利用基于降解决定子（dgn）不稳定的绿色荧光蛋白（GFP）报告蛋白在活细胞中监测泛素-蛋白酶体活性

摘要

本文介绍了一种在活细胞中监测泛素-蛋白酶体活性的方法。通过慢病毒表达载体，将一个含有降解决定子的不稳定型绿色荧光蛋白融合蛋白（GFP-dgn）和一种稳定的GFP-dgnFS融合蛋白导入细胞。该技术可用于建立稳定表达GFP-dgn/GFP-dgnFS的细胞系，在该细胞系中，可通过落射荧光显微镜或流式细胞术方便地评估泛素-蛋白酶体系统的活性。

摘要

蛋白酶体是细胞内负责降解异常、错误折叠、受损或氧化蛋白质的主要细胞器^{1, 2}。蛋白酶体活性的维持参与多种关键的细胞过程，如细胞应激反应³、细胞周期调控和细胞分化⁴，以及免疫系统反应⁵。泛素-蛋白酶体系统的功能障碍与肿瘤及神经退行性疾病的发生发展密切相关^{4, 6}。此外，蛋白酶体活性的降低已被发现是细胞衰老和有机体衰老的一个特征^{7, 8, 9, 10}。本文介绍一种利用GFP-dgn融合蛋白在活细胞中检测泛素-蛋白酶体活性的方法。为了能够在活体原代细胞中监测泛素-蛋白酶体活性，我们将编码绿色荧光蛋白（GFP）–dgn融合蛋白（GFP–dgn，不稳定型）以及携带移码突变的变体（GFP–dgnFS，稳定型¹¹）的互补DNA构建体插入慢病毒表达载体中。我们更倾向于使用该技术而非传统的转染方法，因为它能够实现极高的转染效率，且不受细胞类型或供体年龄的影响。在有或无蛋白酶体抑制剂的条件下，GFP–dgnFS（稳定型）蛋白与去稳定化蛋白（GFP-dgn）所显示的荧光差异可用于估算特定细胞系中的泛素-蛋白酶体活性。这些差异可通过落射荧光显微镜进行观察，或通过流式细胞术进行定量测定。

方案

1. 质粒构建

1. 订购编码 dgn（ACKNWFSSLSHFVIHL¹¹）和 dgnFS（HARTGSLACPTSSSICE）的定制寡核苷酸，并将其连接至 pEGFP-C1 载体中，以获得 GFP 与 dgn/dgnFS 的融合蛋白（图 1）。
2. 根据 pENTR 定向 TOPO 克隆试剂盒的操作说明，通过 PCR 扩增 GFP-dgn 和 GFP-dgnFS 的编码序列，随后使用 pLenti6/V5 定向 TOPO 克隆试剂盒进行后续操作（图 6）。

2. 病毒生产

1. 转染前一天（第1天），将HEK 293FT细胞接种于T75培养瓶中，使其在转染当天达到90–95%的融合度。
2. 转染当天，取36 μl Lipofectamine 2000试剂加入1.5 ml无血清、无抗生素的DMEM培养基中，于15 ml离心管中稀释；另取一个15 ml离心管，将3 μg携带GFP-dgn或GFP-dgnFS互补DNA构建体的pLenti6/V5质粒、2.5 μg编码包膜蛋白的pMD2.G质粒以及7.5 μg载体骨架psPAX2质粒溶于1.5 ml无血清、无抗生素的DMEM培养基中进行稀释。5分钟后，将稀释后的DNA溶液与稀释后的Lipofectamine 2000试剂混合。
3. 室....

讨论

2000年首次发表了利用绿色荧光蛋白（GFP）作为泛素-蛋白酶体活性报告底物的研究¹²。自此以后，GFP已成为可视化细胞活动的常用工具，尤其是用于研究泛素-蛋白酶体过程。为了在活体（in vivo）条件下监测泛素-蛋白酶体活性，已有研究引入了一种基于GFP的报告基因转基因小鼠模型¹³。后续的活体（in vivo）研究又建立了一种类似的转基因小鼠模型，该模型使用了与本文所用相同的含降解决定子（degron）且稳定性降低的GFP报告系统¹⁴。

遗憾的是，作为报告基因的GFP存在一些缺陷，这一点已被Dantuma 等和Bowman 等的研究证实^12,15。首先，由于未知原因，即使未抑制蛋白酶体活性，不稳定的GFP仍可能发生积累。由于泛素-蛋白酶体系统是一个依赖多个步骤才能正常发挥作用的体系，因此在降解前任何环节的干扰都可能导致报告底物的积累，从而产生假阳性结果¹²。其次，基于GFP的报告底物因其半衰期较短，对.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pEGFP-C1 载体	BD Bioscience Clontech	6084-1
pENTR 定向 TOPO 克隆试剂盒	Invitrogen	K2400-20
pLenti6/V5 定向 TOPO 克隆试剂盒	Invitrogen	V496-10
Lipofectamine 2000 转染试剂	Invitrogen	11668019
DMEM 培养基	Sigma-Aldrich	D5546
PVDF 滤膜（Rotilabo-注射式滤器）	Carl Roth Gmbh	P667.1
聚乙二醇	Sigma-Aldrich	P2139
NaCl	Merck & Co., Inc.	1.06404.1000
Dulbecco 磷酸盐缓冲液 1x (PBS)	Invitrogen	14190
六亚甲基溴化铵	Sigma-Aldrich	10,768-9
杀稻瘟菌素	Invitrogen	R21001
结晶紫	Sigma-Aldrich	C3886
FACS 管	BD Biosciences
青霉素-链霉素溶液 (Pen-Strep)	Invitrogen	15140130
L-谷氨酰胺 200 mM	Invitrogen	25030024
胎牛血清 (FBS)	Biochrom AG	S0115
MEM 非必需氨基酸 (NEAA) 100x	Invitrogen	11140035
MEM 丙酮酸钠 100 mM	Invitrogen	11360039
D-(+)-葡萄糖 (45%)	Sigma-Aldrich	G8769
遗传霉素	Invitrogen	11811023
CaCl₂	Merck & Co., Inc.	C5080
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)	Invitrogen	25300054