我们描述了一种用于解离结直肠癌（CRC）组织以获得可存活单细胞的方法，随后将这些单细胞捕获在定制的识别表面抗原的抗体微阵列上（DotScan CRC 微阵列）。通过使用荧光染料标记的单克隆抗体进行荧光多重检测，可对结合在微阵列上的细胞亚群进行表型分析。
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摘要
摘要
目前结直肠癌（CRC）的预后评估和分类依赖于整合了组织病理学和临床发现的分期系统。然而，在大多数结直肠癌病例中，细胞功能障碍是由大量突变引起的，这些突变会改变蛋白质的表达和翻译后修饰1。
已鉴定出多种细胞表面抗原（包括分化簇（CD）抗原）可作为结直肠癌（CRC）潜在的预后或转移性生物标志物。这些抗原是理想的生物标志物，因为它们的表达常随着肿瘤进展或其他细胞类型（如肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs））的相互作用而发生变化。
对于某些肿瘤类型，利用免疫组织化学（IHC）进行癌症亚型分类和预后评估已有充分依据2,3。然而，目前尚无任何单一的“标志物”在预后价值上超越临床病理分期，也未获得广泛认可以用于所有结直肠癌（CRC）病例的常规病理报告中。
一种较新的疾病表型预后分层方法依赖于利用多种“标志物”的表面蛋白谱。尽管使用iTRAQ等蛋白质组学技术进行肿瘤表达谱分析是发现生物标志物的有力工具，但其并不适用于诊断实验室的常规使用，且无法区分混合细胞群体中的不同细胞类型。此外，这些方法在对纯化后的质膜糖蛋白进行谱型分析时需要大量肿瘤组织。
在本视频中，我们介绍了一种利用DotScan结直肠癌抗体微阵列对解离的结直肠癌样本中活细胞进行表面蛋白质组分析的简便方法。该122种抗体微阵列包含一个标准的82种抗体区域，可识别多种谱系特异性白细胞标志物、黏附分子、受体以及炎症和免疫反应标志物5，同时包含一个卫星区域，用于检测40种可能对结直肠癌具有预后意义的标志物。细胞仅会结合到其表达相应抗原的抗体位点上。通过光学扫描确定的每点细胞密度，反映了表达该抗原的细胞比例、抗原的表达水平以及抗体的亲和力6。
对于结直肠癌组织或正常肠黏膜，光学扫描可反映混合细胞群体的免疫表型。随后可利用荧光多重技术，对芯片上捕获的特定目标细胞亚群进行分析。例如，Alexa 647 标记的抗上皮细胞黏附分子（EpCAM；CD326）是一种广谱上皮细胞分化抗原，用于检测结直肠癌细胞以及正常肠黏膜中的上皮细胞；而藻红蛋白标记的抗 CD3 抗体则用于检测浸润性T细胞7。DotScan 结直肠癌微阵列有望成为基于解剖学分期的结直肠癌诊断系统的替代性诊断原型。
方案
图1. 从结直肠癌手术样本制备活细胞悬液的工作流程。
1. 临床样本解离
所有样本均在方案编号 X08-164 下，经知情同意后，自澳大利亚新南威尔士州坎珀当的皇家阿尔弗雷德亲王医院（Royal Prince Alfred Hospital）和澳大利亚新南威尔士州康科德西区的康科德复员医院（Concord Repatriation Hospital）采集。
- 采集新鲜的结直肠癌（CRC）或腺瘤标本，以及距离肿瘤至少10 cm的正常肠黏膜组织。切除后，将样本置于pH 7.3的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中，4°C下保存不超过12小时。
- 遵循人类病原体相关安全规范，在II级生物安全柜中处理所有临床样本。使用两把手术刀片在培养皿中将组织切成约2 mm的立方体。
- 将肿瘤组织和正常组织分别置于Eppendorf管中，加入等体积含2%（v/v）IV型胶原酶（Worthington, Lakewood, NJ, USA）和0.1%（w/v）牛胰脱氧核糖核酸酶I（DNAse I; Sigma-Aldrich）的RPMI 1640培养基，在37°C孵育60分钟，期间轻柔混匀数次。
- 使用10 mL注射器的推杆将部分消化的组织通过细金属网筛过滤，并用HBSS冲洗细胞。
- 将所得细胞悬液依次通过200 μm和50 μm的Filcon滤膜（BD Biosciences），以去除细胞团块。此系列过滤步骤可有效去除大部分DNA、黏液及细胞聚集体。
- 将细胞悬液在20°C下以400 × g离心5分钟。
- 将细胞沉淀重悬于含10%二甲基亚砜（DMSO）的热灭活胎牛血清（FCS）中，缓慢冷冻于冻存管，随后置于-80°C保存。冷冻过程有助于减少样本中的黏液并裂解红细胞。
2. 细胞捕获的样品制备
- 在37°水浴中快速解冻样本，并将细胞重悬于10 mL HBSS中以去除DMSO。
- 在20°条件下，以410 × g离心细胞悬液5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 μL HBSS中。
- 室温下用0.1% (w/v) DNA酶I处理样本20分钟。
- 取10 μL细胞悬液与等体积台盼蓝混合，将10 μL混合液加入血细胞计数板。在100倍放大倍率的光学显微镜下计数活细胞（因排斥台盼蓝而呈透明状），死细胞则摄取染料而着色。微阵列细胞捕获至少需要4 × 106个活细胞。
- DNA酶处理后，将细胞悬液重悬于10 mL HBSS中，在20°条件下以410 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于RPMI 1640培养基中，终体积为200 μL。
3. 抗体微阵列细胞捕获
- 将DotScan抗体微阵列浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中约20秒，以润湿硝酸纤维素区域。用折叠的Kimwipe小心擦拭微阵列的玻璃边缘，避免触碰硝酸纤维素区域。
- 向微阵列孵育槽中加入水，以提供湿润环境。将微阵列放入孵育槽中，并用移液器将RPMI 1640培养基中的细胞悬液滴加到湿润的硝酸纤维素区域上。在硝酸纤维素区域的每个角落滴加液滴，以确保细胞均匀分布。
- 将微阵列在37°C下孵育1小时。孵育过程使细胞沉降并与微阵列上的抗体接触。表达与所接触抗体相对应的表面抗原的细胞将被捕获。
- 孵育结束后，将微阵列轻轻且垂直地浸入三个盛有至少15 mL PBS的槽中，以洗去未结合的细胞（每次洗涤20秒）。
- 用PBS配制3.7%（w/v）的甲醛溶液，用于通过交联固定细胞和抗体。轻轻移取约1 mL溶液覆盖微阵列的硝酸纤维素区域，在室温下孵育20分钟。
- 随后将微阵列依次浸入三份PBS（每份15 mL，每次30秒）中，以洗去多余的甲醛。
- 用Kimwipe擦拭玻片的边缘和背面，并在硝酸纤维素区域保持湿润的状态下，使用DotScan扫描仪对微阵列进行扫描。光学扫描可提供混合细胞群体的抗原表达模式，例如结直肠癌细胞、白细胞及其他肿瘤间质细胞。
4. 荧光多重检测
- 从扫描仪中取出微阵列，加入200 μL封闭缓冲液（2% w/v BSA，2%热灭活人AB血清，PBS，pH 7.3），在室温下于微阵列托盘中孵育20分钟。
- 在覆盖铝箔的Eppendorf管中配制多重检测溶液：20 μL藻红蛋白-抗CD3抗体（Beckman Coulter，Gladesville，NSW，澳大利亚，#IM12824；终稀释倍数1/7.5）、10 μL Alexa Fluor 647-抗EpCAM抗体（Biolegend，San Diego，CA，美国；稀释倍数1/15）、2 μL热灭活人AB血清（Sigma-Aldrich，Castle Hill，NSW，澳大利亚）以及118 μL封闭缓冲液。
- 吸除微阵列上多余的封闭缓冲液，将多重检测溶液用移液器加至硝酸纤维素区域，并均匀铺展。室温避光孵育30分钟。
- 将微阵列垂直浸入三槽新鲜PBS（每槽15 mL）中，每次30秒。
- 让微阵列在避光条件下自然干燥，并置于4°C的载玻片盒中保存。微阵列可在避光条件下保存长达3个月而不损失荧光信号。
- 使用Typhoon FLA 9000扫描仪（GE Healthcare，Rydalmere，NSW，澳大利亚）扫描干燥的微阵列，分辨率为50（PE检测使用532 nm激光和580 BP30发射滤光片；Alexa 647检测使用633 nm激光和670 BP30发射滤光片）。扫描时将微阵列的硝酸纤维素面朝下放置于玻璃扫描托盘上。
- 将荧光图像保存为TIFF文件，并使用Photoshop将图像尺寸设置为17 x 25 cm，分辨率为72像素/cm。将图像导入DotScan分析软件以分析各点的信号强度。
- DotReader可捕获点结合模式的数字图像，并在8位灰度标度（1–256 U）上量化每个抗体点上的细胞结合密度。对于具有相应免疫球蛋白同型的抗体，需从其结合值中扣除偶发的非特异性同型对照结合信号。每个微阵列的点荧光强度均以最强信号点为100%进行归一化处理。信号/斑点强度记录于.xml文件（原始数据）中，或以柱状图形式呈现在.pdf文件（最终报告）中。
- 微阵列热图及层次聚类分析使用TM4微阵列软件套件中的MultiExperiment Viewer（MeV）4.4版本（http://www.tm4.org/mev.html）完成。基于背景校正后的数据，采用MeV软件进行完全连锁聚类分析，相似性度量使用欧氏距离。采用双尾Student t检验（假设方差相等）评估结果的统计学显著性。
5. 代表性结果：
DotScan 芯片实验的结果应在重复芯片之间显示出一致的细胞结合模式。强信号点结合（CD44/CD29）可使网格准确覆盖芯片区域。图2展示了细胞捕获和多重检测的理想示例。图3展示了一些在细胞捕获过程中常见的问题及可能的解决方案。
通过测量以1至256灰度级表示的点阵强度，可对微阵列细胞结合结果进行定量分析。图4展示了来自58例手术切除的结直肠癌（CRC）样本的数值数据，这些样本经EpCAM-Alexa 647抗体染色，以热图形式呈现并进行层次聚类分析。尽管样本数量有限，相同分期的结直肠癌倾向于聚类在同一组中。
图 2. 临床结直肠癌肿瘤（澳大利亚临床病理分期，ACP B1期）的细胞结合模式。（a）DotScan抗体图示，显示重复微阵列左半部分的抗体位置（已标出）。上部区域包含DotScan白血病微阵列原有的82种抗体。额外添加了40种抗体，对应文献中发现表达上调的特定表面抗原，构成结直肠癌“卫星”微阵列。下部区域为同型对照抗体。（b）结直肠癌细胞与微阵列结合的光学图像。（c）CD3荧光图像，显示T细胞。（d）EpCAM荧光图像，显示结直肠癌细胞。
图3. DotScan 结果不佳的示例及可能的解决方案。（a）细胞结合率低；解决方案：确保阵列上至少有 4×10⁶ 个活细胞。（b）同型对照结合及非特异性细胞结合；解决方案：在样品与微阵列孵育前，加入热灭活的人 AB 血清，以减少同型对照结合。偶尔，结直肠癌（CRC）样本会出现少量细胞与硝酸纤维素膜的非特异性结合，但不会显著影响结果。（c）孵育过程中硝酸纤维素膜干燥；解决方案：确保样品覆盖整个硝酸纤维素区域，并将微阵列置于水平面上孵育。（d）高背景干扰；解决方案：确保孵育后对微阵列进行充分洗涤。
图4. DotScan分析软件生成的柱状图，表示在1至256灰度范围内细胞结合密度。坐标轴上的数字代表CD抗原。其他缩写包括：TCR，T细胞受体；κ、λ，免疫球蛋白轻链；sIg，表面免疫球蛋白；DCC，结直肠癌缺失蛋白；EGFR，表皮生长因子受体；FAP，成纤维细胞活化蛋白；HLA-A,B,C、HLA-DR，分别为人类白细胞抗原A、B、C和DR；MICA，主要组织相容性复合物I类链相关蛋白A；MMP-14，基质金属肽酶14；PIGR，多聚免疫球蛋白受体；TSP-1，血小板反应蛋白-1；Mabthera，人源化抗CD20抗体。点击此处查看大图。
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讨论
在本视频中，我们演示了如何以简单且半定量的方式使用 DotScan 抗体微阵列来研究来自结直肠癌组织的细胞群体的表面抗原谱型。
从组织中获得有活力的单细胞悬液对实验的成功至关重要，因为细胞在孵育过程中与抗体点牢固结合需要依赖能量的过程（例如抗原成帽和/或伪足形成），而死细胞则会在后续洗涤步骤中被去除。最初使用Ⅰ型胶原酶进行组织解离8，但随后被胶原酶4取代，后者对细胞膜的损伤更小，因其含有的蛋白酶污染物较少。这一改变未影响细胞得率、活力或结合模式。某些肿瘤及对照样本中的黏液会降低细胞得率并干扰细胞捕获。通过将解离后的细胞悬液保存在-80°C的10% DMSO/FCS中，可最大程度减少黏液的黏附性，推测是由于冻融过程改变了黏液的理化性质所致。9随后，所有样本在解离后均用含10% DMSO/FCS的冻存液保存，并快速解冻以制备活细胞悬液，确保结合模式一致。样本中存在 <存活率为50%或在对照/管家基因点（CD44/CD29）上显示结合不良的样本被排除在分析之外。
一些抗体克隆在结合硝酸纤维素膜时表现出亲和...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢皇家阿尔弗雷德亲王医院和康科德退伍军人医院解剖病理学实验室的工作人员采集了结直肠癌及正常肠黏膜的新鲜样本。本工作由新南威尔士州癌症研究所转化项目基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 汉克斯’ 平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | 以 25 mM Hepes (Sigma #H3375) 缓冲 |
| II级Airpure生物安全柜 | 西屋电气 | 1687-2340/612 | |
| 手术刀片 | 利文斯通 | 090609 | 100 个装 |
| 含 2 mM Hepes 的 RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| 胶原酶 IV型 | 沃辛顿生物化学 | 4188 | |
| 脱氧核糖核酸酶1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo 注射器（10 mL） | Terumo Medical Corp. | SS+10L | 100个装的一盒 |
| Filcon 滤膜（200 μm) | BD 生物科学 | 340615 | |
| Filcon 滤器（50 μm) | Filcon 滤膜（50 µm) | Filcon 滤膜（50 µm) Filcon 滤膜（50 µ340603 | |
| 胎牛血清 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 血细胞计数板 Technocolor Neubar | Hirschmann | 暂无内容 | |
| 光学显微镜 | 尼康仪器公司 | 尼康 TMS | |
| Cyrovial 管 | Greiner Bio-One | 121278 | |
| 冷冻保存管 | Nalge Nunc International | 5100-0001 | |
| DotScan抗体微阵列试剂盒 | Medsaic | 暂无内容 | |
| DotScan 微阵列洗涤槽 | Medsaic | 暂无内容 | |
| KimWipes | 金佰利公司 | 4103 | |
| 甲醛 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReader™ | Medsaic | 暂无内容 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| 2% 热灭活 AB 血清 | Invitrogen | 34005100 | |
| 藻类学–CD3-藻红蛋白偶联物 | 贝克曼库尔特公司 | ET386 | |
| AlexaFluor647 标记的 EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm 激光器，PE 采用 580 BP30 发射滤光片；633 nm 激光器，Alexa647 采用 670 BP30 发射滤光片 |
| 多实验查看器 v4.4 | TM4 微阵列软件套件 | 打开 – 开源软件（参考文献11） |
参考文献
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勘误
Formal Correction: Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing
Posted by JoVE Editors on 7/03/2015. Citeable Link.
The author's email has been corrected in the publication of Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au
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