建立爱泼斯坦-巴尔病毒生长转化的淋巴母细胞样细胞系

摘要

我们介绍了一种利用EB病毒（Epstein-Barr virus）生成转化B细胞系的方法。同时，我们还展示了一种新颖的检测方法，可在感染后仅三天就识别出将要发生转化的B细胞。

摘要

B细胞感染EB病毒（EBV）后会引发增殖并随之发生永生化，从而建立淋巴母细胞样细胞系（LCL） 体外由于LCL潜伏感染EBV，因此可作为研究EBV潜伏感染以及病毒驱动的B细胞增殖和肿瘤发生的模型系统。¹LCL 已被用于多种免疫学检测中以呈递抗原^{2, 3}此外，LCL 可用于生成人单克隆抗体^{4, 5} 并在获取原始生物材料受限时提供一种潜在的无限来源^{6, 7}.

已有多种方法被用于建立LCL。早期的方法包括使用有丝分裂原，如植物血凝素、脂多糖⁸和美洲商陆有丝分裂原⁹，以提高EBV介导的永生化效率。近年来，其他研究者则使用环孢素A等免疫抑制剂来抑制T细胞对感染B细胞的杀伤作用^{7, 10-12}。

从EBV感染到建立细胞系需要相当长的时间，这促使人们需要更快、更可靠的方法来实现EBV驱动的B细胞生长转化。通过联合使用高滴度EBV和一种免疫抑制剂，我们能够持续地感染外周血中的B细胞，并成功转化生成淋巴母细胞样细胞系（LCL）。该方法仅需少量外周血单个核细胞，在体外（in vitro）进行感染后即可观察到细胞簇的形成。在T细胞免疫抑制剂FK506存在的情况下，EBV与CD23共同作用可促进转化。传统上，增殖性B细胞的生长通常通过在EBV感染约一周后显微镜下观察细胞微小簇来监测。数周后，LCL的细胞团块可肉眼可见。本文描述了一种检测方法，可在显微镜下尚未观察到细胞簇之前，早期判断EBV介导的生长转化是否成功。感染后第三天即可观察到CD23^hiCD58⁺细胞，提示转化成功。

方案

1. EBV 毒株制备

1. 采用无菌技术，将指数生长期的 B95-8 细胞（ATCC # CRL 1612；13）以 3 × 10⁵ 个细胞/ml 的密度传代培养于 75 cm² 组织培养瓶中。细胞培养于完全 RPMI 1640 培养基中，该培养基含有 10% 经热灭活的胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素（分别为 100 U/ml 和 100 μg/ml）以及两性霉素 B（0.5 μg/ml），在 37°C、5% CO₂ 条件下培养。
2. 48 小时后，将细胞重悬于新鲜的完全 RPMI 1640 培养基中，密度为 1 × 10⁶ 个细胞/ml。为诱导病毒产生，在标准 CO₂ 培养箱中用 20 ng/ml 的佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（TPA）刺激细胞 1 小时。随后用 RPMI 1640 洗涤细胞三次，以去除 TPA。
3. 将细胞重悬于原始体积的完全 RPMI 1640 培养基（来自步骤 1.2）中，并将培养瓶置于 CO₂ 培养箱中继续培养 96 小时。该方法已被证实可产生高滴度的感染性病毒颗粒⁶。
4. 在 4°C 条件下以 600 × g 离心 10 分钟，分离含 EBV 的细胞培养上清液与细胞。将上清液经 0.45 微米滤膜过滤，分装后于 -70°C 保存，可稳定保存一年以上。
   替代方法：可从 ATCC（VR-1492）获取含 EBV 的 B95-8 细胞上清液，并按照 ATCC 推荐的稀释比例使用。

2. 外周血单个核细胞（PBMC）的分离

1. 使用肝素化注射器或肝素化采血管从供体采集10 ml血液。在50 ml锥形管中，于室温下用20 ml PBS稀释血液。
2. 在稀释后的血液下方小心加入15 ml Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液。于室温下以225 × g 离心30分钟，不启用刹车。
3. 收集中间白膜层，并转移至新的50 ml锥形管中。用PBS补足体积至50 ml，于室温下以600 × g离心10分钟。
4. 倒去上清液。将沉淀细胞重悬于50 ml PBS中，于室温下以600 × g 离心10分钟进行洗涤。以相同方式再洗涤两次。
5. 将洗涤后的细胞重悬于1 ml完全RPMI培养基中。取5 μL细胞悬液，用台盼蓝稀释成1/10稀释液，使用血细胞计数板计数活细胞数。
6. 在25 cm²组织培养瓶中，用完全RPMI培养基调整体积，使细胞浓度达到2 × 10⁶/ml。

3. EBV 感染

1. 将FK506（AG Scientific）加入2.6中的细胞悬液，使其终浓度为20 nM。将培养瓶置于37°C的CO₂培养箱中孵育1小时。
2. 快速解冻一份EBV。从培养箱中取出培养瓶，按1/10稀释度将EBV加入细胞中。通常此稀释度可提供50-100的感染复数（MOI）。轻轻晃动培养瓶混匀，然后将其直立放回37°C的CO₂培养箱中。

请注意，用于预测成功结果的第4步为可选步骤。如果需要执行第4步，则需额外培养一管未感染的外周血单个核细胞（PBMC），浓度为2 × 10⁶ 个细胞/ml，作为对照。

4. 鉴定增殖中的细胞群体（可选步骤）

1. 配制 FACS 缓冲液：PBS + 5% FBS。4°C 保存。
2. 为第 4.6 步染色细胞，分别配制以下各 50 μL 体积的抗体混合液。抗体稀释应在含 1 mg/ml 小鼠 IgG（Sigma）的 FACS 缓冲液中进行，以抑制抗体的非特异性结合。
   1. 用 PE 标记的抗 CD23 抗体单染（1/50 稀释）
   2. 用 FITC 标记的抗 CD58 抗体单染（1/50 稀释）
   3. 用 PE-Cy5 标记的抗 CD19 抗体单染（1/50 稀释）
   4. 同时用抗 CD23、CD58 和 CD19 抗体三重染色（每种抗体均 1/50 稀释）
   5. 用与 CD23-PE 匹配的 PE 标记同型对照抗体单染（浓度与抗 CD23 抗体相同）
   6. 用与 CD58-FITC 匹配的 FITC 标记同型对照抗体单染（浓度与抗 CD58 抗体相同）
   7. 用与 CD19-PE-Cy5 匹配的 PE-Cy5 标记同型对照抗体单染（浓度与抗 CD19 抗体相同）
   8. 用三种同型对照抗体同时三重染色。
   将上述抗体混合液暂时避光保存于 4°C。
3. EBV 暴露后第三天，轻轻摇动培养瓶以获得更均匀的细胞悬液。从培养瓶中取出 2 ml 至 2 ml 离心管中。在室温下以 3000 rpm 离心 3 分钟。
4. 吸除上清液，将细胞重悬于 FACS 缓冲液中，浓度为 5 × 10⁶ 至 1 × 10⁷ 个细胞/ml。
5. 将八份 50 μl 的细胞悬液分别移入单独的离心管或 96 孔 V 型底板中。以 1500 × g 离心 3 分钟。
6. 弃去上清液，涡旋振荡离心管或板。将每管/孔中的细胞重悬于 50 μL 含适当抗体稀释液（按 4.2 步骤配制）的 FACS 缓冲液中。
7. 将离心管或板置于冰上避光孵育 30 分钟。以 3000 rpm 离心 3 分钟，去除上清液，加入 200 μL FACS 缓冲液。再次离心并去除上清液完成洗涤。重复此洗涤步骤共三次。
8. 将细胞重悬于 200 μL FACS 缓冲液中，使用流式细胞仪获取数据，每管采集 20,000 个事件。
9. 使用 WinMDI（适用于 PC 的 FACS 数据分析免费软件）分析数据。根据前向散射和侧向散射图选出生存细胞群体。然后，通过与抗 CD19 抗体匹配的同型对照抗体染色的细胞进行比较，选出生存细胞中 CD19⁺（B 细胞标志物）表达的细胞。以 CD23 荧光强度为横轴、CD58 荧光强度为纵轴，绘制 CD19⁺ 生存 B 细胞的散点图。通过与 EBV 暴露后经匹配同型对照抗体染色的细胞比较，确定 CD23⁺ 和 CD58⁺ 细胞。在 EBV 暴露的培养物中出现 CD23^hiCD58⁺ 细胞（图 2C），可预测 EBV 感染的生长转化细胞成功扩增。相比之下，当细胞未暴露于 EBV（图 2A）或暴露于非永生化型 EBV 毒株时（图 2B），不会出现 CD23^hiCD58⁺ 细胞。实验已证实 CD23^hiCD58⁺ 细胞可发生增殖并最终建立淋巴母细胞样细胞系（LCL）（14）。

5. LCL 的扩增与冷冻保存

1. 通过光学显微镜观察细胞：EBV 感染一周后，可在光学显微镜下观察到细胞簇。图 3 显示了培养瓶中早期显微细胞簇的一个示例（图 3B）。
2. 随着时间推移，显微镜下可见的细胞簇逐渐增大，最终在培养瓶中肉眼可见细胞团块。图 3C 显示了已建立的淋巴母细胞样细胞系（LCL）在光学显微镜下的较大细胞簇。
3. 细胞换液：在第 12 天，将培养瓶中的培养基体积加倍。随后使用完全 RPMI 培养基将培养体系扩大 2–3 倍。
4. 细胞换液频率应根据细胞生长速度确定。当培养基变黄时，通常需要按上述方法更换培养基，一般每周一次。然而，某些细胞系可能需要更频繁或更少的换液。在接下来的几周内，将培养体积逐步扩大至 75–100 ml。
5. 冷冻保存：冻存细胞时，在室温下以 600 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于预冷的冻存液中（含 90% FBS 和 10% 二甲基亚砜），细胞密度为 1 × 10⁷ 个细胞/ml。将冻存管置于液氮中保存。

6. 代表性结果：

成功的结局可通过 CD23^hiCD58⁺ 细胞的存在来预测。在暴露于 EBV 后第 3-4 天，活细胞中约有 2-3% 应具有此表型（图 2C）。暴露于 EBV 后观察到的其他 CD23⁺、CD23^-、CD58⁺ 和 CD58^- 细胞亚群增殖极少¹⁴。未感染的细胞（图 2A）以及暴露于来自 HH514-16 细胞的 EBV 的细胞（图 2B），由于该 EBV 为非永生化毒株，均未显示 CD23^hiCD58⁺ 细胞的存在。

您也可以通过光学显微镜观察细胞，以监测实验是否成功：如前所述，在EBV感染后一周内，可在光学显微镜下观察到培养瓶中出现少量细胞簇（图3B）。随着时间推移，细胞逐渐发育为LCL，显微镜下的细胞簇会变得更大（图3C），最终在培养瓶中可肉眼观察到细胞团块。

图1. 淋巴母细胞样细胞系的建立与冷冻保存流程。外周血通过Ficoll密度梯度离心分离，从已形成的密度梯度中获取位于白膜层的PBMC，先用FK506处理，随后加入EBV。经EBV处理的细胞在37°C、5% CO₂条件下培养，以建立并扩增淋巴母细胞样细胞系（LCL），用于后续冷冻保存。

图 2. 鉴定在暴露于 EBV 后预期发生增殖的一群 B 细胞亚群。在第 3 天收集未感染的 PBMC（A）或在 FK506 存在下暴露于来源于 HH514-16 细胞（B）或 B95-8 细胞（C）的 EBV 的 PBMC。细胞使用针对 CD19、CD23 和 CD58 的荧光染料偶联抗体进行染色。在圈选活细胞后，分析未感染（A）和 EBV 暴露（B 和 C）的 CD19⁺ B 细胞中 CD23 和 CD58 的表达情况。仅在暴露于具有转化能力的 EBV（来源于 B95-8 细胞）的细胞中观察到一群表达 CD58 且高水平表达 CD23（CD23^hiCD58⁺）的 B 细胞亚群。

图3. EBV感染细胞中细胞簇的可视化观察。PBMC经FK506处理后感染EBV。通过相差显微镜（10倍放大）在感染后一周观察未感染（A）和EBV暴露（B）的细胞。C显示五周龄的淋巴母细胞样细胞系。

讨论

本文所述方法利用供者的外周血，通过快速永生化和冻存技术生成淋巴母细胞样细胞系（LCL）。通过使用T细胞免疫抑制剂FK506以及高滴度的感染性病毒，我们能够促进外周血单个核细胞中EB病毒（EBV）感染的B细胞增殖。这些干预措施提高了该方法的效率，从而实现细胞的快速扩增，用于后续实验。

传统上，EBV感染后约一周，通过光学显微镜观察细胞簇的形成来监测生长转化^{6, 15}。然而，细胞聚集并非EBV介导的生长转化的特异性指标。我们此前已通过流式细胞术稳定地鉴定出增殖的细胞群体¹⁴，该方法可在B细胞感染EBV后第三天即准确且特异地判断转化是否成功。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素B	赛默飞世尔科技	BP 928-250
二甲基亚砜	西格玛奥德里奇	D 2650
热灭活胎牛血清	西格玛奥德里奇	F 4135
Ficoll Hypaque 淋巴细胞分离液	Mediatech公司	25-072
FK506	A.G Scientific	F 1030
小鼠血清来源的IgG	西格玛奥德里奇	I 8765
与PE偶联的小鼠抗人CD23抗体	BD生物科学	555711
与PE偶联的小鼠同型IgG1抗体	BD生物科学	554680
与FITC偶联的小鼠抗人CD58抗体	派瑞，赛默飞世尔科技	MA1-82159
与FITC偶联的小鼠同型IgG1抗体	BD生物科学	550616
与PE-Cy5偶联的小鼠抗人CD19抗体	BD生物科学	555414
与PE-Cy5偶联的小鼠同型IgG1抗体	Dako	X 0955
青霉素/链霉素	吉布科，生命技术公司	15140-122
RPMI 1640培养基	西格玛奥德里奇	R 8758
十四烷酰佛波醇乙酸酯（TPA）	Calbiochem	407952
FACS缓冲液（1×磷酸盐缓冲液 + 5%胎牛血清）