本文描述了一种在三维胶原凝胶中定量检测转化生长因子（TGF）-β诱导侵袭的实验方法。该方法利用代表乳腺癌不同发展阶段的MCF10A系列细胞系，也可适用于其他细胞系，并可用于研究其他潜在的侵袭激活剂或抑制剂。
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摘要
摘要
TGF-β 在乳腺癌进展中具有双重作用：在早期阶段作为肿瘤抑制因子，但在晚期阶段则促进侵袭和转移1,2。此外，TGF-β 在乳腺癌中常呈过表达，其表达水平与不良预后及转移相关3,4。目前对 TGF-β 诱导侵袭的机制尚不完全清楚。
TGF-β 通过 TGF-β II 型（TβRII）和 I 型（TβRI）受体介导其细胞反应。在 TGF-β 诱导形成异源复合物后，TβRII 磷酸化 TβRI。活化的 TβRI 通过磷酸化受体依赖性 Smad 蛋白（R-Smads），即 Smad2 和 Smad3，启动其细胞内经典的信号通路。这些活化的 R-Smads 与 Smad4 形成异源复合物，随后在细胞核内累积，调控靶基因的转录5。除了上述 Smad 信号通路外，受体活化还可导致多种非 Smad 信号通路的激活，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路6。
为了研究 TGF-β 在乳腺癌不同阶段的作用，我们采用了 MCF10A 细胞系统。该系统包括自发永生化的 MCF10A1（M1）乳腺上皮细胞7，H-RAS 转化的 M1 衍生细胞 MCF10AneoT（M2），后者在小鼠体内可产生癌前病变8，以及由 M2 异种移植瘤建立的 M2 衍生细胞 MCF10CA1a（M4），该细胞可形成高级别癌，并具有向肺部转移的能力9。这一 MCF10A 系列为研究不同恶性程度但遗传背景一致的细胞反应提供了可能。
为分析TGF-β诱导的侵袭，我们建立了嵌入三维胶原基质中的同源MCF10A球状细胞培养模型 体外 （图1）。此类模型与人类肿瘤非常相似 体内 通过建立氧气和营养物质的梯度，使类球体外层形成活跃且具有侵袭性的细胞，而内层则为静止或甚至坏死的细胞10基于球体的检测方法也被证实比单层培养更能准确地模拟药物耐药性11该MCF10 3D模型系统使我们能够研究TGF-β信号通路对处于不同恶性阶段的乳腺细胞侵袭特性的影响。
方案
1. 甲基纤维素溶液的制备（500 mL）
- 将6 g甲基纤维素与磁力搅拌子放入500 ml瓶中，进行高压灭菌。
- 在250 ml预热至60°C的无血清DMEM/F12培养基中溶解甲基纤维素，持续20分钟。
- 加入250 ml含10%马血清的室温DMEM/F12培养基，4°C下混合过夜。
- 通过离心澄清溶液（5000g，4°C，2小时）。
- 取上清液（高黏度液体，约为原溶液的90–95%）转移至新离心管中。
- 4°C保存，待用。
2. 类球体培养
- 配制20%甲基纤维素溶液（10 ml 甲基纤维素和40 ml 培养基）。
- 用PBS洗涤细胞两次，加入0.1%胰蛋白酶，并在37 °C下孵育细胞。
- 用培养基重悬细胞，并进行细胞计数。
- 在20%甲基纤维素中制备每毫升含10,000个细胞的细胞悬液。
- 将细胞悬液加入96孔圆底悬浮培养板中（每孔100 μl）。
- 次日，检查悬浮培养板中的球状体形成情况。球状体在1–3天后即可用于实验。
3. 胶原蛋白的制备
- 在冰上配制溶液：8 ml 胶原蛋白、1 ml 10x PBS、1 ml 0.1 N NaOH 和 3 滴 0.1 N HCl。取少量溶液滴在 pH 指示试纸上，检测 pH 是否为 7.4。若超出范围，需调节 pH。
- 在 96 孔板的各孔中加入 50 μl 中和后的胶原蛋白溶液。
- 于 37°C 培养，直至胶原蛋白凝固（90 分钟）。
- 在冰上配制甲基纤维素-胶原蛋白-配体溶液：针对每种配体，移取 1 份胶原蛋白溶液，每毫升胶原蛋白中加入 20 ng TGF-β。经甲基纤维素稀释并在各层间扩散后，TGF-β 的终浓度为 5 ng/ml。涡旋混匀。加入 1 份甲基纤维素溶液，再次涡旋混匀。
4. 类球体包埋
- 将一个200 μl的枪头（其尖端已截去约5 mm）安装在200 μl移液器上。用该移液器吸取一个类球体，并小心地将培养基排入空板中。观察类球体是否仍留在枪头内，类球体呈白色小点状，肉眼可见。在不释放移液器推杆的情况下，吸取100 μl胶原-甲基纤维素混合液，然后将类球体排入已包被胶原的96孔板中的胶原混合液内。每种实验条件重复操作12个类球体。
- 在37°C下静置至少30分钟，使胶原凝固。
- 使用200 μl枪头去除气泡。
- 加入50 μl含1.6%血清并溶解于DMSO中的培养基。对于SB-431542，将4 μl储存液（10 mM）加入1 ml培养基中。扩散后，抑制剂的终浓度为10 μM。TGF-β和抑制剂在整个实验过程中持续存在。使用显微镜在40倍放大倍数下拍摄类球体图像。
- 在使用TGF-β和/或抑制剂刺激48小时后，使用显微镜在40倍放大倍数下拍摄类球体图像。
- 在刺激2天后测量侵袭性类球体的面积，并减去初始面积。测量类球体面积的方法如下：在Adobe Photoshop Extended中打开类球体图像（图2A），选择“快速选择工具”（图2B）。鼠标指针将变为带加号（+）的圆形（图2C）。拖动光标划过类球体时，Photoshop将自动识别类球体的边界。若选中了类球体外部区域，可通过按Alt键或使用工具栏中标有减号（-）的负向选择工具，将该区域从选区中排除。此时光标变为带减号（-）的圆形，拖动光标划过错误选中的区域即可将其从选区中移除（图2D）。如有需要，可通过按Shift键选择多个区域。为提高精度，可在工具栏中调整画笔直径以改变鼠标指针大小（图2E）。当整个类球体被选中后，可通过菜单栏中的“分析-测量”（ANALYSIS-MEASURE）或按Ctrl + Shift + M计算选区面积（图2F）。测量记录窗口将显示文件名、选区面积（以像素为单位）及其他数据（图2G）。若进行了多次测量，第一行显示所有区域面积的总和，各单个选区的测量值则依次列于下方。所有测量数据可导出为文本文件并在Excel中打开。
5. 代表性结果：
图3展示了使用MCF10A1（M1）正常乳腺上皮细胞、H-RAS转化的MCF10AneoT（M2）细胞以及由M2衍生的MCF10CA1a（M4）细胞进行类球体侵袭实验的示例。M1细胞在无刺激条件下仅表现出微弱的侵袭能力，而在TGF-β刺激下侵袭能力显著增强。相比之下，经RAS转化的M1衍生细胞M2在未添加刺激因子时已具备高效的侵袭能力，经TGF-β处理后，其侵袭能力进一步提高了4-5倍。M4细胞无论在有无TGF-β添加的情况下，均表现出最强的侵袭能力。
接下来，我们检测了是否可以利用化学抑制剂在该球体模型中干扰TGF-β诱导的侵袭。为此，我们使用了SB-431542，一种ATP类似物，可选择性抑制TβRI的激酶活性，同时也抑制激活素I型B受体（ActRIB）和激活素受体样激酶（ALK）712。正如预期，SB-431542显著抑制了TGF-β诱导的M1、M2和M4细胞的侵袭（图4），表明TGF-β诱导的侵袭依赖于TβRI激酶活性。此外，球体的基础侵袭也受到强烈抑制，提示基础侵袭同样依赖于TGF-β。
图1. 三维类球体实验流程图。首先，将细胞接种于非黏附条件下、U型悬浮培养板中。细胞聚集形成多细胞类球体，随后可将其包埋于胶原基质中。在该胶原基质中，细胞能够发生侵袭。
图2. 使用 Adobe Photoshop Extended 对类球体面积进行定量分析。（A）在 Adobe Photoshop Extended 中打开类球体图像（B）选择快速选择工具（C）拖动光标覆盖类球体以选中其区域（D）使用反向快速选择工具去除误选区域（E）调整快速选择工具的画笔大小以更精确地选择区域（F）选择测量命令进行记录（G）测量记录示例。
图3. TGF-β诱导的自发永生化MCF10A1（M1）(A)、RAS转化的MCF10AneoT（M2）(B)及其转移性衍生细胞MCF10CA1a（M4）(C)的球状体侵袭。将M1、M2和M4球状体包埋于胶原中，并按所示用5 ng/mL的TGF-β处理48小时。A-C 分别为包埋当天及两天后的代表性图像。D 侵袭程度通过第2天与第0天面积差值进行相对定量。结果以均值±标准差表示。改编自13。
图4. SB-431542抑制基础状态及TGF-β诱导的球状体侵袭。将M1、M2和M4球状体包埋于胶原中，并根据所示条件用5 ng/ml TGF-β和/或10 μM SB-431542处理。图A为培养2天后的代表性图像。相对侵袭程度通过第2天与第0天的面积差进行量化（图B）。结果以均值±标准差表示。改编自13。
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讨论
我们建立了一种球状体模型，其中 MCF10A1 细胞及其恶性衍生物以 TGF-β 依赖的方式侵入胶原基质。首先，在含有甲基纤维素的 96 孔圆底悬浮培养板中形成球状体。当然，U 形聚羟基乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）包被的培养板也可用于此目的。此步骤中甲基纤维素绝对必需，因为在缺乏甲基纤维素的情况下细胞会死亡。TGF-β 直接加入到胶原-甲基纤维素混合物中，因为我们发现当该因子添加至胶原层上方的培养基中时，细胞对 TGF-β 的反应较弱。然而，建议不要将溶解于 DMSO 中的化学抑制剂直接加入胶原中，因为 DMSO 会在冰冻的胶原-甲基纤维素混合物中析出。因此，我们将这些化合物加入胶原层上方的培养基中。
随后，将细胞嵌入胶原蛋白三维环境中，以使其能够侵入胶原基质。在比较不同MCF10A1细胞系的侵袭特性时，我们发现，从相对良性的M1细胞，到发生RAS转化的M2衍生细胞，再到具有转移特性的M4变体，基础侵袭能力以及TGF-β诱导的侵袭能力依次增强。因此，这些细胞系的侵袭特性与其相对的侵袭性状态相关7,8,14。
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致谢
我们感谢美国纽约OSI Pharmaceuticals的Ken Iwata提供的试剂，以及美国底特律Barbara Ann Karmanos癌症研究所的Fred Miller提供的细胞系。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH 指示试纸 | Merck & Co., Inc. | 9533 | |
| 96 孔悬浮培养板 | Greiner Bio-One | 650 185 | |
| 96 孔黏附性 TC 培养板 | Greiner Bio-One | 655 180 |
参考文献
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