本文介绍了在原代培养中获得富集的小鼠少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的方法，这些细胞可分化为成熟的少突胶质细胞（OLs）。此外，本文还描述了一种通过将小鼠OPCs接种于小鼠背根神经节神经元（DRGNs）的神经突网络上，以建立小鼠髓鞘形成共培养体系的技术。
本文内容
摘要
摘要
阐明少突胶质细胞（OL）发育背后的分子机制，不仅对于深化我们对OL生物学的认识至关重要，而且有助于理解多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）等脱髓鞘疾病的发病机制。细胞发育通常通过原代细胞培养模型进行研究。原代细胞培养通过提供一个可控的环境，排除体内存在的各种干扰变量，从而促进对特定细胞类型的评估 在体内尽管源自大鼠的少突胶质细胞（OL）培养已为OL生物学研究提供了大量见解，但建立小鼠OL培养体系的类似尝试却面临重大障碍。开发培养小鼠原代OL的方法对于充分利用现有的转基因小鼠品系至关重要。
已报道多种从啮齿类动物组织中提取少突胶质前体细胞（OPC）的方法，包括神经球衍生法、差异贴壁纯化法以及免疫纯化法1-3。尽管许多方法均能取得成功，但大多需要较长的培养周期和/或昂贵的设备与试剂。为克服这些问题，优选采用McCarthy与de Vellis最初描述的方法的改良版，用于从小鼠组织中纯化OPC2。该方法通过物理分离的方式，从新生啮齿类动物大脑皮层来源的混合胶质细胞培养物中分离出OPC。最终获得高纯度的OPC群体，可进一步分化为富含少突胶质细胞（OL）的培养体系。该方法的优势在于培养周期相对较短，且无需添加生长因子或免疫筛选抗体。
尽管在纯化培养体系中研究少突胶质细胞（OL）发育机制具有重要信息价值，但其并不能为评估髓鞘形成提供最具生理相关性的环境。将少突胶质细胞与神经元共培养，有助于揭示调控少突胶质细胞介导的轴突髓鞘化的分子基础。在多数少突胶质细胞/神经元共培养研究中，背根神经节神经元（DRGNs）已被证明是首选的神经元类型。由于其易于提取、污染细胞极少，并能形成密集的神经突网络，因此非常适合与少突胶质细胞进行共培养。尽管已有使用大鼠/小鼠髓鞘化异种共培养体系的研究发表4-6，但尚未有从出生后小鼠组织建立此类少突胶质细胞/DRGN髓鞘化共培养体系的方法报道。本文中，我们详细介绍了有效建立此类共培养体系的方法，并提供了预期结果的示例。这些方法适用于探讨与少突胶质细胞发育及髓鞘化功能相关的问题，是神经科学领域中的有力工具。
方案
伦理声明
本研究中使用的小鼠均按照加拿大动物护理委员会（CCAC）的指南进行饲养和管理。实验的伦理审批已由渥太华大学动物护理委员会根据协议编号OGH-119批准。
1. 解剖——用于少突胶质前体细胞提取的新生小鼠大脑皮层
- 按照机构指南处死 P0-P2 小鼠。
- 解剖大脑并置于含有冰冻无抗生素MEM的培养皿中。
- 将培养皿转移至解剖显微镜下。
- 将脑组织背侧朝上放置，使用手术刀沿每侧皮层最内侧边缘进行矢状方向的浅层切口（图1a）。该切口仅需穿透脑膜层，以利于后续去除脑膜。
- 使用尖头镊子从侧面剥离脑膜。若操作仔细，该层可完整剥离。此步骤中需去除嗅球。
- 将脑腹侧朝上，于大脑皮层与间脑腹侧交界处进行深部矢状切口（图1b）。
- 将大脑背侧朝上，从内侧向外侧方向分离皮层与中脑组织（图1c，c'）。此步骤中需清除残留的脑膜组织。
- 将每个皮层切成约4块，然后轻轻转移至含有15 mL圆底离心管中 350 μL 每只小鼠脑组织加入 MEM，处理过程中将离心管置于冰上，直至所有小鼠样本处理完毕。
- 对剩余小鼠重复步骤 1.1–1.8。
2. 新生儿大脑皮层的解离及混合胶质细胞培养的维持
注意：在后续所有步骤中，应避免将气泡引入细胞悬液。
- 将含有新鲜解剖脑组织的15 mL锥形管放入37°C水浴中孵育3分钟。
- 将脑组织转移至无菌组织培养罩内。
- 用P1000移液枪头轻轻吹打切碎的皮质组织，以获得更小的组织片段。当组织中无较大脑组织块可阻碍悬液顺利通过枪头时，停止吹打。
- 每只脑组织加入75 μL OPC木瓜蛋白酶溶液至锥形管中。OPC木瓜蛋白酶溶液使用前需在37°C预热20分钟。
- 在37°C水浴中孵育20分钟。每隔约2分钟，轻轻倒置管子一次，以防止组织聚集。在此期间，向每个聚-L-赖氨酸（PLL）包被（1 mg/mL）的T25培养瓶（每只小鼠脑组织对应一个培养瓶）中加入5 mL混合胶质细胞培养基，并置于37°C、8.5% CO2的组织培养箱中。
- 20分钟后，将组织悬液重新移回无菌罩内，并向每管中加入2 mL混合胶质细胞培养基。室温静置10分钟，以使OPC木瓜蛋白酶溶液失活。
- 将组织悬液分装至5 mL塑料离心管中。管数应与解剖的脑组织数量一致，每管约含2.5 mL悬液。
- 使用无菌火焰抛光的玻璃巴斯德吸管，轻轻吹打每管中的组织。初始吹打速度宜慢，随着组织解离逐渐加快。吹打约10–15次，具体次数可根据消化效果适当调整。
注意： trituration 不足会导致组织解离不充分，而过度 trituration 会负面影响细胞活力。操作过程中应避免将气泡引入溶液，因为这会严重降低细胞活力。
- 当悬液中不再有可见的组织团块时，将其转移至一个50 mL锥形管中，每只小鼠脑组织加入4 mL混合胶质细胞培养基（i.e.，4只小鼠脑 = 16 mL混合胶质细胞培养基）。
- 轻轻倒置50 mL锥形管，并对剩余的5 mL管重复此操作。
- 将混合后的细胞悬液分装至15 mL锥形管中（每管约6.5 mL）。15 mL锥形管的数量应与解剖的小鼠脑数量一致。
- 以1200 rpm（约300 g）离心5分钟。
- 小心吸除上清液，并向每支15 mL锥形管中加入1 mL预热的混合胶质细胞培养基。
- 使用P1000移液器枪头缓慢重悬沉淀，注意避免产生气泡。将每管中的细胞悬液加入已预先平衡的PLL包被T25培养瓶中，使培养基总体积达到6 mL。
- 将培养瓶置于组织培养孵箱中孵育3–4小时，使细胞贴附于PLL基质。通过移液更换全部培养基，向每个培养瓶中加入6 mL新鲜的混合胶质细胞培养基。此步骤可去除大部分因吹打造成的碎片，提高培养细胞的存活率。如需进行少突胶质细胞/背根神经元共培养，请参见本方案第3节。
- 培养3天后，进行2/3体积的换液操作，即移除4 mL培养基，并补充4 mL新鲜的混合胶质细胞培养基。此时，培养瓶底部应开始形成星形胶质细胞单层。
- 第6天，再次进行2/3体积换液，并向培养瓶中添加胰岛素，使其终浓度为5 μg/mL。此时应可清晰观察到星形胶质细胞单层，其上少突胶质前体细胞正在增殖。
3. DRGN 的分离
注意：为制备少突胶质细胞/背根神经节神经元（OL/DRGNs）共培养体系，背根神经节神经元（DRGNs）的培养应于混合胶质细胞培养建立后的次日进行。两种培养物需独立培养，并在9-10天后合并。
- 根据机构指南处死 P5-P10 小鼠。
- 取出脊柱并转移至洁净的培养皿中。
- 尽可能去除脊柱上的肌肉和骨骼组织（图 1d, d'），以利于背根神经节（DRGs）的解剖分离。
- 将去除了多余组织的脊柱转移至新的培养皿中，腹面朝上。使用解剖剪从尾端开始，沿中线纵向剪开脊柱。
- 用两把镊子轻轻撑开脊柱，暴露脊髓。
- 背根神经节位于脊髓下方及外侧。使用尖头镊子小心地将 DRGs 取出，避免损伤神经节组织（图 1e）。
- 将分离出的 DRGs 转移至另一新培养皿中的冰上预冷的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS，不含抗生素）中。操作者应力求每只小鼠获取约 40 个 DRGs（图 1f）。
- 完成 DRGs 提取后，修剪掉过长的神经根（图 1g, g'），以尽量减少污染细胞（如胶质细胞、成纤维细胞）进入培养体系。
- 将 DRGs 转移至含有 500 μL 冰上预冷 HBSS 的 1.5 mL 离心管中。
- 在 4°C 条件下以 1200 rpm（约 300 g）离心 5 分钟，使 DRGs 沉淀。
- 将离心管转移至无菌细胞培养操作台，吸除管内 HBSS。
- 加入 500 μL 预热（37°C 水浴 20 分钟）的 DRG 木瓜蛋白酶溶液，将离心管置于 37°C 水浴中孵育 10 分钟，每 2 分钟轻轻颠倒混匀一次，防止组织聚集。
- 重复步骤 3.10。
- 吸除木瓜蛋白酶溶液，加入 500 μL 预热（37°C 水浴 20 分钟）的胶原酶 A 溶液，于 37°C 水浴中孵育 10 分钟，每 2 分钟颠倒混匀一次。
- 重复步骤 3.10。
- 吸除上清液，加入 1 mL DRGN 培养基，轻轻颠倒混匀数次。
- 重复步骤 3.10。
- 重复步骤 3.16。
- 使用牛血清白蛋白（BSA）包被无菌火焰抛光的玻璃巴斯德吸管：反复吹吸含 0.25% BSA 的 HBSS 溶液数次。BSA 包被可防止 DRGs 黏附于玻璃吸管管壁。
- 先用 BSA 包被的吸管轻柔吹打 DRGs，待组织团块开始解离后逐渐增加吹打强度。通常吹打约 10–15 次，但具体次数取决于消化程度及每管中 DRGs 的数量。
- 解离完成后，将细胞悬液通过 50 μm 滤膜过滤至含有 7 mL DRGN 培养基的无菌培养皿中。过滤可去除大部分碎片，但此步骤并非关键。
- 将培养皿置于 8.5% CO2 环境中孵育约 1.25 小时。
- 在孵育期间，于 24 孔板中用 LN2（10 μg/mL 溶于 PBS）包被数片 12 mm 盖玻片。
- 孵育结束后，在明场显微镜下观察培养皿。DRGNs 表现为胞体较大、相位较暗的细胞。轻轻晃动培养皿以使贴壁的 DRGNs 脱落。
注意：许多污染细胞会牢固地黏附在培养皿上，从而富集细胞悬液中的背根神经节神经元（DRGNs）。
- 将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。用4 mL DRGN培养基轻轻冲洗培养皿，以收集任何残留的DRGNs。将额外的4 mL培养基也转移至锥形管中。
- 以1200 rpm（约300 g）离心5分钟。
- 吸除上清液，并将沉淀重悬于500 μL新鲜DRGN培养基中。
- 使用血细胞计数板计算获得的DRGN数量。务必仅计数DRGNs，而非其他细胞类型。DRGNs可通过其较大的球形胞体进行识别。
- 在1 mL DRGN培养基中，将30,000–50,000个DRGNs接种至每张LN2包被的盖玻片上，并于8.5% CO2条件下置于37°C组织培养孵育箱中过夜。
- 次日早晨，通过将DRGN培养基完全更换为不含CNTF的OL培养基（终浓度为1%青霉素-链霉素和10 μM FuDR），进行全量换液。
- 在第3天和第5天，使用与步骤3.30相同的培养基进行3/4体积的换液。
- 在第7天，使用不含CNTF、Pen/Strep和FuDR的OL培养基进行全量换液。
- 到第9天，DRGNs应已形成广泛的神经突网络，此时可准备与OPCs进行共培养。
4. 从混合胶质细胞培养物中纯化少突胶质前体细胞以建立少突胶质细胞富集培养物或少突胶质细胞/背根神经节神经元共培养体系
- 在混合胶质细胞培养的第9天，将培养瓶转移至含5% CO₂的摇床中2 组织培养孵育箱。将锥形瓶放置在空的 T25 培养瓶上方，以防止轨道摇床产生的热量对混合胶质细胞培养物造成不利影响。让培养物在此新孵育箱中平衡 1 小时。
- 待培养瓶平衡后，以50 rpm振摇45分钟。此步骤的目的是去除单层细胞中松散附着的污染细胞。
- 将细胞转移至组织培养操作台，从培养瓶中移除所有培养基，更换为 4 mL 新鲜混合胶质细胞培养基，添加 5 μg/mL 胰岛素
- 将烧瓶放回摇床，平衡约3小时。
- 待培养瓶平衡后，将其牢固固定在轨道摇床，于220 rpm条件下振荡培养约16小时（过夜）。
- 次日早晨，若少突胶质细胞（OLs）需在无背根神经元（DRGNs）的条件下培养（即，富含OL的培养），用LN2包被数个无菌的12 mm盖玻片（10 μg/mL 在PBS中孵育1小时。将盖玻片转移至24孔板中，用PBS洗涤，随后用OL培养基洗涤。每孔加入1 mL OL培养基，并在8.5% CO₂条件下平衡2.
- 将10 cm组织培养皿在5% CO₂中平衡2 孵育30分钟。每2个培养瓶需要准备1个培养皿。这些培养皿将用于通过差异贴壁法富集悬浮的少突胶质前体细胞（OPCs）。
- 30分钟平衡期结束后，将振荡烧瓶中的培养基转移至培养皿中。每个培养皿应加入来自2个烧瓶的培养基，相当于每10 cm培养皿加入约8 mL细胞悬液。
- 在5% CO₂条件下孵育培养皿2 孵育30分钟，在15分钟时轻轻晃动培养皿。此操作有助于防止少突胶质前体细胞（OPCs）黏附于10 cm培养皿底部。
- 孵育完成后，在明场下观察培养皿。少突胶质前体细胞（OPCs）表现为小的细胞团簇，通常由3–5个细胞组成，有时会形成类似神经球的大团块。许多非少突胶质细胞系的细胞应已牢固贴附于培养皿底部。轻轻晃动培养皿以分离松散贴附的OPCs，并将每块培养皿中的细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
- 以1200 rpm（约300 g）离心5分钟。
- 用 P1000 移液枪枪头将沉淀重悬于 1 mL OL 培养基中，随后用 P200 移液枪枪头进行重悬。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 对于富集OL培养物，将25,000 - 50,000个OPC接种至每张12 mm LN2包被的盖玻片上，加入终体积为1 mL的OL培养基。
- 对于少突胶质细胞/背根神经节神经元（OL/DRGN）共培养，在第[3]部分的DRGN上进行完全的OL培养基（不含CNTF）换液，并轻柔地加入50,000个来自富集少突胶质前体细胞（OPC）的细胞悬液。添加OPC时应注意避免扰动DRGN的神经突网络。
- 将培养物置于 37°C 8.5% CO₂ 培养箱2，并避免在固定前移除。小鼠少突胶质前体细胞（OPCs）对pH值变化敏感，从培养箱中取出会改变少突胶质细胞培养基的pH值。另外需要注意的是，加入dH₂O2在细胞培养物周围的空孔中加入 O，可防止培养基蒸发，从而减少 OL 培养基中溶质浓度的波动，为少突胶质前体细胞（OPCs）提供更稳定的培养环境。
5. 免疫荧光显微镜样品的培养物处理
- 用 -20°C 的 100% 甲醇固定细胞 10 分钟，或用室温的 3% 多聚甲醛固定 15 分钟。
- 用 0.1% Triton-X-100 处理盖玻片 10 分钟以通透细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并在含 10% 小鼠血清的封闭液中 37°C 封闭 1 小时。
- 将盖玻片与用封闭液稀释的一抗于 4°C 孵育过夜。
- 用 PBS 洗涤盖玻片 3 次，再加入用封闭液稀释的 Alexa Fluor 标记的二抗（Invitrogen），孵育 45 分钟。
- 用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染细胞核，并用 PBS 多次洗涤盖玻片。
- 将盖玻片用 DAKO 荧光封片剂封片。
- 通过免疫荧光显微镜观察样本。本实验中，使用 Zeiss Axiovert 200M 倒置荧光显微镜或 Zeiss LSM 510 META 激光共聚焦显微镜进行成像分析。
6. 从少突胶质细胞富集培养物中提取全细胞蛋白
- 从培养箱中取出24孔板，置于冰上冷却3分钟。
- 小心吸除培养基，每孔加入10–20 μL裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% 脱氧胆酸钠, 1% Triton-X-100，含0.1% 抑肽酶、抑肽酶、PMSF、亮抑蛋白酶肽、正钒酸钠）（建议每个样本至少使用8个孔）。
- 使用宽口P1000移液器吸头刮取孔内细胞，将裂解液转移至1.5 mL离心管中。
- 用30½号针头注射器反复抽吸裂解液约15次，然后在冰上孵育30分钟。
- 在4°C下以14,000 rpm（约20,000 g）离心15分钟。
- 将上清液转移至新的离心管中，并在-80°C下保存。
7. 富集少突胶质细胞培养物蛋白质的SDS-PAGE分析
- 在标准的12%聚丙烯酰胺凝胶上，用含还原剂的缓冲液通过SDS-PAGE对每份样品中的30 μg蛋白进行分离。
- 将凝胶中的蛋白通过半干法转印至PVDF膜上。
- 用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl，0.1% Tween-20）封闭膜1小时。
- 将膜与用封闭液稀释的一抗溶液孵育1小时。
- 用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。
- 将膜与HRP标记的二抗在封闭液中孵育45分钟。
- 多次用TBST缓冲液洗涤膜，然后与Amersham ECL Plus蛋白印迹检测试剂（GE Healthcare）孵育5分钟。
- 使用标准科学影像胶片检测蛋白条带。
8. 典型结果：
在此方案中，少突胶质前体细胞（OPCs）在混合胶质细胞培养物中的星形胶质细胞单层上进行扩增。该混合胶质细胞培养物来源于P0-P2新生小鼠大脑皮层。第1天 体外 （DIV1）时，通过相差显微镜观察可见混合胶质细胞培养物中含有形态各异的细胞（图2a）。DIV3时，星形胶质细胞单层开始在培养瓶底部形成；至DIV8时，可在单层表面清晰观察到少突胶质前体细胞（OPCs）。DIV9时，增殖的OPCs已达到足够密度，可通过过夜高速轨道振荡法进行纯化。纯化过程完成后，即可获得富集OPCs的细胞群体。纯化后第1天（DIV1-post purification），OPCs形态简单，仅延伸出少量突起（图2b）。纯化后第3天（DIV3 post purification），细胞已延伸出复杂的网状突起结构，类似于未成熟少突胶质细胞（immature OLs）。纯化后第6天（DIV6 post purification），纯化的少突胶质细胞（OLs）变得扁平，并伸出叶片状的膜结构。该形态学发育过程是典型的 体外 少突胶质细胞的成熟
免疫荧光显微镜结果显示，纯化后的细胞属于少突胶质细胞系（OL-lineage）（图3a）。接种的少突胶质前体细胞（OPCs）最初表达硫酸软骨素蛋白聚糖（NG2），接种后3天内发育为表达髓鞘相关糖蛋白（MAG）的未成熟少突胶质细胞（OLs）（图3b）。在接种后第6天（DIV6），许多OLs表达髓鞘碱性蛋白（MBP），并具有典型的成熟OL形态。在不同时间点定量分析OL系细胞所占百分比，以评估富集OL培养物的纯度（图3c）。在纯化后第1天（DIV1），培养物中NG2阳性细胞占比为50±14%阳性 无MAG的OPCs阳性 或 MBP阳性 少突胶质细胞（OLs）。这表明在接种时，纯化的少突胶质细胞系细胞处于前体阶段，分化成熟的少突胶质细胞数量可忽略不计。在体外培养第3天（DIV3），许多细胞已分化为MAG阳性少突胶质细胞。阳性 细胞（24±5.9%），而部分细胞保留前体表型，保持NG2阳性（13±8.0%）。在DIV3时，少量MAG阳性 细胞（3.2±1.2%）也表达MBP。在DIV6时，20±5.9%的少突胶质细胞表达MAG。阳性 而有 12±7.3% 持续表现为 NG2 阳性阳性 OPCs。此外，培养物中21±9.3%的细胞为MBP阳性 在此时间点的少突胶质细胞（OLs）。SDS-PAGE 分析显示，在6天的培养期间，2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶（CNP）和髓鞘碱性蛋白（MBP）呈梯度表达，进一步证明培养中的少突胶质前体细胞（OPCs）能够终末分化为成熟的少突胶质细胞（OLs）（图3d）。综上所述，这些数据确立了该方法作为一种可生成富含少突胶质细胞的培养体系，适用于从OPCs向OLs成熟过程的研究。
本方案还描述了使用仅来源于小鼠的组织建立少突胶质细胞/背根神经节神经元（OL/DRGN）共培养的方法。然而，为建立共培养体系，需先单独培养背根神经节神经元（DRGNs），以形成充分的神经突网络。这些出生后小鼠神经元培养物在低血清培养基中培养9天。 10 μM 添加FuDR以抑制污染性成纤维细胞和胶质细胞的增殖。持续9天 体外分离的背根神经节神经元（DRGNs）可形成致密的神经突网络（图4a）。该神经突网络对神经丝蛋白200（NF）和Tuj1等神经元标志物呈免疫阳性（图4b）。此时，可将纯化的少突胶质前体细胞（OPCs）接种至神经突网络上，继续共培养6天，以建立髓鞘化共培养体系。
在OL/DRGN共培养的第6天，可在NF+ve的DRGN神经突中观察到大量MBP+ve的少突胶质细胞（图5a）。经进一步观察可见，少突胶质细胞与多条DRGN神经突形成接触，通常以MBP+ve膜结构包绕这些神经突（图5b,c）。
图 1. 新生小鼠大脑皮层与背根神经节（DRG）分离过程中特定步骤的解剖显微镜图像。（a） 刚刚分离出的新生小鼠大脑的背侧视图。虚线标示了需进行切口的区域，以利于去除脑膜层。（b） 大脑腹侧视图，虚线标示皮层与腹侧间脑交界区域。必须沿虚线做深部切口，以辅助皮层的分离。（c-c'） 示意图展示如何将皮层从大脑其余部分撬离。（d） 一只刚分离的 P5-P10 小鼠脊柱，在去除多余肌肉和骨骼前的状态 （d'）。（e） 背根神经节（DRG）在脊柱内的位置。（f） 从小鼠中应分离出的 DRG 大致数量。（g） 具有长神经根的 DRG，需在酶消化前修剪神经根。虚线标示应修剪的区域。（g'） 修剪神经根后的 DRG。
图2. 少突胶质前体细胞（OPCs）在混合胶质细胞培养物中扩增，经纯化后进一步分化为富含少突胶质细胞（OL）的培养物。（a） 混合胶质细胞培养物在不同发育阶段的相差显微图像。在体外培养第1天（DIV1），细胞呈圆形，扁平细胞较少。从体外培养第3天（DIV3）开始出现混合胶质细胞培养物的分层现象，星形胶质细胞在培养瓶底部形成均匀的单层结构，OPCs则在其表面增殖。在体外培养第8天（DIV8）可见大量OPCs（箭头）附着于星形胶质细胞单层表面。（b） 从混合胶质细胞培养物中纯化后的OPCs在体外培养第1天（DIV1）仅伸出少量突起；到体外培养第3天（DIV3），细胞已长出大量突起，形态类似于中期阶段的少突胶质细胞（OLs）；到体外培养第6天（DIV6），扁平化的少突胶质细胞（星号标记）似乎已产生膜样结构（虚线所示）。比例尺：50 μm。
图3. 寡突胶质细胞富集培养的表征。(a) 不同发育阶段分离的少突胶质细胞的共聚焦图像。NG2阳性 OPCs 具有简单的形态，而 MAG阳性 少突胶质细胞具有多个树枝状突起。MBP阳性 OLs 具有延伸的膜状髓鞘样片层。比例尺， 50 μm. (b) 纯化的少突胶质细胞系细胞起源于少突胶质前体细胞，并分化为MAG阳性, MBP阳性 OLs 培养超过 6 天。在第 1 天时，所有 OPC 均为 NG2 阳性阳性，而无一是MAG阳性 或 MBP阳性. 在 DIV3 时，MAG阳性 且少量 MBP阳性 少突胶质细胞现已明显可见。大多数少突胶质细胞呈MAG和MBP阳性。阳性 在DIV6时，仅剩少量NG2阳性 少突胶质前体细胞。比例尺， 100 μm. (c) 6 DIV 内不同发育阶段 OL-谱系细胞百分比的平均值 ± 标准差。在 DIV1 时，所有 OL-谱系细胞均为 NG2阳性，占培养细胞总数的50±14%。在DIV3和DIV6时，少突胶质细胞系细胞分别占细胞总数的36±6.8%和32±8.4%，包含不同比例的NG2阳性，MAG阳性 和 MBP阳性 少突胶质细胞。 (d) 对富集的少突胶质细胞培养物中提取的蛋白质进行SDS-PAGE分析，显示在6天体外培养期间，少突胶质细胞标志物CNP和MBP呈梯度表达。
图4. OPC接种前DRGN培养物的表征。(a) OPC接种前9天DIV期间DRGN的相差显微图像。DRGN最初为大胞体细胞，突起较少，随后逐渐形成日益复杂的神经突网络。比例尺，100 μm。(b) DIV9（OPC接种前）固定后的DRGN培养物共聚焦图像，经神经元特异性标志物Tuj1和NF200染色。DRGN已形成可用于接种OPC以建立少突胶质细胞/DRGN髓鞘化共培养体系的神经突网络。比例尺，50 μm。
图5. 少突胶质细胞（OLs）与背根神经节神经元（DRGNs）共培养导致OL介导的MBP+ve膜包裹DRGN神经突。（a） DIV6时OL/DRGN共培养的4视野共聚焦图像拼接图。可见多个MBP+ve OL与下方DRGN神经突网络相互作用。比例尺，100 μm。（b） MBP+ve OL包裹多根DRGN神经突的共聚焦放大图像。比例尺，50 μm。（c） 图（b）中标注区域的数字放大图，显示DRGN神经突被OL膜包裹。比例尺，25 μm。
讨论
本报告描述了一种分离小鼠少突胶质前体细胞（OPC）的方法，可用于在少突胶质细胞富集培养体系或少突胶质细胞/背根神经节神经元（OL/DRGN）共培养体系中进行分化。当单独培养时，OPC可分化为髓鞘碱性蛋白阳性（MBP+ve）的少突胶质细胞，并形成类似髓鞘的膜样结构。当接种至背根神经节神经元（DRGN）的神经突网络上时，少突胶质细胞会以MBP+ve膜结构包绕DRGN的神经突。该模型有助于研究调控少突胶质细胞介导的轴突髓鞘形成的复杂机制。
尽管此类培养体系具有重要价值，但其建立过程在技术上具有较大挑战性。其中关键技术难点主要包括组织消化/解离的效率、培养基pH值的平衡维持以及背根神经节神经元（DRGN）的换液操作。需要注意的是，消化时间的长短、被消化组织的量以及吹打次数均会影响组织解离的效率和最终结果。即使是经验丰富的研究人员，从解离的神经系统组织中获得较低的细胞得率也并不罕见。此外，小鼠少突胶质前体细胞（OPCs）对培养基pH值的变化较为敏感，尤其在碱性条件下更为明显。将培养体系维持在8.5% CO2环境中旨在避免这一问题，因为OPCs似乎更耐受偏酸性而非偏碱性的环境。在DRGN培养过程中，换液操作必须迅速以防止神经元干燥，但同时又必须轻柔，以免破坏正在形成的神经突网络。剧烈的换液操作可能导致神经突网络从基质上脱落，并很可能造成其完全从盖玻片上解离。
该模型系统的潜在优势远超过其技术上的复杂性。该系统的一个优点是利用出生后小鼠进行细胞培养的建立，从而避免了为获取胚胎组织而牺牲繁殖期雌鼠的需要。另一个优点是在少突胶质前体细胞（OPC）扩增过程中无需添加生长因子（GFs）。混合胶质细胞培养提供了一种支持OPC增殖的环境，这可能是由于星形胶质细胞来源的营养因子的存在。其他方法，例如通过神经球进行分离7,8，依赖于生长因子（GFs）的有丝分裂特性，例如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）和血小板源性生长因子（PDGF），以促进少突胶质前体细胞（OPC）的扩增。同样，使用出生后（P5-10）小鼠获取背根神经节神经元（DRGNs）可避免在培养基中添加神经生长因子（NGF）——一种支持神经元存活和生长所必需的神经营养因子。 体外 胚胎期背根神经节神经元的存活 9, 10值得注意的是，应避免使用NGF，因为当OL与DRGN共培养时，NGF会负面影响OL的髓鞘形成能力。 4避免使用添加生长因子的培养基还具有经济优势，因为这些试剂在大规模使用时成本较高。
该培养模型最重要的优势或许在于其完全来源于小鼠组织，从而提供了从多种转基因小鼠品系中同时获取少突胶质前体细胞（OPC）和背根神经节神经元（DRGN）的机会。这使得研究人员能够探究调控髓鞘形成的DRGN和/或OPC特异性特性。这对于阐明调控少突胶质细胞介导的轴突髓鞘形成的受体/配体相互作用尤为重要。总体而言，由于该技术可用于研究髓鞘形成背后的分子信号机制，因此在神经科学研究领域具有重要价值。
致谢
本项目由加拿大多发性硬化症协会资助，资助对象为 R.K。R.W.O 获得了加拿大多发性硬化症协会的研究生奖学金。S.D.R 获得了加拿大多发性硬化症协会和加拿大卫生研究院的博士后奖学金。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | 多细胞 | 319-005-CL | |
| Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | Invitrogen | 14170-112 | |
| 最低必需培养基（MEM） | GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌 | 12360-038 | |
| 胎牛血清（FBS） | GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌 | 10091-148 | |
| 青霉素-链霉素（Pen/Strep） | GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌 | 15140-122 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| 人源层粘连蛋白-2（merosin纯化蛋白，LN2） | EMD Millipore | CC085 | |
| 重组大鼠睫状神经营养因子（CNTF） | PeproTech Inc | 450-50 | |
| L-甲状腺素 | Biochemika | 89430 | |
| 全转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| B27 补充剂 | GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌 | 0080085-SA | |
| 牛胰岛素 | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸 | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| 腐胺 | Sigma-Aldrich | P7505 | |
| 亚硒酸钠 | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 5-氟-2'-脱氧尿苷（FuDR） | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| 木瓜蛋白酶溶液 | 沃辛顿生化 | LS003126 | |
| DNaseI | 罗氏集团 | 1010159001 | |
| L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| 24孔组织培养板 | Cellstar | 662-160 | |
| 带通气盖的T25组织培养瓶 | 康宁 | 430639 | |
| 10 cm 组织培养皿 | 康宁 | 430167 | |
| 10 cm 培养皿 | Fisher Scientific | 0875713 | |
| 胶原酶A | 罗氏集团 | 103578 | |
| CellTrics 50 μm 滤膜（可选） | PARTEC | 04-004-2327 | |
| 髓鞘碱性蛋白（MBP）抗体 | AbD Serotec | MCA409S | |
| NG2抗体 | EMD Millipore | AB5320 | |
| 髓鞘相关糖蛋白（MAG）抗体 | EMD Millipore | MAB1567 | |
| 2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶（CNP）抗体 | 科文斯 | SMI-91R-100 | |
| 泛肌动蛋白Ab-5抗体 | Fitzgerald | 10R-A106AX | |
| 神经丝蛋白-200（NF）抗体 | Sigma-Aldrich | N4142 | |
| 微管蛋白β-3链（Tuj1）抗体 | EMD Millipore | MAB5544 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG（H+L）二抗 | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa Fluor 647 山羊抗大鼠（IgG）（H+L）二抗 | Invitrogen | A21247 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗 | Bio-Rad | 170-6516 | |
| 山羊抗大鼠 IgG（H+L）-HRP 标记二抗 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2065 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma-Aldrich | D9542 | |
培养基配方 100X OL-补充剂* <表格 边框="1"> | |||
| 成分 | 添加量 | ||
| DMEM | 100 mL | ||
| BSA | 1.02 g | ||
| 孕酮 | 0.6 mg | ||
| 腐胺 | 161 mg | ||
| 亚硒酸钠 | 0.05 mg | ||
| 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸 | 4 mg |
*储存于 -80 °C in 250 μL 等分试样
OL培养基
<表格 边框="1"> 成分添加量 DMEM23.75 mL 100倍 OL-添加剂250 μL 牛胰岛素（来自 1 mg/mL 储液）125 μL GlutaMAX250 μL 全转铁蛋白（来自 33 mg/mL 储液）37.5 μL B27 补充剂500 μL FBS125 μL CNTF（来自50 ng/μL 储液25 μL混合胶质细胞培养基（用DMEM配制）
<表格 边框="1"> 成分终浓度 FBS10% 青霉素/链霉素（来自储备液的0.33%）33 单位/毫升青霉素和 33 μg/mL 链霉素 GlutaMAX1%DRGN 培养基（用 DMEM 配制）
<表格 边框="1"> 成分终浓度 FBS10% 青霉素/链霉素（1% 工作浓度，来自储备液）100 单位/毫升青霉素和 100 μg/mL 链霉素消化液配方：
OPC 木瓜蛋白酶溶液（用 MEM 配制）
<表格 边框="1"> 成分终浓度 木瓜蛋白酶溶液1.54 mg/mL L-半胱氨酸360 μg/mL DNaseI60 μg/mLDRG 木瓜蛋白酶溶液（用 HBSS 配制）
<表格 边框="1"> 成分终浓度 木瓜蛋白酶1.54 mg/mL L-半胱氨酸360 μg/mLDRG 胶原酶 A 溶液（用 HBSS 配制）
<表格 边框="1"> 成分终浓度 胶原酶A4 mg/mL参考文献
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