使用寡核苷酸偶联荧光微球在复杂临床和环境样本中进行细菌多重检测

摘要

我们描述了一种利用寡核苷酸偶联的荧光微球对样本中微生物进行多重检测的方法。将样本中所有生物体的扩增子与一组探针偶联的微球进行杂交，然后使用Luminex或Bio-Plex仪器对每种微球进行检测，以识别微球类型及杂交信号。

摘要

细菌性阴道病（BV）是一种反复发作的多微生物综合征，其特征是阴道“正常”菌群从以乳杆菌属（Lactobacillus）为主转变为由多种细菌物种主导的菌群结构，其中包括阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis）、阴道阿托波菌（Atopobium vaginae）等^1-3。该病症与多种不良健康后果相关，包括增加感染HIV的风险⁴，且在临床上较难管理⁵。此外，BV的诊断长期以来依赖于对阴道拭子涂片进行革兰染色，并依据多种数值标准进行评分^6,7。尽管这种诊断方法操作简便、成本低廉，适用于资源有限的环境，但其结果易受主观判读影响，且无法提供阴道菌群组成的详细信息⁸。近期的深度测序研究揭示了阴道菌群具有高度丰富性和多样性，并发现被诊断为BV的个体与被视为正常的个体之间在菌群组成上存在明显差异^9,10，这些发现已促成多个可用于BV分子诊断的潜在靶标被识别^11,12。这些研究提供了大量有价值的信息，但深度测序目前尚不具备在临床环境中作为常规诊断手段的实用性。我们近期描述了一种利用寡核苷酸偶联的荧光微球结合Luminex平台进行多重检测的方法，可快速分析阴道菌群组成¹³。该方法与现有的革兰染色法类似，具有快速、简便的优点，同时在探针设计中引入了来自测序研究的分子生物学知识，从而具备额外优势。因此，该方法能够对阴道拭子中存在的主要微生物进行高特异性和高灵敏度的检测，优于革兰染色法，并以半定量且快速的方式提供有关物种存在及其丰度的附加信息。这种多重检测方法的检测范围远超当前针对特定微生物的定量PCR检测，后者目前在单一样本中通常仅能同时进行5至6种不同检测¹⁴。重要的是，该方法不仅限于阴道拭子中细菌的检测，还可轻松改造用于快速分析几乎所有感兴趣的微生物群落。例如，我们近期已开始将该技术应用于污水处理厂诊断工具的开发。

方案

该方法已用于Dumonceaux报道的研究中 等 J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077, doi:10.1128/jcm.00112-09 (2009)

图1展示了一个描述整体实验流程的示意图。

1. 磁珠偶联

本文描述了将寡核苷酸探针与聚苯乙烯 Luminex 微球偶联所使用的方法（见表2）。为初步评估新的捕获探针，体积略有调整；括号中所示为相应体积。

1. 从 -20°C 干燥器中取出 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）粉末，并使其升至室温。
2. 将微球置于水浴超声仪中进行超声处理 20 秒，随后涡旋振荡约 20 秒以重悬微球。
3. 将 400 μl（100 μl）微球转移至一个 Eppendorf 管中（相当于 5×10⁶ 或 1.25×10⁶ 个微球）。Luminex 建议使用低蛋白结合的微量离心管（例如 Eppendorf Protein LoBind 管，货号 0030 108.094），以防止未偶联的微球粘附管壁而影响回收。我们发现使用标准的聚丙烯微量离心管（例如 VWR 货号 87003-298）通常不会出现此类问题。
4. 在 14000 × g 下离心 1 分钟，弃去上清液并丢弃。
5. 用 50 μl（12.5 μl）室温下 0.1 M 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液（pH 4.5）重悬微球。
6. 在水中配制新鲜的 EDC 溶液，浓度为 10 mg/ml。
   1. 使用分析天平称取 5–10 mg EDC，加水定容至 10 mg/ml，配制体积小于 1 ml 的该溶液。
7. 向微球中加入 1 nmol 的 5′-氨基-C12 修饰的捕获寡核苷酸（见表 2），并通过涡旋混合。1 nmol 相当于 5 μl 的 200 μM 寡核苷酸溶液。
8. 向微球中加入 2.5 μl 新鲜配制的 EDC 溶液，并涡旋 5 秒以混合。
9. 在室温避光条件下孵育 30 分钟。
10. 弃去 EDC 溶液（步骤 1.6），并按上述方法（步骤 1.6）重新配制一份新鲜的 10 mg/ml EDC 水溶液。
11. 向微球中再加入 2.5 μl 新鲜 EDC 溶液，并涡旋 5 秒。
12. 在室温避光条件下继续孵育 30 分钟。
13. 加入 1 ml 含 0.02% Tween 20 的溶液洗涤微球。通过涡旋（可选：同时超声 20 秒）使微球充分重悬。
14. 在 14000 × g 下离心 1 分钟，弃去上清液并丢弃。
15. 再次加入 1 ml 含 0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS）的溶液洗涤微球。通过涡旋（可选：同时超声 20 秒）使微球充分重悬。
16. 在 14000 × g 下离心 1 分钟，弃去上清液并丢弃。
17. 将微球重悬于 100 μl（25 μl）Tris-EDTA（TE）缓冲液 [10 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0] 中。
18. 使用血细胞计数板或库尔特计数器对微球进行计数，以确定其储存浓度。
19. 将每种微球用 TE 缓冲液稀释至终浓度为 100 个/μl，配制微球主混合液。根据检测所需的多重数（plex）将相应种类的偶联微球混合（例如，对于 10 重检测，将 10 种不同的偶联微球各稀释至终浓度为 100 个/μl 后混合）。
20. 将微球主混合液避光保存于 4°C。若保存条件合适，该混合液可稳定存放数月。

2. 分子伴侣素60通用靶标（cpn60 UT）扩增子的制备及单链生成。

1. 为每个样本制备聚合酶链式反应（PCR）产物。使用5'端修饰有磷硫酰化和生物素的引物组（见表1）。混合体积与浓度详见表3。
2. PCR完成后立即向每个PCR管中加入2 μl（20单位）T7外切核酸酶（PCR缓冲液足以支持T7反应）。将反应体系在室温（~22-25°C）下孵育40分钟。
3. 孵育结束后，加入12.5 μl 0.5 M pH 8.0的乙二胺四乙酸（EDTA），混匀。最终得到约64.5 μl的单链PCR产物。

3. 将单链 PCR 产物与寡核苷酸偶联的聚苯乙烯珠进行杂交。

1. 将仪器预热至 60°C，以在分析过程中维持杂交温度。使用仪器软件开启平台加热器，并确保使用与含有杂交微珠混合物的 PCR 板相匹配的黄铜加热块。
2. 用移液器重悬微球母液（步骤 1.20），取适量加入离心管中，盖紧管盖，在水浴超声仪中超声处理 2 分钟。或者，为确保微珠重悬的绝对一致性，可先通过涡旋和移液重悬微球母液，然后按上述方法进行超声处理，最后将所需量分装至聚丙烯离心管中。
3. 将 17 μl 单链 PCR 产物（步骤 2.2）加入低矮型 96 孔 Thermowell PCR 板（表 2）的相应孔中。每孔加入 33 μl 重悬并超声处理后的微珠混合液。盖上硅胶盖（表 2），轻轻敲击混匀。
4. 将 PCR 板放入热循环仪中，运行如下程序：95°C 5 分钟，60°C 10 分钟，60°C 暂存，60°C 5 分钟，结束。启动程序。
5. 新鲜配制链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）溶液；每孔需 25 μl（建议多配制几孔的量）。将储存液 SA-PE（1 mg/ml）用 1× 四甲基氯化铵（TMAC）缓冲液（3 M TMAC；0.1% Sarkosyl；50 mM Tris-HCl，pH 8.0；4 mM EDTA，pH 8.0）按 1:50 稀释，配制成 20 μg/ml 的 SA-PE 工作液。
6. 当热循环仪进入 60°C 暂存步骤时，打开盖子，移除硅胶盖，直接向各孔加入 SA-PE 溶液（切勿将 PCR 板从热循环仪中取出）。重新盖上硅胶盖，关闭热循环仪盖子，继续运行程序。
7. 程序结束后，取出 PCR 板并迅速转移至 BioPlex 仪器中进行读数。必须在 10 分钟内完成读板。读板温度设为 60°C；确保 BioPlex 仪器已预热至该温度。务必根据所用仪器用户手册中的说明，调整探针高度以适配所使用的 PCR 板。
8. 为实现准确的微球识别与信号检测，BioPlex 的门控设置必须根据所用微球类型进行调整。BioRad 聚苯乙烯微球的门控范围应设为 4,335–10,000，而磁性微球则需设为 5,000–25,000。也可选择使用高 PMT 设置运行 PCR 板，该设置可提高报告信号增益值，从而增强弱信号的强度；但需注意，背景信号也会随之升高，因此必须设置适当的阴性对照。

4. 代表性结果：

开发和实施本检测方法的目标之一是使其尽可能简单和高效。因此，我们优化了关键的扩增后步骤，包括T7核酸外切酶处理时间和杂交时间，以建立可在合理时间内完成的检测流程。如图2A所示，扩增产物的T7处理对信号生成至关重要，因为大多数探针在T7处理时间较短或未处理时信号极弱或无信号。信号在约40分钟内呈线性增加，此后信号增长减缓。即使T7处理时间长达2小时，也未观察到信号降解，表明引物的硫代磷酸酯修饰在防止靶链降解方面具有高度有效性，如文献¹⁵所述。我们选择40分钟作为T7处理时间，以尽量缩短整体操作时间，但从图2A可见，T7处理时间可更长。我们还确定了杂交时间对信号生成的影响（图2B），发现10分钟即可达到最大信号，即使延长至4小时杂交时间，信号亦无进一步增加。因此，选择10分钟的杂交步骤，同样是为了最大限度地缩短整体检测时间。结合这些结果以及InstaGene（Bio-Rad）等快速DNA提取技术，整个检测流程（包括DNA提取、PCR和Luminex分析）可在4至5小时内完成。

需要注意的是，在进行 Luminex 或 BioPlex 实验时，聚苯乙烯微球的聚集程度可能对检测效率产生重大影响。BioPlex 软件会显示微球的聚集水平，当激光路径中检测到多个微球时即发生聚集，导致聚集体的杂交信号被排除。明显的微球聚集也可能由任何尺寸不符合单个微球标准的颗粒物质引起，甚至可能由气泡导致。在上述任何情况下，来自微球聚集体、气泡或颗粒的信号将被舍弃。大多数情况下，我们发现微球聚集程度极低（图3A），每种微球达到100个计数事件的目标水平很容易实现。然而，偶尔微球会出现中度（图3B）或严重（图3C）的聚集。在这种情况下，由于大部分数据被舍弃，仪器可能难以达到每种微球类型100个事件，结果可能不可靠。超声处理步骤（步骤3.2）旨在最大限度减少微球聚集。此外，将微球储存为稀释的微球母液混合液（步骤1.20）可能有所帮助。我们注意到，从杂交缓冲液中去除TMAC，改为将其加入SA-PE稀释液中（步骤3.5），有助于减少微球聚集。此外，尽管我们尚未对此进行测试，但据认为 Luminex 或 BioRad 推出的新型磁性微球具有更低的聚集倾向。

应用针对 G. vaginalis、A. vaginae、L. iners、L. crispatus 和 L. gasseri 的5重Luminex阵列，并结合相应的革兰染色阴道拭子涂片，其结果如图4所示。这些样本来自同一名个体在多个时间点的采集。在时间点0，根据革兰染色结果（图4A），该个体被诊断为细菌性阴道病（BV），同时使用相同样本进行的Luminex检测结果（图4B）显示，在阵列所涵盖的微生物中，G. vaginalis 占比最高，而 A. vaginae 和 L. iners 也呈阳性。9天后，该个体仍为BV阳性，G. vaginalis 的信号显著增强，A. vaginae 和 L. iners 仍呈阳性。重要的是，此后该个体开始向正常菌群转变，革兰阳性杆菌在涂片中变得可检出（图4A），同时 G. vaginalis 的信号减弱，而 L. iners 的信号增强（图4B）。根据本方法对BV的原始定义（样本中 G. vaginalis 和/或 A. vaginae 呈阳性即判定为BV阳性）¹³，该个体在所有时间点均为BV阳性，尽管在后两个时间点革兰染色未能检测到 G. vaginalis。通过本文所述的Luminex方法，可轻松将检测趋势与基于测序的方法进行比较，且Luminex检测结果通常与革兰染色结果一致¹³，同时还能提供有关微生物种类及其丰度的额外信息。

图1. 采用Luminex技术测定复杂临床或环境样本中微生物群谱的流程示意图。该流程起始于从目标样本中提取的模板DNA。（1）使用链特异性的生物素标记、硫代磷酸酯修饰的cpn60 UT PCR引物与未修饰的cpn60 UT PCR引物（见表1）进行PCR扩增，生成PCR产物；（2）由此获得代表样本微生物群的PCR产物池，其中一条链带有生物素-硫代磷酸酯修饰；（3）用T7外切酶消化双链PCR产物，该酶无法降解硫代磷酸酯修饰的链，从而产生在5'端带有生物素修饰的单链DNA；（4）将聚苯乙烯微球与物种特异性的cpn60 UT探针偶联——每种微球具有独特的光谱地址（以微球颜色表示），可被Luminex或Bio-Plex仪器识别；（5）将来自目标样本的单链PCR产物与一系列偶联了物种特异性寡核苷酸的微球进行杂交；（6）加入链霉亲和素-藻红蛋白偶联物，其可结合至带有生物素标记的单链PCR产物，作为杂交发生的信号指示；（7）使用Luminex或Bio-Plex仪器测定各微球的光谱地址（微球身份）及杂交信号强度。对每种微球至少计数100个，报告藻红蛋白信号的中位荧光强度（MFI）作为输出结果。最多可同时检测100种不同类型的微球，但本图仅展示三种微球类型的区分情况。（8）当同一样本的PCR重复样本所产生的MFI显著高于阴性对照（单尾学生t检验，p<0.05）时，即判定该样本对该特定微生物呈阳性。

图2. Luminex检测参数的优化。使用五种针对Peptostreptococcus anaerobius的不同探针，与由含20种已知与阴道相关细菌（包括P. anaerobius）的cpn60 UT克隆片段的质粒混合模板所生成的扩增子进行反应。(A) T7核酸外切酶处理时间的影响。按照上述方案操作，但在杂交前改变T7核酸外切酶的处理时间，并测定所有探针的中位荧光强度（MFI）。(B) 杂交时间的影响。按照上述方案操作，采用不同的杂交时间，使用与(A)中相同模板生成的扩增子及相同的探针组，测定所有探针的中位荧光强度（MFI）。

图 3. 使用 BioPlex 软件确定微球聚集情况。图中展示了三次 BioPlex 运行的示例，其微球聚集水平分别为 (A) 可接受（5%）；(B) 临界（50%）；(C) 不可接受（80%）。

图4. 对同一位个体连续采集的样本应用5重Luminex阵列进行细菌性阴道病（BV）诊断。(A) 经革兰染色的玻片，显示用于评估各样本BV状况的传统诊断方法。(B) 对(A)中所示相同四个样本，应用本方案所述制备与操作的5重Luminex阵列。根据我们定义的标准（单尾Student t检验，p<0.05），MFI信号显著阳性的细菌靶标以星号（*）标示。

讨论

信号生成的特异性至关重要；必须确保所观察到的信号确实反映了来自目标生物扩增子的检测结果。PrimerPlex（Premier Biosoft）等软件可辅助设计能够高效杂交的探针，但这些探针可能存在与非靶标物种发生交叉杂交的风险。当如本实验方案所述使用通用PCR引物时，需注意所生成的扩增子代表了样本中所有存在的生物。因此，有必要通过将探针设计软件推荐的序列与cpnDB（一个cpn60 UT序列数据库）进行比对，分析潜在探针发生交叉杂交的可能性¹⁶；应尽可能避免选择可匹配多种生物的探针。此外，在确定潜在特异性探针后，我们采用一种探针验证策略：构建一个复杂的模拟模板，该模板对应于与目标微生物群相关的多种生物的克隆cpn60 UT序列¹³。随后，从包含靶标模板的完整“混合面板”中生成扩增子，并将其信号与另一个不含靶标生物cpn60 UT的混合面板所产生的信号进行比较。选择那些具有高信噪比（其中信号来自完整面板，噪声来自不含靶标模板的面板）的探针用于最终检测体系。通常情况下，在确定最终Luminex芯片所用探针前，我们会对每种靶标生物的4至5个候选探...