的 原位 此处描述的杂交方案可在细胞水平上高灵敏度、高特异性地直接定位 mRNA 和小 RNA 的表达。该程序针对石蜡包埋的植物组织切片进行了优化，适用于多种植物和组织类型，可在十天内完成。
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摘要
摘要
随着过去十年基因组学研究的进步，植物生物学领域已涌现出大量针对基因表达的大规模定量分析研究。研究人员正利用微阵列和下一代测序技术，对发育、生理及应激反应过程进行探究，解析表观遗传和小RNA通路，并构建大规模的基因调控网络1-3。尽管这些技术能够实现对大量基因集合的同步分析，但通常只能提供非常有限的基因表达变化时空分辨率。这一局限性可通过将上述分析方法与激光显微切割或荧光激活细胞分选技术结合使用而部分克服4-7。然而，要全面理解一个基因的生物学功能，必须掌握其在细胞分辨率水平上的时空表达模式。特别是在研究发育过程或环境刺激及突变体效应时，对基因表达模式的精细分析显得尤为关键。例如，关键调控基因在特定细胞类型中表达水平的微小定量差异，可能因伴随特定细胞类型的表达缺失或获得，而导致显著的表型变化。
有多种方法常用于基因表达模式的详细分析。其中之一是通过分析转基因报告基因品系。然而，在分析多个基因或在难以转化的植物中开展研究时，该方法可能耗时较长。此外，通常还需要独立验证，以确保转基因的表达模式能够模拟内源基因的表达模式。蛋白质的免疫组织化学定位或mRNA 原位 杂交技术为细胞和组织内基因表达的直接可视化提供了相对较快的替代方法。后者具有明显优势，可便捷地应用于任何目的基因。 原位 杂交可通过与标记的反义RNA探针结合来检测细胞中的靶mRNA，该探针由以下方法获得 体外 目的基因的转录
本文概述了一种实验方案 原位 基因表达在植物中的高灵敏度和高特异性定位。该方法针对多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织切片进行优化，可良好保存组织形态结构，并利用地高辛标记的探针，通过免疫检测及碱性磷酸酶显色反应进行可视化。本实验方案已成功应用于多种植物物种的多种组织，可用于分析mRNA及小RNA的表达情况8-14.
方案
1. 样品制备
注意：从实验开始直至杂交步骤的所有操作均对RNase活性敏感。因此，必须在洁净的环境中操作。通常可通过使用经DEPC处理的水以及在180 °C烘烤至少3小时的玻璃器皿来制备无RNase的溶液。塑料容器常通过0.2 N NaOH处理30分钟进行清洁。然而，这些预防措施并非必需，我们通常使用普通的洁净MilliQ水2O 对于所有溶液。我们会为不同试剂、盒子和玻璃器皿分别存放 原位 杂交反应完成后，将这些样品存放在洁净的柜子中。
- 样品固定
- 第1天：配制新鲜的4%多聚甲醛（PFA）固定液。配制500 ml时，将400 ml 1×PBS（130 mM NaCl，7 mM Na2HPO4，3 mM NaH2PO4，pH 7.0）加热至60°C，并溶解两粒NaOH。在通风橱中加入20 g多聚甲醛，充分搅拌至完全溶解。将溶液置于冰上冷却，待冷却后用H2SO4调节pH至7.2（每100 ml加1–2滴）。最后用1×PBS定容至500 ml。
注意：切勿使用HCl调节pH，因其会释放剧毒气体。多聚甲醛具有毒性，因此必须在通风橱中配制并妥善处理废弃物。此外，多聚甲醛应储存于4°C，建议每6–9个月重新购买一次。 - 采集组织样本后，立即放入装有15 ml新鲜PFA固定液的玻璃闪烁瓶中，并置于冰上。若需进行组织解剖，应在冰上使用冷固定液操作为佳。
注意：必须使用大量过量的固定液。通常推荐的比例为固定液体积是组织体积的10倍。 - 将样本置于冰上，施加真空（约500 mm Hg），维持15–20分钟；此时样本中应有小气泡逸出，但固定液不应沸腾。缓慢释放真空，并更换PFA固定液以确保其浓度维持稳定。重复此步骤，直至释放真空后组织完全下沉。
注意：固定步骤的目的是使组织内的RNA分子固定并交联。此步骤至关重要，固定不良的样本会导致信号微弱。某些组织不会立即下沉，但大多数会在过夜后下沉。为增强固定液渗透，可添加以下去污剂：Triton浓度不超过0.1%，和/或Tween浓度为0.1–0.3%。或者，对于难以渗透的组织，可使用基于乙醇的固定液，如甲醛-乙醇-冰醋酸（FAA）14,15。 - 再次更换PFA固定液，并将样本在4°C下过夜保存。
- 第1天：配制新鲜的4%多聚甲醛（PFA）固定液。配制500 ml时，将400 ml 1×PBS（130 mM NaCl，7 mM Na2HPO4，3 mM NaH2PO4，pH 7.0）加热至60°C，并溶解两粒NaOH。在通风橱中加入20 g多聚甲醛，充分搅拌至完全溶解。将溶液置于冰上冷却，待冷却后用H2SO4调节pH至7.2（每100 ml加1–2滴）。最后用1×PBS定容至500 ml。
- 组织包埋
- 第2天：将1×PBS和乙醇系列溶液预冷至4°C。
- 将样本在冰上用1×PBS漂洗两次，每次30分钟。
注意：同样建议每种溶液均使用大量过量。 - 在冰上依次通过乙醇系列对样本进行脱水，步骤如下：
- 10%乙醇 30分钟，
- 30%乙醇 30分钟，
- 50%乙醇 1小时，
- 70%乙醇 1小时，
- 85%乙醇 1小时，
- 95%乙醇 1小时，
- 100%乙醇更换三次，每次1小时
- 当天结束时，将乙醇替换为含0.1%伊红的100%乙醇溶液，在4°C下过夜。伊红可染色细胞壁，使样本在包埋和切片过程中更易观察。
注意：此处列出的时间已针对3×3×3 mm大小的组织块优化，较大样本可能需要更长的孵育时间。
样本可在4°C下保存于70%乙醇中数月。 - 第3天：次日早晨，将样本在室温下复温1小时。随后逐步用Histoclear替代乙醇，步骤如下：
- 当天结束时，加入1/4体积的Paraplast Plus切片石蜡颗粒，并将瓶子置于60°C烘箱中。同时准备一个烧杯装入Paraplast颗粒，并频繁补充，以确保随时有新鲜熔化的石蜡可用。
注意：烘箱温度至关重要，应避免Paraplast在高于60°C条件下长时间加热。 - 第4天：通过定期添加更多石蜡颗粒（每小时一次），逐步将Histoclear替换为Paraplast。当天结束时，小心倾去Histoclear/石蜡混合液，并立即替换为纯熔化石蜡。将样本在60°C下过夜。
- 第5天和第6天：每天更换Paraplast三次（约每4小时一次），使用新鲜熔化石蜡，并保持样本在60°C。
注意：也可每天仅更换一次石蜡，但组织处理时间将额外延长数天，因为石蜡至少需要更换5至6次。在100%乙醇和/或石蜡中对组织样本进行真空渗透，可进一步提高渗透和包埋效果。石蜡中的样本真空渗透应在60°C下进行。 - 第7天：再更换一次石蜡。此时Histoclear的气味应已完全消失，当天即可进行包埋。
- 设置一个60°C的大型加热板，并用铝箔覆盖保护。
- 包埋方法将根据待分析组织类型的不同而有所变化。此步骤最关键的是确保样本在后续切片时方向正确。一种方法是使用塑料模具和白色包埋环。将模具放在加热板上预热，并在模具底部倒入熔化石蜡。用预热的镊子将组织样本转移至模具中，并调整至所需位置。将白色包埋环套在模具上，再加入额外熔化石蜡，确保组织完全覆盖。小心将模具从加热板移至实验台，让石蜡逐渐冷却固化。
另一种方法是在60°C加热板上操作，将所有样品置于含有熔融石蜡的培养皿中（样品应完全被石蜡覆盖）。使用预热的镊子调整样品方向。最后关闭加热板。待石蜡完全凝固后，将培养皿移至实验台，并于4°C保存。当准备切片时，用预热的刀片从培养皿中切下包含组织样品的小块，再用一滴额外的熔融石蜡将其固定在切片机的样品夹头上。在切片前让样品硬化几分钟。
注意：包埋块可在 4°C 下保存 1 年或更长时间。有关组织固定和包埋的更多实用建议，请参见参考文献 16
2. 探针制备
- 克隆
探针通常针对目的基因的一个或多个特定区域设计。探针序列应排除高度重复序列，但包含保守蛋白结构域（如转录因子中的DNA结合基序）的序列通常可获得基因特异性的表达模式8,9,12,15 （图1）。这是因为在杂交后的步骤中使用RNAse A处理（见下文），可降低基因家族成员之间的探针交叉杂交水平。RNAse A能在RNA双链的错配位点进行切割，使与互补性不完全的转录本结合的探针发生断裂，进而在后续步骤中被洗脱。
通常，针对每个目的基因可能需要测试多个探针。探针长度可短至150个碱基。尽管探针长度没有上限，但通常短于1.5 kb的片段转录效果更佳。用于转录的DNA片段可克隆至含有T3、T7或SP6启动子的载体中（例如pCRII-TOPO，Invitrogen）。或者，可在用于扩增探针区域的反向引物5’端添加T3、T7或SP6启动子序列作为尾部。
在每一个 原位 杂交实验中，我们加入一个已知杂交模式且结果稳定可靠的阳性对照探针，以及一个阴性对照（图1D和H）。阴性对照可选用已知不会与目标组织中任何转录本发生杂交的随机RNA探针。尽管通常使用待分析基因的正义链探针作为阴性对照，但这并非必需，任何不会发生杂交的RNA均可满足要求。若有条件，可使用目标基因转录无效等位基因的组织作为理想的阴性对照。
- 体外 转录
- 用限制性内切酶消化约 5 μg 质粒 DNA，使插入片段末端（与启动子所在位点相对的一端）被切开，从而线性化质粒。避免使用产生 3'-突出末端的限制性内切酶，因为 RNA 聚合酶可能以 3'-突出端为底物继续转录，导致转录产物出现异常。 Alternatively，可通过 PCR 扩增包含 T3、T7 或 SP6 启动子的探针区域，以获得体外转录反应所需的 DNA 模板。
- 在凝胶上检测一份等分试样，以确认反应已完全进行。
- 用酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀，并将DNA沉淀溶于milliQ H₂O中2O至浓度为1 μg/μl。或者，可使用标准DNA纯化柱对DNA进行纯化。
- 设置 体外 通过混合进行转录反应：
- 1μl 纯化的DNA（1μg/μl）
- 2μl 10x 转录缓冲液
- 2 μL 10x DIG RNA标记混合物
- 1μl RNAse OUT
- 2 μl T3、T7 或 SP6 RNA 聚合酶（20 U/μl）
- H2最多20μl。
37°C 下孵育 1 至 2 小时。保留 1μl 用于后续凝胶分析。
注意：在动物系统中优先使用荧光标记探针，但由于大多数植物组织具有较高的自发荧光， 原位 植物杂交实验方案使用放射性标记探针17 或更常用的通过免疫组织化学检测的DIG标记探针。 - 通过加入75 μL MilliQ H2O去除DNA模板2加入5 μL O和5 μL RQ1 DNA酶（1 U/μL）至转录反应体系中，37°C孵育10分钟。
- 纯化 体外 转录反应以去除未掺入的核苷酸和小片段转录产物。一种方法是使用凝胶过滤Sephadex®柱，例如mini Quick Spin RNA柱（Roche）。 alternatively，也可采用常规的LiCl/乙醇沉淀法进行转录反应纯化（见参考文献14）。保留1μl用于后续琼脂糖凝胶电泳检测。
- 长度超过250个碱基的探针通常需部分水解，以获得约150个核苷酸的RNA分子，从而使其足够小，能够高效穿透组织切片。加入等体积的2×碳酸盐缓冲液（80 mM NaHCO₃）3，120 mM Na2CO3) 加入纯化的转录反应体系中，60°C孵育。孵育时间应按以下公式计算：
时间 = (Li - Lf) / (K × Li × Lf)
其中，Li = 初始探针长度（单位：kb）；Lf = 最终探针长度（0.150 kb）；K = 0.11 kb/分钟。保留 2 μL 用于凝胶检测。 - 通过加入1/20体积的10%乙酸中和水解反应。
- 将探针加入1μl tRNA（100 mg/ml）、1/10体积的3M NaAc（pH 5.2）以及2.5倍体积的冷无水乙醇，混匀后于-80°C孵育30分钟进行纯化。在4°C下以13,500 rpm离心20分钟沉淀RNA。弃去上清液，用500μl 70%乙醇洗涤RNA沉淀。再次离心后，将沉淀在空气中晾干（通常约15分钟），然后将RNA重悬于50μl 50%去离子甲酰胺中。探针应保存在-80°C直至使用。
- 定期使用1% TAE琼脂糖凝胶检测最终产物以及第2.2.4、2.2.6和2.2.7节中的中间产物（图2A），以监测反应效率 体外 转录反应
注意： 体外 转录反应每1 μg模板应产生约1 μg RNA。
- 点斑印迹分析
探针浓度和DIG-UTP的掺入情况可通过点杂交分析进行评估（图2B）。将系列稀释的RNA与已知浓度的标记对照RNA一同点样至标准杂交膜上。例如，我们使用试剂盒中提供的DIG-UTP标记对照RNA探针 体外 转录试剂盒（Roche）。最好对每种探针测试多个稀释度，以确定准确的浓度。- 将封闭试剂以0.5%的比例溶于1×TBS缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl）中，于70°C条件下配制，随后使溶液冷却至室温。
- 点样1μl系列稀释液（通常为10倍稀释）-1 至 10-5的 体外 在N+尼龙膜上分别点样转录的探针和对照探针，通过紫外交联固定RNA。
注意：应使用尽可能小的膜面积，以减少后续所需的缓冲液体积。 - 在室温下，将膜置于1×TBS中，在摇床上孵育5分钟。
- 在摇床上于室温用封闭缓冲液封闭膜 30 分钟。
- 用1×TBS冲洗膜5分钟。
- 将膜与抗DIG抗体孵育，用10 ml 1×TBS稀释1 μl Anti-digoxigenin-AP，室温下孵育45分钟。
- 用1×TBS缓冲液洗涤膜，每次15分钟，共洗涤两次。
- 用1× TN缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 9.5，100 mM NaCl）平衡膜5分钟。
- 在1×TN缓冲液中加入NBT/BCIP（体积比1/50），孵育膜进行染色。染色过程需5-10分钟。随后用水冲洗膜，然后可将其干燥并作为记录保存。
注意：NBT/BCIP 是一种底物，用于与抗DIG抗体偶联的碱性磷酸酶，经水解后产生深蓝色染料。
3. 切片
- 将包埋块升温至室温。若包埋块温度过低，切片时单个切片可能会卷曲，无法形成蜡带。将包埋块修整成梯形，样品周围保留约1 mm的石蜡。
- 将大型载玻片加热板预热至35–37°C。
注意：许多实验方案在此步骤中采用42°C，但将温度降低至35–37°C可防止切片下方产生气泡。 - 将包埋块放置于切片机上，使两个平行面中较长的一面朝下。小心地将包埋块向前推进至刀刃处，确保包埋块表面与刀刃平行。切片厚度设为8–10 μm。蜡带可在无黏性表面（如铝箔或滤纸）上展开，以便挑选感兴趣的切片区域。此过程可借助附近的解剖显微镜进行观察评估。
注意：组织的伊红染色可提示包埋过程中组织是否得到充分浸透。若组织块中心未被伊红着色，通常表明组织固定不良。 - 用铅笔标记 Probe-on Plus 载玻片（大多数钢笔或记号笔的标记在后续步骤中会被擦除） 原位 杂交方案）并分装 1 mL 干净的 MilliQ H2将切片小心地漂浮在室温水面上（在室温下操作时，切片在水面上更易于操控）。确保切片的光面（即切片带从切片机切下时的底面）朝向水面。随后，缓慢将载玻片移至载玻片加热台上。加热有助于切片在水面充分展开。5分钟后，小心但连续地倾倒去除水分，使切片带平稳地沉降至载玻片上。将载玻片在37°C下干燥至少数小时或过夜，以使组织牢固附着。
注意：切片组织可在含硅胶干燥剂的盒子中于4°C保存数天至数周，但最好尽快使用这些切片。
4. 原位 杂交
- 切片预处理
所需每种溶液的体积显然取决于待处理切片的数量和所用容器的大小。切片应始终完全浸没。对于25张切片的支架和一个贴合良好的容器，200–250 ml已足够。由于许多孵育步骤非常短暂，我们通常先准备好所有可能用到的溶液，然后再开始切片预处理。然而，乙酸酐溶液需在使用前立即配制，蛋白酶则在使用时加入。除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。此外，所有缓冲液均可配制成10×浓度的储存液。- 将蛋白酶缓冲液（100 mM Tris pH 8.0，50 mM EDTA）在容器中预热至37°C。
- 脱蜡并复水组织切片，步骤如下：
- 二甲苯替代物（histoclear）— 10分钟（使用玻璃皿）
- 二甲苯替代物（histoclear）— 10分钟（使用玻璃皿）
- 100% 乙醇 — 1分钟
- 100% 乙醇 — 30秒
- 95% 乙醇 — 30秒
- 85% 乙醇 — 30秒
- 70% 乙醇 — 30秒
- 50% 乙醇 — 30秒
- 30% 乙醇 — 30秒
- 10% 乙醇 — 30秒
- milliQ H2O — 1分钟
- 在1× PBS中孵育2分钟。
- 将50 mg/ml蛋白酶625 μl加入已预热至37°C的250 ml蛋白酶缓冲液中，混匀后将切片在37°C孵育20分钟。
注：蛋白酶用于消化固定后的蛋白质，以增强探针对细胞RNA的可及性。必须严格控制孵育时间，以在最大化杂交信号的同时避免组织降解，因此每种组织样本可能需要进行一定优化。 - 在含0.2%甘氨酸的1× PBS中中和蛋白酶活性，持续2分钟。
- 在1× PBS中漂洗切片一次，每次2分钟。
- 将切片置于4% PFA溶液中处理10分钟，以重新固定可能因蛋白酶处理而受损的RNA。
- 在1× PBS中漂洗切片两次，每次2分钟。
- 当切片处于PBS漂洗过程中时，在玻璃皿中将12.5 ml 2M三乙醇胺（29.8 g溶于100 ml milliQ H2O，用HCl调pH至8.0）加入236.25 ml milliQ H2O中，配成250 ml 0.1 M三乙醇胺溶液（pH 8.0）。在将切片放入前立即向三乙醇胺缓冲液中加入1.25 ml乙酸酐，并充分搅拌。加入切片后继续缓慢搅拌10分钟。
此步骤要求切片架在三乙醇胺/乙酸酐溶液容器中被抬高。我们使用带支撑架的夹紧系统。
注：此步骤中会乙酰化可能引起探针非特异性结合的带正电荷的氨基基团。此外，乙酸酐具有毒性，因此该溶液应在通风橱中配制并妥善处理。 - 在1× PBS中漂洗切片两次，每次2分钟。
- 再次脱水组织切片：
- H2O — 1分钟
- 10% 乙醇 — 30秒
- 30% 乙醇 — 30秒
- 50% 乙醇 — 30秒
- 70% 乙醇 — 30秒
- 85% 乙醇 — 30秒
- 95% 乙醇 — 30秒
- 100% 乙醇 — 30秒
- 100% 乙醇 — 30秒
- 杂交
- 将加热块预热至85°C。
- 配制杂交缓冲液。取10 ml，在Falcon管中混合1.25 ml 原位杂交盐溶液（3M NaCl，100mM Tris-HCl pH 8.0，100mM 磷酸钠 pH 6.8，50mM EDTA）、5 ml 去离子甲酰胺、2.5 ml 50% 硫酸葡聚糖、250 μl 50× Denhardt液、125 μl 100 mg/ml tRNA，以及875 μl H2O。
注：硫酸葡聚糖黏度很高，最好将溶液预热至60°C以方便移液。杂交缓冲液可储存于-20°C。 - 配制不同的探针。每张切片取1 μl探针与9 μl milliQ H2O及10 μl去离子甲酰胺混合。在85°C加热探针2–3分钟，立即置于冰上冷却，短暂离心后，将探针加入80 μl杂交缓冲液中。通过移液充分混匀，但避免产生气泡。
注：每张切片所需探针用量需通过实验确定。通常探针使用终浓度为0.5 ng/kb/μl探针复杂度。由于每张切片进行100 μl杂交，因此对于长度为0.5 kb的探针，每张切片约需25 ng探针；对于1 kb长的探针，则每张切片需50 ng。为简便起见，我们常尝试每张切片使用0.5、1和4 μl探针。 - 将切片置于洁净表面，完全空气干燥5–10分钟。用移液器将探针/杂交缓冲液混合液滴加至切片右侧边缘。逐渐将盖玻片覆盖在切片上，确保杂交液覆盖所有组织区域且无气泡。在气泡形成处用手指轻敲盖玻片，以驱除所有组织区域中的气泡。切勿强行拉下盖玻片，以免损伤组织。
注：此步骤常用的另一种方法是制备两张切片“三明治”结构，用同一探针共同孵育。有关该方法的更多细节，请参见参考文献14。 - 在完全平整的塑料盒中准备湿盒。用milliQ水润湿Whatman滤纸铺于盒底，再用Parafilm覆盖滤纸，仅留四角暴露；将切片放入塑料盒中并严密封盖。
- 在所需杂交温度（通常为50–55°C）下孵育切片16–20小时。
- 若需次日早晨使用，请提前配制1升0.2× SSC并置于55°C保存。同时配制1升NTE缓冲液（0.5 M NaCl，10 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM EDTA pH 8.0），并置于37°C保存。
- 杂交后处理
- 小心移除盖玻片，避免损伤组织。将切片放入支架中，在55°C的0.2× SSC中漂洗两次，每次1小时。
注：当切片垂直放置时，盖玻片常可自然脱落。若盖玻片仍附着，可将切片浸入温热的0.2× SSC中1–2分钟以洗脱盖玻片。避免强行拉下盖玻片，以防损伤组织。 - 同时，配制500 ml洗涤缓冲液（1% BSA，0.3% Triton溶于TBS缓冲液）和100 ml封闭液（0.5%封闭试剂溶于TBS缓冲液）。将封闭粉加入TBS中，缓慢加热至70°C使其溶解，溶解后冷却至室温。
注：洗涤缓冲液和封闭液所需体积取决于步骤4.3.8–4.3.11中所用平底塑料盒的大小。Triton完全溶解需要一定时间，因此应提前配制足够溶液。 - 在1× NTE中平衡切片2分钟。
- 进行RNase A处理：将切片转移至1× NTE缓冲液中，并在使用前立即加入RNase A至终浓度20 μg/ml，在37°C孵育30分钟。
注：RNase A可切割游离的单链RNA以及RNA双链中的错配位点。此步骤有助于降低探针的非特异性结合水平，因为被切割的探针片段将在最后的0.2× SSC漂洗中被洗去（见4.3.6）。 - 在1× NTE中漂洗切片两次，每次2分钟。
- 在55°C的新鲜0.2× SSC中漂洗切片1小时。
- 在室温下于1× PBS中平衡切片5分钟。
- 将切片从支架转移至平底塑料盒底部，加入最小体积的封闭液覆盖切片。在缓慢摇动平台上封闭45分钟。
- 将切片转移至第二个洁净的平底塑料盒中，在摇动平台上用洗涤缓冲液洗涤45分钟。
- 进行抗体孵育。将抗地高辛抗体用洗涤缓冲液按1:5（v/v）稀释，可直接在每张切片上滴加最小体积的抗体溶液，或将切片放入平底塑料盒中，用最小体积的抗体溶液覆盖。在室温下避光孵育2–3小时，或在4°C过夜孵育。
- 在摇动平台上用洗涤缓冲液漂洗切片4次，每次15分钟。使用最小体积的洗涤缓冲液和平底塑料盒。每次漂洗后清洗塑料盒。
注：每次漂洗后清洗盒子可降低切片的整体背景。为简化操作，我们使用两个相同的平底盒，每次漂洗后将切片转移至洁净盒子中。 - 将切片转移至1× TBS中2分钟。
- 在TN缓冲液中平衡切片两次，每次2分钟。
- 使用前立即配制显色液：每1 ml TN缓冲液中加入20 μl NBT/BCIP。将显色液倒入小型塑料称量皿中。将两张切片组织面相对叠成“三明治”结构。将“三明治”一侧长边浸入溶液中，利用毛细作用使溶液上升。用Kimwipe纸吸干切片后再次加入抗体溶液。溶液流入时可能需要轻敲切片以避免气泡。将切片放入塑料盒中，避光于室温保存。
- 第10天至第15天：每隔12小时更换一次显色液，持续1–5天，方法是将切片用TN缓冲液漂洗，并重新制备含新鲜显色液的“三明治”结构。
注：定期更换显色液可改善信噪比。可在复合显微镜或体视显微镜下监测信号显色进程。可在染色轮次之间将切片置于TN缓冲液中拍照，或在永久封片前转移至水中进行拍照。
- 小心移除盖玻片，避免损伤组织。将切片放入支架中，在55°C的0.2× SSC中漂洗两次，每次1小时。
- 封片
- 当信号明显可见后，用milliQ H2O漂洗切片，并通过乙醇系列快速脱水：
- 10% 乙醇 — 10秒
- 30% 乙醇 — 10秒
- 50% 乙醇 — 10秒
- 70% 乙醇 — 5秒
- 80% 乙醇 — 5秒
- 95% 乙醇 — 5秒
- 100% 乙醇 — 5秒
- 二甲苯替代物（histoclear）— 2分钟
- 二甲苯替代物（histoclear）— 2分钟
- 封片时在每张切片上滴加一至两滴基于甲苯的封片介质，缓慢将盖玻片覆盖在切片上，避免产生气泡。让封片介质在室温下过夜硬化后再在复合显微镜下观察结果。封片后切片可在室温下保存数年。
- 当信号明显可见后，用milliQ H2O漂洗切片，并通过乙醇系列快速脱水：
5. 代表性结果：
1至5天后，探针与互补转录本结合的细胞中将出现红紫色信号（图1）。因此，该颜色信号可在细胞水平上直接可视化目标基因的表达模式。也可能出现较弱的背景染色，这是由于探针的非特异性结合或植物组织自身着色所致（图3）。此类背景信号在组织中较小且分化程度较低的细胞中可能相对更明显，但在使用阴性对照和阳性对照探针进行杂交的切片中也会观察到，并且在不同实验之间不具有可重复性。
图1. 使用不同探针获得的代表性结果 拟南芥和玉米组织. 原位 杂交 拟南芥 （A-D）和玉米（E-H）组织使用特异性基因探针的结果示例，展示了按照所述实验方案成功完成时可预期的实验结果类型。（A）定位 SHOOTMERISTEMLESS1 （扫描隧道显微镜，STM）在 拟南芥 营养茎尖；注意分生组织的未定型细胞中存在紫蓝色信号，而周围叶片中无信号。（B-D）切片 拟南芥 呈现电鳗阶段的胚胎 CLAVATA3 （B）在少数胚胎干细胞中的表达， AtML1 (C) 表皮层中的表达，以及使用随机阴性对照RNA探针的切片中无信号（D）。(E) 定位 STM 同源基因 knotted1 在发育中的玉米胚中；注意胚分生组织和根部有特异性的强信号。（F-H）通过玉米营养茎尖的纵切面，显示明显的 原位 杂交模式用于 arf3a (F) 和 ocl4 (G)，而阴性对照探针无杂交信号 (H)。arf3a 在叶片远轴面/下表面表达，而 AtML1 同源基因 ocl4 特异性地在表皮中表达。
用作探针的以下基因片段：STM：包含第81至382位氨基酸的cDNA区域，其中包括保守的同源异型结构域；CLV3：全长cDNA；AtML1：第三外显子；kn1：完整的开放阅读框；arf3a：cDNA克隆HM004539的第9至225位核苷酸；ocl4：全长cDNA的3'端1.7 kb区域，其中包含多个保守的蛋白质结构域。
图2. 制作过程中的检查要点 体外 转录探针.（A） 原位 杂交探针在标准琼脂糖凝胶上进行检测 体外 转录（a），经DNase处理及后续纯化后 体外 转录反应（b），必要时经碳酸盐水解（c），以及准备使用时（d）。对于长度超过250 bp的探针（如探针1），碳酸盐水解将产生一系列较小的探针片段（括号所示）。(B) 点杂交分析对探针进行比色定量。稀释梯度范围从10-1 至 10-5 100 ng/μl 的对照探针（1）以及三种新制备的DIG标记探针（2-4）被点样于转移膜上，经抗DIG抗体孵育后，按照实验方案第2.3节所述的比色法进行检测。分析结果显示以下估计浓度：探针2，约100 ng/μl；探针3，约10 ng/μl；探针4，约1 ng/μl。探针4的浓度可能过低，难以获得良好的检测结果 原位 杂交信号
图3. 非特异性探针与有效探针的比较。玉米营养茎尖的纵切面显示非特异性背景信号（A）和外层细胞中 OCL5 探针的特异性 原位 杂交信号（B）。
图4. 显示实验步骤时间线的示意图 原位 杂交实验方案组织包埋步骤用绿色表示，探针制备步骤用橙色表示，以及 原位 杂交步骤用蓝色表示。该时间线假设用于杂交的DNA模板 体外 探针的转录信息可获取。石蜡包埋的组织块和地高辛标记的探针可预先制备，并分别在4°C和-80°C保存至使用时。 原位 杂交实验方案最短可在四天内完成。
讨论
的 原位 此处所述的杂交方法能够以高细胞分辨率、高灵敏度和高特异性，直接可视化任意目标基因的时空表达模式。该方案不适用于基因间表达水平的定量比较。然而，该方法的高灵敏度和高分辨率可揭示组织内基因表达的梯度变化。8, 18而大多数其他基因表达分析方法无法实现这一点。
该实验方案包含多个步骤，这可能使问题排查变得困难。方案中最关键的步骤是组织的固定以及探针的选择与标记。组织渗透不良或地高辛（DIG）掺入量低的探针将产生非常微弱的信号，可能难以在背景之上被检测到。针对每一个新研究的基因，建议尝试来源于转录本不同区域的几个不同探针。有时，可能需要组合使用针对基因不同较小区域的两到三个探针，以获得强且特异的杂交信号。此外，杂交条件（如杂交缓冲液的温度和组成）可根据每个基因或组织进行优化，以降低或提高杂交的严谨性。蛋白酶处理步骤也是一个可变环节，可根据不同植物物种或极低丰度转录本的检测需求进行调整。同时使用阳性和阴性对照探针将有助于识别实验方案中的问题环节。
该方案针对石蜡包埋的植物组织切片进行了优化，但经过少量修改后也可用于整体封片 原位 杂交。尽管在动物研究中被广泛使用19，整体封片 原位 杂交将仅限于易于渗透的植物组织，例如胚胎、根或幼嫩的分生组织20,21该方案还可轻松修改，以同时检测两种不同的mRNA，或在蛋白质存在的情况下对转录本进行定位15,22,23最后，该方法还可拓展用于植物中小RNA表达模式的可视化研究。利用本实验方案，已在玉米和拟南芥中成功确定了miRNA的表达模式。8,14。最近， 体外 转录探针已被商品化的地高辛标记的锁核酸（LNA）寡核苷酸探针取代，后者可提高信号灵敏度18, 24.
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
M.T. 实验室的研究工作得到了美国国家科学基金会（DBI-0820610 和 IOS-1022102）以及纽约州卫生部（NYSTEM-C024308）资助项目的支持。C.M. 获得了西班牙教育部和科学部（2007-0937）以及西班牙拉斐尔·德尔皮诺基金会的博士后奖学金。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞封片剂 Cytoseal 60 4盎司 | 费舍科学（Fisher Scientific） | 23-244-256 | 甲苯基 8310-4 |
| 组织清除剂 Histoclear | 费舍科学（Fisher Scientific） | 50-899-90147 | |
| 组织包埋石蜡 Tissue Path Paraplast Plus | 费舍科学（Fisher Scientific） | 23-021-400 | |
| 尼龙膜 Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN203B | |
| RNase OUT；40 U/μL | 英潍捷基（Invitrogen） | 10777019 | |
| RQ1 无RNase的DNase；1 U/μl | 普洛麦格公司（Promega Corp.） | M6101 | |
| DIG标记对照RNA | 罗氏集团（Roche Group） | 11585746910 | |
| DIG RNA标记混合物 | 罗氏集团（Roche Group） | 11277073910 | |
| SP6 RNA聚合酶 1,000 U | 罗氏集团（Roche Group） | 10810274001 | |
| T3 RNA聚合酶 1,000 U | 罗氏集团（Roche Group） | 11031163001 | |
| T7 RNA聚合酶 1,000 U | 罗氏集团（Roche Group） | 10881767001 | |
| RNase-A | 罗氏集团（Roche Group） | 109142 | 溶于50%甘油和100 mM Tris缓冲液（pH 8.0） |
| 封闭试剂 | 罗氏集团（Roche Group） | 1 096 176 | 在TBS缓冲液中加热至70°C |
| 抗地高辛-碱性磷酸酶（Anti-Digoxygenin-AP），羊来源Fab片段 150 U | 罗氏集团（Roche Group） | 1 093 274 | |
| NBT/BCIP储备溶液 | 罗氏集团（Roche Group） | 1 681 451 | |
| 微型快速自旋RNA柱 mini Quick Spin RNA Columns | 罗氏集团（Roche Group） | 11814427001 | |
| 来自 E. coli 的tRNA | 罗氏集团（Roche Group） | 109541 | |
| 曲拉通®X-100 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | T8787 | |
| 吐温-20 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | P9416 | |
| 去离子甲酰胺 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | F9037 | |
| 来自Streptomyces griseus 的蛋白酶，XIV型 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | P5147 | 用超纯水稀释，并在37°C 预消化4小时 |
| 三乙醇胺 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | 90279 | 溶于水，用HCl调节至pH 8.0 |
| 乙酸酐 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | A6404 | |
| 来自Leuconostoc spp. 的硫酸葡聚糖钠盐 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | D8906-5G | 硫酸葡聚糖需加热至80°C 以溶解。 |
| Denhardt’s溶液 50倍浓缩液 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | D2532 | |
| 牛血清白蛋白 - ≥98% | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | A7906 | |
| 伊红Y二钠盐 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | E4382 | 溶于96-100%乙醇直至饱和 |
| 多聚甲醛 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | P6148 | |
| 无水乙醇（200 proof） | |||
| 苯酚/氯仿 | |||
| 包埋模具 | 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences） | 62352-15 | |
| 包埋环 | 费舍科学（Fisher Scientific） | 22-038-197 | |
| 20 ml一次性闪烁瓶（带盖） | VWR国际公司（VWR international） | 66020-326 | |
| 载玻片 Probe-on-plus | 费舍科学（Fisher Scientific） | 22-230-900 | |
| 显微盖玻片 24x50 mm | VWR国际公司（VWR international） | 48404-452 | |
| 沃特曼3 mm滤纸 | VWR国际公司（VWR international） | 89022-360 | |
| 三个玻璃皿和一个不锈钢载玻片架 | 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences） | 71420-25 | 两个玻璃皿用于Histoclear处理，最后一个用于乙酸酐处理 |
| 18个洁净塑料容器 | 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences） | 71402 | |
| 2或3个带密封盖的大型平底塑料盒 | 用于杂交和抗体步骤 | ||
| 细毛刷 | 有助于操作石蜡切片带 | ||
| 切片机 | Leica | ||
| 自清洁干式真空系统 | 韦尔奇·艾伦（Welch Allyn） | 2025 | |
| 载玻片烘片台 | 费舍科学（Fisher Scientific） | ||
| 加热金属块 | 需要在60°C 和85°C 使用 | ||
| 58-60°C 恒温培养箱 | 费舍科学（Fisher Scientific） | 用于熔融Paraplast步骤 | |
| 55°C 和37°C 的恒温箱或水浴锅 | 费舍科学（Fisher Scientific） | 由于温度需快速切换，需准备两个 | |
| 离心机（4°C - 20°C） | |||
| 通风橱 |
参考文献
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