使用寡核苷酸偶联荧光微球在复杂临床和环境样本中进行细菌多重检测

摘要

我们描述了一种利用寡核苷酸偶联的荧光微球对样本中微生物进行多重检测的方法。将样本中所有生物体的扩增子与一组探针偶联的微球进行杂交，然后使用Luminex或Bio-Plex仪器对每种微球进行检测，以识别微球类型及杂交信号。

摘要

细菌性阴道病（BV）是一种反复发作的多微生物综合征，其特征是阴道“正常”菌群从以乳杆菌属（Lactobacillus）为主转变为由多种细菌物种主导的菌群结构，其中包括阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis）、阴道阿托波菌（Atopobium vaginae）等^1-3。该病症与多种不良健康后果相关，包括增加感染HIV的风险⁴，且在临床上较难管理⁵。此外，BV的诊断长期以来依赖于对阴道拭子涂片进行革兰染色，并依据多种数值标准进行评分^6,7。尽管这种诊断方法操作简便、成本低廉，适用于资源有限的环境，但其结果易受主观判读影响，且无法提供阴道菌群组成的详细信息⁸。近期的深度测序研究揭示了阴道菌群具有高度丰富性和多样性，并发现被诊断为BV的个体与被视为正常的个体之间在菌群组成上存在明显差异^9,10，这些发现已促成多个可用于BV分子诊断的潜在靶标被识别^11,12。这些研究提供了大量有价值的信息，但深度测序目前尚不具备在临床环境中作为常规诊断手段的实用性。我们近期描述了一种利用寡核苷酸偶联的荧光微球结合Luminex平台进行多重检测的方法，可快速分析阴道菌群组成¹³。该方法与现有的革兰染色法类似，具有快速、简便的优点，同时在探针设计中引入了来自测序研究的分子生物学知识，从而具备额外优势。因此，该方法能够对阴道拭子中存在的主要微生物进行高特异性和高灵敏度的检测，优于革兰染色法，并以半定量且快速的方式提供有关物种存在及其丰度的附加信息。这种多重检测方法的检测范围远超当前针对特定微生物的定量PCR检测，后者目前在单一样本中通常仅能同时进行5至6种不同检测¹⁴。重要的是，该方法不仅限于阴道拭子中细菌的检测，还可轻松改造用于快速分析几乎所有感兴趣的微生物群落。例如，我们近期已开始将该技术应用于污水处理厂诊断工具的开发。

方案

该方法已用于Dumonceaux报道的研究中 等 J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077, doi:10.1128/jcm.00112-09 (2009)

图1展示了一个描述整体实验流程的示意图。

1. 磁珠偶联

本文描述了将寡核苷酸探针与聚苯乙烯 Luminex 微球偶联所使用的方法（见表2）。为初步评估新的捕获探针，体积略有调整；括号中所示为相应体积。

1. 从 -20°C 干燥器中取出 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）粉末，并使其升至室温。
2. 将微球置于水浴超声仪中进行超声处理 20 秒，随后涡旋振荡约 20 秒以重悬微球。
3. 将 400 μl（100 μl）微球转移至一个 Eppendorf 管中（相当于 5×10⁶ 或 1.25×10⁶ 个微球）。Luminex 建议使用低蛋白结合的微量离心管（例如 Eppendorf Protein LoBind 管，货号 0030 108.094），以防止未偶联的微球粘附管壁而影响回收。我们发现使用标准的聚丙烯微量离心管（例如 VWR 货号 87003-298）通常不会出现此类问题。
4. 在 14000 × g 下离....

讨论

信号生成的特异性至关重要；必须确保所观察到的信号确实反映了来自目标生物扩增子的检测结果。PrimerPlex（Premier Biosoft）等软件可辅助设计能够高效杂交的探针，但这些探针可能存在与非靶标物种发生交叉杂交的风险。当如本实验方案所述使用通用PCR引物时，需注意所生成的扩增子代表了样本中所有存在的生物。因此，有必要通过将探针设计软件推荐的序列与cpnDB（一个cpn60 UT序列数据库）进行比对，分析潜在探针发生交叉杂交的可能性¹⁶；应尽可能避免选择可匹配多种生物的探针。此外，在确定潜在特异性探针后，我们采用一种探针验证策略：构建一个复杂的模拟模板，该模板对应于与目标微生物群相关的多种生物的克隆cpn60 UT序列¹³。随后，从包含靶标模板的完整“混合面板”中生成扩增子，并将其信号与另一个不含靶标生物cpn60 UT的混合面板所产生的信号进行比较。选择那些具有高信噪比（其中信号来自完整面板，噪声来自不含靶标模板的面板）的探针用于最终检测体系。通常情况下，在确定最终Luminex芯片所用探针前，我们会对每种靶标生物的4至5个候选探.......