我们描述了一种用于解离结直肠癌（CRC）组织以获得可存活单细胞的方法，随后将这些单细胞捕获在定制的识别表面抗原的抗体微阵列上（DotScan CRC 微阵列）。通过使用荧光染料标记的单克隆抗体进行荧光多重检测，可对结合在微阵列上的细胞亚群进行表型分析。
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摘要
摘要
目前结直肠癌（CRC）的预后评估和分类依赖于整合了组织病理学和临床发现的分期系统。然而，在大多数结直肠癌病例中，细胞功能障碍是由大量突变引起的，这些突变会改变蛋白质的表达和翻译后修饰1。
已鉴定出多种细胞表面抗原（包括分化簇（CD）抗原）可作为结直肠癌（CRC）潜在的预后或转移性生物标志物。这些抗原是理想的生物标志物，因为它们的表达常随着肿瘤进展或其他细胞类型（如肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs））的相互作用而发生变化。
对于某些肿瘤类型，利用免疫组织化学（IHC）进行癌症亚型分类和预后评估已有充分依据2,3。然而，目前尚无任何单一的“标志物”在预后价值上超越临床病理分期，也未获得广泛认可以用于所有结直肠癌（CRC）病例的常规病理报告中。
一种较新的疾病表型预后分层方法依赖于利用多种“标志物”的表面蛋白谱。尽管使用iTRAQ等蛋白质组学技术进行肿瘤表达谱分析是发现生物标志物的有力工具，但其并不适用于诊断实验室的常规使用，且无法区分混合细胞群体中的不同细胞类型。此外，这些方法在对纯化后的质膜糖蛋白进行谱型分析时需要大量肿瘤组织。
在本视频中，我们介绍了一种利用DotScan结直肠癌抗体微阵列对解离的结直肠癌样本中活细胞进行表面蛋白质组分析的简便方法。该122种抗体微阵列包含一个标准的82种抗体区域，可识别多种谱系特异性白细胞标志物、黏附分子、受体以及炎症和免疫反应标志物5，同时包含一个卫星区域，用于检测40种可能对结直肠癌具有预后意义的标志物。细胞仅会结合到其表达相应抗原的抗体位点上。通过光学扫描确定的每点细胞密度，反映了表达该抗原的细胞比例、抗原的表达水平以及抗体的亲和力6。
对于结直肠癌组织或正常肠黏膜，光学扫描可反映混合细胞群体的免疫表型。随后可利用荧光多重技术，对芯片上捕获的特定目标细胞亚群进行分析。例如，Alexa 647 标记的抗上皮细胞黏附分子（EpCAM；CD326）是一种广谱上皮细胞分化抗原，用于检测结直肠癌细胞以及正常肠黏膜中的上皮细胞；而藻红蛋白标记的抗 CD3 抗体则用于检测浸润性T细胞7。DotScan 结直肠癌微阵列有望成为基于解剖学分期的结直肠癌诊断系统的替代性诊断原型。
方案
图1. 从结直肠癌手术样本制备活细胞悬液的工作流程。
1. 临床样本解离
所有样本均在方案编号 X08-164 下，经知情同意后，自澳大利亚新南威尔士州坎珀当的皇家阿尔弗雷德亲王医院（Royal Prince Alfred Hospital）和澳大利亚新南威尔士州康科德西区的康科德复员医院（Concord Repatriation Hospital）采集。
- 采集新鲜的结直肠癌（CRC）或腺瘤标本，以及距离肿瘤至少10 cm的正常肠黏膜组织。切除后，将样本置于pH 7.3的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中，4°C下保存不超过12小时。
- 遵循人类病原体相关安全规范，在II级生物安全柜中处理所有临床样本。使用两把手术刀片在培养皿中将组织切成约2 mm的立方体。
- 将肿瘤组织和正常组织分别置于Eppendorf管中，加入等体积含2%（v/v）IV型胶原酶（Worthington, Lakewood, NJ, USA）和0.....
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讨论
在本视频中，我们演示了如何以简单且半定量的方式使用 DotScan 抗体微阵列来研究来自结直肠癌组织的细胞群体的表面抗原谱型。
从组织中获得有活力的单细胞悬液对实验的成功至关重要，因为细胞在孵育过程中与抗体点牢固结合需要依赖能量的过程（例如抗原成帽和/或伪足形成），而死细胞则会在后续洗涤步骤中被去除。最初使用Ⅰ型胶原酶进行组织解离8，但随后被胶原酶4取代，后者对细胞膜的损伤更小，因其含有的蛋白酶污染物较少。这一改变未影响细胞得率、活力或结合模式。某些肿瘤及对照样本中的黏液会降低细胞得率并干扰细胞捕获。通过将解离后的细胞悬液保存在-80°C的10% DMSO/FCS中，可最大程度减少黏液的黏附性，推测是由于冻融过程改变了黏液的理化性质所致。9随后，所有样本在解离后均用含10% DMSO/FCS的冻存液保存，并快速解冻以制备活细胞悬液，确保结合模式一致。样本中存在 <存活率为50%或在对照/管家基因点（CD44/CD29）上显示结合不良的样本被排除在分析之外。
一些抗体克隆在结合硝酸纤维素膜时表现出亲和.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢皇家阿尔弗雷德亲王医院和康科德退伍军人医院解剖病理学实验室的工作人员采集了结直肠癌及正常肠黏膜的新鲜样本。本工作由新南威尔士州癌症研究所转化项目基金资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 汉克斯’ 平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | 以 25 mM Hepes (Sigma #H3375) 缓冲 |
| II级Airpure生物安全柜 | 西屋电气 | 1687-2340/612 | |
| 手术刀片 | 利文斯通 | 090609 | 100 个装 |
| 含 2 mM Hepes 的 RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| 胶原酶 IV型 | 沃辛顿生物化学 | 4188 | |
| 脱氧核糖核酸酶1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo 注射器（10 mL） | Terumo Medical Corp. | SS+10L | 100个装的一盒 |
| Filcon 滤膜（200 μm) | BD 生物科学 | 340615 | |
| Filcon 滤器（50 μm) | Filcon 滤膜（50 µm) | Filcon 滤膜（50 µm) Filcon 滤膜（50 µ340603 | |
| 胎牛血清 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 血细胞计数板 Technocolor Neubar | Hirschmann | 暂无内容 | |
| 光学显微镜 | 尼康仪器公司 | 尼康 TMS | |
| Cyrovial 管 | Greiner Bio-One | 121278 | |
| 冷冻保存管 | Nalge Nunc International | 5100-0001 | |
| DotScan抗体微阵列试剂盒 | Medsaic | 暂无内容 | |
| DotScan 微阵列洗涤槽 | Medsaic | 暂无内容 | |
| KimWipes | 金佰利公司 | 4103 | |
| 甲醛 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReader™ | Medsaic | 暂无内容 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| 2% 热灭活 AB 血清 | Invitrogen | 34005100 | |
| 藻类学–CD3-藻红蛋白偶联物 | 贝克曼库尔特公司 | ET386 | |
| AlexaFluor647 标记的 EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm 激光器，PE 采用 580 BP30 发射滤光片；633 nm 激光器，Alexa647 采用 670 BP30 发射滤光片 |
| 多实验查看器 v4.4 | TM4 微阵列软件套件 | 打开 – 开源软件（参考文献11） |
参考文献
- Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297(2002).
- Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D.
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Formal Correction: Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing
Posted by JoVE Editors on 7/03/2015. Citeable Link.
The author's email has been corrected in the publication of Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au