试验和改良的蒙托亚阶梯试验评估功能恢复情况¹。动物在损伤前进行训练，并在损伤后2、4和6周进行评估。在整个实验期间，前肢功能均存在显著损伤。

水平梯测试。 在损伤前，动物在穿越间距不规则的水平梯时，同侧前肢的错误率仅为 4.75 ± 0.73%。损伤后，动物前肢错误率显著升高。损伤后 2、4 和 6 周时，同侧前肢的错误率分别为 26.97 ± 2.92%、26.23 ± 2.84% 和 22.06 ± 2.05%（图 4A）。重要的是，该测试中前肢功能障碍持续了 6 周之久。

圆筒直立实验。 脊髓损伤（SCI）后，动物在探索过程中使用同侧前肢（左肢或双侧）的百分比显著下降。损伤前，动物使用同侧前肢的比例为 75.12 ± 2.25%；损伤后 2 周为 8.59 ± 1.80%，4 周时为 14.25 ± 2.65%，6 周时为 11.76 ± 2.66%（图 4B）。

改良的 Montoya 楼梯实验。 损伤后，同侧前肢取回的食丸数量显著减少。损伤前，动物取回了 84.85 ± 2.88% 的食物奖励。然而，在损伤后 2、4 和 6 周，动物仅取回了 30.91 ± 4.03%、28.94 ± 4.38% 和 25.86 ± 3.09% 的食丸（图 4C）。

理毛实验。损伤后，理毛评分显著下降。脊髓损伤（SCI）后，同侧理毛评分在2周时为2.00 ± 0.17，4周时为1.83 ± 0.17，6周时为1.79 ± 0.11（图4D）。

组织学结果

白质与灰质保留。示例：在150 kdyn的力和22.5°的角度下发生的脊髓损伤° 和1.4 mm的外侧定位在 图5损伤导致同侧灰质和白质出现显著损害。皮质脊髓束和红核脊髓束均受到损伤，29只动物中有23只的实质损伤局限于同侧。白质和灰质损伤的纵向范围为头端2400，尾端2400。图6）。在添加切片时，对白质和灰质保留的“累积范围”进行粗略估计（2000 μ在损伤中心前后各 m 处，同侧的白质保留量仅为对侧的 51.8%，灰质保留量为对侧的 39.7%图6).

图1. Infinite Horizon 脊髓损伤撞击器。 A. Infinite Horizon 撞击器及整体装置示意图。B. 支架装置示意图。C. 用于固定颈椎横突的夹具特写图像。D. 夹具规格（单位：英寸）。建议公差 <0.002 英寸（Choo et al. 2009）。 点击此处查看高清大图。

图2. A. 示意图及相应的框架设置，用于实现脊髓旋转0°（中立位）或 B. 22.5°，侧向目标为1.4 mm。

图3. Infinite Horizon撞击器的代表性力和位移图。箭头指示撞击器尖端达到20 kdyn的时间点，以及位移记录开始的时刻。实际作用力从力-时间曲线的峰值读取，并计算相应的位移。下方的图形展示了一次典型的150 kdyn挫伤：A. 位移-时间图；B. 力-时间图。这些图形显示实际达到的作用力为152 kdyn，撞击器进入脊髓的位移测量值为1287 μm。点击此处查看大图。

图4. 150 kdyn 力量、22.5° 撞击角度及中线左侧 1.4 mm 定位条件下的行为学评估。 A. 水平梯测试。B. 圆筒直立测试。C. 改良Montoya阶梯测试。D. 理毛测试。同侧前肢相较于对侧前肢表现出显著且持续的功能障碍。

图5. 损伤脊髓从头端1600 μm至尾端1600 μm的代表性图像。

图6. 组织学评估。 A. 保留的白质和灰质百分比。损伤中心周围2000 μm范围内的组织大部分得以保留。B. 损伤中心2000 μm范围内的累计保留白质和灰质。同侧保留的白质和灰质显著少于对侧。点击此处查看大图。

讨论

本文中，我们描述了一种使用 Infinite Horizon (IH) 撞击器建立的颈段单侧挫伤模型，其撞击参数为 150 kdyn 的作用力、偏离垂直方向 22.5° 的角度，以及距中线 1.4 mm 的侧向定位。采用这些参数，我们能够在同侧前肢诱导出持续的行为功能缺陷，且实质组织损伤主要局限于同侧，其中可见对红核脊髓束、网状脊髓束、前庭脊髓束和皮质脊髓束预期走行区域造成显著损伤。该模型的建立经历了三个连续实验，分别确定了最佳损伤力、偏离中线的撞击位置以及旋转角度。首先，我们发现低于 150 kdyn 的损伤力无法产生足够且持续的功能缺陷。此外，当撞击头垂直撞击脊髓（即无旋转）时，力-时间曲线中频繁出现尖峰，提示撞击头可能碰触到椎管腹侧的骨性结构。许多动物在此条件下也未表现出严重或持续的功能障碍。与此一致的是，组织学分析显示，出现突然力尖峰的动物其脊髓实质损伤较轻，且位置极为偏外侧。因此，我们将动物进行旋转，使撞击方向偏离垂直中线 22.5°。通过使撞击头更接近垂直于脊髓的路径，我们解决了撞击头触碰椎管腹侧底板的问题，但观察到脊髓对侧出现了明显的实质损伤。最后，我们在 150 kdyn 的撞击力和 22.5° 角度条件下，将撞击头分别...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Infinite Horizon Impactor	精密系统与仪器	IH-0400
铝金属板	Metalsupermarlets.com	APT6061/500
Flexaframe 支撑脚板	Fisher Scientific	1466625Q
Flexaframe 支撑杆	Fisher Scientific	1466610GQ
Flexaframe 支撑连接件	Fisher Scientific	1466620Q
夹钳1	定制		Choo 等., 2009
金属支架	定制		见上文
撞击头	定制		直径：1.15 mm
立体定位仪	David Kopf Instruments	Model 900
圆柱水平仪	YIJIA TOOLS	YJ-SL0620
显微镜	Leica		型号：MZ8
实验室剪刀式千斤顶	VWR	12620-902