视网膜切片中单个神经末梢的膜片钳电容测量与 Ca2+ 成像

摘要

本文介绍一种制备适用于电生理学和Ca²⁺成像的琼脂包埋视网膜切片的实验方案。该方法可利用对单个突触前神经末梢的直接膜片钳记录，研究视网膜微环路中的带状突触。

摘要

在脊椎动物视网膜中，特化的神经元能够在广泛的光强动态范围和频率变化下检测并传递视觉刺激。视网膜中的两类神经元——光感受器和双极细胞——通过使用带状突触活性区实现了长时间持续且高通量的神经递质释放。金鱼视网膜中的ON型混合双极细胞（Mb）末梢在受到光刺激时发生去极化，并接收来自视杆和视锥光感受器的混合输入，因其体积较大（直径约10–12 μm）以及与无长突细胞树突之间存在大量侧向和相互突触连接，非常适合用于研究带状突触。利用膜片钳技术直接记录金鱼视网膜切片中Mb双极细胞末梢，可测量突触前Ca²⁺电流、膜电容变化，以及由末梢上表达的GABA_A和GABA_C受体介导的相互突触反馈抑制。通过突触前膜电容测量胞吐作用，可研究兴奋性神经递质释放的短期可塑性^14,15。此外，通过记录到达Mb末梢的相互反馈抑制信号，也可探究无长突细胞抑制性神经递质释放的短期和长期可塑性²¹。在较短时间内（例如约10秒），来自无长突细胞的GABA能相互反馈抑制会通过GABA囊泡池的耗竭而产生成对脉冲抑制效应¹¹。因此，视网膜内丛状层中视网膜微环路的突触动态可被直接研究。

脑片技术在40多年前被引入，至今仍广泛用于研究神经元的电学特性，无论是单个细胞的胞体、单个树突或轴突，还是微环路突触水平的研究¹⁹。对于体积过小而无法直接粘附在切片室上的组织，通常先将其包埋于琼脂中（或放置在滤纸上），然后再进行切片^{20, 23, 18, 9}。在本视频中，我们采用预包埋琼脂技术，以金鱼视网膜为材料。在切片过程中，部分金鱼视网膜切片中的巨大双极细胞终末会发生轴突切断（轴突被切断）。这一特性使我们能够分离单个突触前神经末梢的输入信号，因为对已切断轴突的终末进行记录时，可排除胞体-树突区室的信号干扰。此外，也可以通过记录那些在切片过程中轴突未被切断且仍与终末相连的Mb型双极细胞，来对完整的双极细胞进行记录。总体而言，采用本实验方案将有助于视网膜突触生理学、微环路功能分析以及带状突触（ribbon synapses）突触传递的研究。

方案

1. 外部溶液与内部溶液

1. 使用10倍浓缩液配制切片液（低钙），每日添加MgCl₂、CaCl₂和D-葡萄糖。最终1倍溶液的成分为（单位：mM）：119 NaCl、2.5 KCl、3.2 MgCl₂、0.25 CaCl₂、12 D-葡萄糖、0.2 L-抗坏血酸、12 HEPES。用NaOH调节pH至7.4，并通过H₂O和10倍浓缩液调节渗透压至260 mOsm。
2. 称取3%低凝胶温度琼脂（Agarose type VII-A, A0701, Sigma; Rieke, 2001），与切片液混合。将含琼脂的溶液在微波炉中加热1–2分钟，或直至完全溶解，随后将琼脂置于水浴（30–33°C）中孵育，以防止快速凝固（凝胶相变温度：26 ± 2°C）。
3. 使用10倍浓缩液配制记录液（正常钙），每日添加MgCl₂、CaCl₂和D-葡萄糖。最终1倍溶液的成分为（单位：mM）：100 NaCl、2.5 KCl、1 MgCl₂、25 NaHCO₃、0.2 L-抗坏血酸、2.5 CaCl₂、12 D-葡萄糖。用95% O₂ / 5% CO₂（碳合气）鼓泡5–10分钟后，用NaOH调节pH至7.4，并通过H₂O和10倍浓缩液调节渗透压至260 mOsm。
4. 提前分装内液（每份1 ml），并储存在-20°C冰箱中。通常使用两种不同的电极内液以分离双极细胞的钙电流（单位：mM）：
   1. 40 CsCl、60 Cs-葡萄糖酸盐、10 四乙基铵（TEA）-Cl、28 HEPES、3 Mg-ATP、1 Na-GTP和2 EGTA。用CsOH调节pH至7.2，渗透压设定为250 mOsm。这种高氯内液通常可获得较低的串联电阻记录（更佳的电压钳制条件），并在双极细胞静息膜电位为-60 mV时产生更大的抑制性突触后电流（IPSCs）。
   2. 95 Cs-葡萄糖酸盐、10 TEA-Cl、25 HEPES、3 Mg-ATP、0.5 Na-GTP和0.5 EGTA。用CsOH调节pH至7.2，渗透压设定为250 mOsm²²。这种低EGTA内液通常可引发去极化阶跃脉冲下更大的膜电容变化，从而便于研究囊泡池耗竭和短期突触抑制。

2. 膜片钳移液电极

1. 使用厚壁（外径1.5 mm）硼硅酸盐玻璃管（1B150F-4；World Precision Instruments，Sarasota，FL），并用垂直拉制仪（Narishige，PP830；Tokyo，Japan）拉制记录电极。当电极充满内液溶液#1时，在记录溶液中敞口电极的电阻为7–8 MΩ。
2. 用牙科蜡（Cavex，West Chester，PA）均匀涂覆记录电极，从尖端至插入电极夹持器的杆部位置。此步骤可最大限度降低电极电容和电噪声，从而实现更精确、低噪声的电容测量。较低的电极电容也有助于EPC-9（或EPC-10）膜片钳放大器的快速电容（C-fast）电子补偿。

3. 琼脂包埋视网膜切片的制备

1. 选取一条金鱼（Carassius auratus；8–16 cm），置于黑暗房间中带盖的桶内，进行30分钟暗适应。麻醉后，通过快速断头并双重损毁脊髓和脑干处死已镇静的金鱼。随后使用弯头剪刀和弯头镊子摘除眼球。上述操作已获得俄勒冈健康与科学大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
2. 使用弹簧剪刀（15003-08，Fine Science Tools；先用剪刀尖刺破组织以起始切割）沿眼球前部均匀环切，将每个眼球切成两半，并将眼杯放入冰浴切片液（低钙）中。如有必要，用镊子移除晶状体（晶状体通常随眼球前部一起脱落）。使用一对45°角尖端精细镊子（11251-35，Fine Science Tools）从眼杯上缓慢剥离附着色素上皮的视网膜，沿360°方向逐步进行。用精细镊子或弹簧剪刀切断或剪断视神经。结合使用角形尖端精细镊子和经改造的巴斯德移液管或转移移液管（大口径）施加的轻柔吸力，小心取出视网膜。使用角形尖端精细镊子去除仍附着在视网膜上的残余色素上皮。清洁且健康的视网膜表面应呈深色、光滑且呈红色。为彻底清除所有深色色素上皮细胞，需将视网膜暗适应1小时（⁸, 1992）。
3. 将分离的视网膜置于约0.03%（质量/体积；相当于1×切片液中约0.36 mg/mL）的透明质酸酶（³；H6254，Sigma）中，在室温（20–23°C）下处理15–30分钟，以去除玻璃体。在此孵育期间，可准备冰浴切片液。
4. 将一片小刀片（Personna，双刃，用70%乙醇和H₂O清洗）固定在1 mL塑料注射器体上，用其切除视网膜边缘弯曲部分，获得一块矩形视网膜组织（约2×2 mm，包含完整视网膜厚度），并将该视网膜组织转移至盛有琼脂溶液（按(1.2)制备）的小容器中。将视网膜放入液态琼脂时，应尽量减少其周围的溶液量。直接浸入冰浴切片液（按(3.3)制备）中，使琼脂凝固^{20, 18, 9}。我们使用一种小型自制容器：简而言之，将一个小型圆柱形管（Fisherbrand，聚乙烯样品瓶 2.5 ml，03-338-1B）两端剪开，并用Parafilm（PM-996，Pechiney Plastic Packaging）封口。
5. 将凝固的琼脂块切割成1×1×1 cm的立方体，其中包含矩形视网膜组织。
6. 将琼脂块转移至切片室，并将其粘附于切片板表面。切片室预先在冷冻箱（-20°C）中冷却。在冰浴切片液中，使用振动切片机（VT1000S 或 VT1200S，Leica）将琼脂块切成200–250 μm厚的切片。总共可获得5至10片切片，其活性可维持约5至6小时。
7. 将其中一片切片转移至记录室。将固定在U形铂金框架上的尼龙丝网格¹⁹置于切片上方，并持续灌流经95% O₂/5% CO₂（碳合气）饱和的记录液（流速为每分钟1–2 mL）。

问题排查：

如果包埋在琼脂块中的视网膜组织在切片过程中脱落或从琼脂中移出，可将切片厚度从200 μm逐步增加至300 μm，每次增加20 μm。此外，在将视网膜转移并放入液态琼脂时，应尽量减少其周围的溶液量，可通过使用卷成尖头的“Kimwipe”纸巾吸除多余液体。另一种避免此问题的方法是减小最初放入琼脂中视网膜组织的尺寸。由于玻璃体阻碍琼脂与视网膜组织充分粘附，可能需要重新配制新鲜的透明质酸酶或调整孵育时间（步骤 (3.3)）。

4. 视网膜切片中双极细胞突触终末的鉴定

1. 将视网膜切片置于直立显微镜下（例如 BX51WI，Olympus）。我们通过60倍水浸物镜（NA 0.90，Olympus）和CCD相机（XC-75，Sony）使用红外微分干涉差（IR-DIC）光学系统观察视网膜切片。CCD相机的输出信号被送至相机控制器（C2400，Hamamatsu）进行对比度增强，然后在模拟的Sony 13英寸黑白显示器上显示。显微镜安装在X-Y平移台上，记录室则置于固定台面上¹⁴。
2. 寻找完整或轴突切断（轴突被切断）的双极细胞终末，这些终末可通过其大小、形状及在切片中的位置进行识别（图1）。轴突切断与完整的终末还可通过其电容性瞬态电流衰减时间（分别为单指数衰减与双指数衰减）以及Ca²⁺电流加以区分（图2；^{12, 14, 15}）。Mb终末位于金鱼视网膜内丛状层的b亚层最靠近内核层的一层（ON型层；邻近节细胞层）。Mb终末表面暗淡、形态扁平，易于与相位明亮且呈球形的节细胞和移位无长突细胞胞体相区分。此外，Mb终末边缘密布突触接触点，与节细胞和无长突细胞光滑洁净的表面相比，其表面显得粗糙且不规则（图1a-c）。轴突切断的Mb终末呈圆形或近似圆形（图1c），而完整的终末则呈椭圆形并被拉长，通常一端变窄，指向视网膜的内核层（图1a,b）。
3. 受损或不健康的终末常表现为肿胀，并在表面出现多个小颗粒状结构。虽然可能在这些终末上获得吉欧姆（GΩ）级封接，但它们在破膜后很快可能发生破裂。其他不健康终末的表现包括空心状外观、对比度和/或亮度与周围切片组织相同，有时位于切片表面。既可在切片深层的健康终末上进行记录（优点：突触回路更完整），也可在切片表面附近进行记录（优点：灌流药物更快到达细胞外液；更容易形成封接）。

5. 电生理记录与Ca²⁺成像

1. 使用带有 0.2 μm 滤尖（Nalgene），用内液填充玻璃膜片电极，液面距电极后端1-2厘米。去除尖端气泡后，将电极固定于电极夹持器中，施加正压（1.2-1.6 psi），并使用显微操作器（MPC-200，Sutter Instrument）将其移向目标终末。当下移电极穿过脑片时，应同时进行横向扫动，以确保脑片不随电极尖端被牵拉。
2. 移动移液管尖端在电极周围以清洁膜表面。将尖端向下推压电极边缘形成一个小凹陷（压痕），并释放正压。如果未立即形成吉欧（GΩ）封接，可施加轻微负压。
3. 形成 GΩ 级封接后，切换至 EPC-9 膜片钳放大器的细胞贴附记录模式，并将钳制电位更改为 -60 或 -70 mV。应用 C-fast（快电容）补偿，等待封接电阻稳定在 5-10 GΩ 之间，然后通过口吸管施加短促而轻柔的负压以破膜，建立全细胞记录构型。若全细胞构型已正确建立，串联电阻应在 14-30 MΩ 之间。输入电阻方面，完整末梢为 200-500 MΩ，轴突切断末梢为 1-3 GΩ。 ¹⁴.
4. 观察电容性瞬态电流（图2a和2c），以区分完整的和轴突切断的双极细胞终末。完整的和轴突切断的Mb终末的静息膜电容分别为9-16 pF和3-8 pF。
5. 对轴突切断的Mb终末施加一个持续时间为200 ms、从-70 mV到0 mV的电压钳阶跃。这将允许直接测量大（约200–600 pA）、分离的内向Ca²⁺ 由电压依赖性L型Ca通道开放所激活的电流²⁺ 通道（图2b）。同时，可以监测由突触小泡胞吐引起的电容跃变，以及快速的pH介导的Ca²⁺ 胞吐后电流 ¹⁵，以及GABA能的相互反馈抑制（图3c; ²²）。如果对完整的Mb双极细胞终末进行膜片钳记录，结果将如所示 图2c和2d。无明显的Ca²⁺ 由于Mb双极细胞树突间存在缝隙连接耦合，导致较大的“漏”电流，因而观察到电流 ¹.
6. 使用时间分辨膜电容测量的“正弦波+直流”法，可通过从保持电位 -70 mV 阶跃去极化至 0 mV 来诱发膜电容变化 ⁶膜电容的跳跃表明突触囊泡与质膜的融合。在-70 mV的保持电位基础上施加一个2 kHz的正弦电压钳制指令（峰峰值30 mV）。采用EPC-9膜片钳放大器软件模拟锁相放大器（HEKA，Lambrecht，德国）在两个正交相位角分析记录电流。在完整末梢中 图 2d，高频（2 kHz）正弦刺激可将分析的膜电容限制在终末和轴突，这些区域的基础电容Cm约为6.8 pF。双极细胞的胞体和树突膜因此被高频电压钳正弦波滤除 ¹³.
7. 对于 Ca²⁺成像实验，将细胞内式膜片钳电极液与 Ca 充分混合²⁺-敏感的荧光染料（例如 Oregon Green 488 BAPTA-1（100-200 μM；O-6806，Invitrogen）并从步骤5.1至5.5重复实验流程。这将实现荧光成像与电生理记录的联合应用。例如，可对Ca²⁺ 与Mb终末小端树突突起中从-70 mV到0 mV、持续200 ms的电压阶跃相关的瞬态电流图3a,b）。我们将奥林巴斯倒置显微镜与转盘激光共聚焦显微镜系统（CSU-X1，Yokogawa）相结合。该共聚焦显微镜采用声光可调滤波器调节的488 nm和561 nm激光线。数据通过Slidebook软件（3i；Intelligent Imaging Instruments）采集。有关使用金鱼视网膜神经元进行钙成像技术的更多细节，请参见 ^{24, 17, 3}.

问题排查：

如果在形成稳定的吉欧姆（GΩ）封接后仍经常无法建立全细胞记录模式，可以尝试降低用于穿破终末膜的负压。此外，建立全细胞记录模式所需的最佳吸力可能随膜曲率的不同而变化（胞体 > 末梢）。也可使用“zap”程序（幅度：400 mV，持续时间：100 μs）进入全细胞记录模式，可单独使用或与短暂的负压脉冲联合使用。我们发现，当移液管尖端在浴液中的电阻超过12 MΩ时，zap程序在破膜过程中尤为有效。

6. 代表性结果

图1. 在金鱼视网膜切片中鉴定 Mb 双极细胞终末。a-c红外微分干涉对比成像下的Mb双极细胞终末。我们可以在红外微分干涉对比图像中识别出可能是轴突切断的（轴突被切断）和完整的终末。轴突切断的终末呈圆形或环状，如图所示。 c 而完整的末端更可能呈椭圆形，如图所示 a 和 b。该分类可通过瞬态电容测量法（见图2）或染料填充法加以验证（d-f。红色箭头指示完整末梢中轴突与轴突末梢交界处的位置 a 和 b红色虚线表示Mb双极细胞终末的轮廓。d-f). 具有完整轴突的Mb双极细胞终末的荧光图像（d），部分切断的轴突（e)，或完全移除的轴突（f。记录前，将 Alexa 555（A20501MP，Invitrogen）荧光染料加入内液中。膜片钳记录完成后，立即将视网膜切片转移至含 4%（wt/vol）多聚甲醛（P6148，Sigma）的磷酸盐缓冲液（70013，GIBCO）中，固定 30 分钟。随后将切片置于含抗荧光淬灭剂的水性封片剂（Biomeda corp）中，贴附于 Superfrost 载玻片（Fisher Scientific）上。使用共聚焦激光扫描显微镜（LSM 710，Carl Zeiss）配备 40 倍水浸物镜，以 555 nm 激光线（红色）观察含 Alexa 555 的 Mb 双极细胞终末。注意轴突终末处伸出的小型端树突突起（蓝色箭头）。比例尺表示 10 μm (a-f）。INL：内核层，IPL：内丛状层，GCL：节细胞层。

图 2. 轴突切断和完整 Mb 双极细胞终末的电学特性。（a，c）通过电压钳制阶跃超极化从钳制电位 -60 mV 变为 -70 mV 所激活的瞬时电流反应。-10 mV 电压钳制阶跃引起的短暂电流反应可能表现为：1）在 -70 mV 时具有高输入电阻的单相快速指数衰减（提示为轴突切断的终末；图 a）；或 2）在 -70 mV 时具有低输入电阻的双指数衰减（提示为完整的终末；图 c；另见^{12, 14, 15}）。（b，d）通过从 -70 mV 阶跃去极化至 0 mV 诱发 Ca²⁺ 电流和膜电容跳跃。时间分辨的膜电容测量采用叠加在 -70 mV 静息钳制电位上的 2-kHz 正弦波刺激⁶。红色轨迹为电容数据点的平均值。注意图 2b 和 2d 中的电容跳跃均约为 200 fF。

图 3. 在 Mb 双极细胞末梢中对 Ca²⁺ 成像信号、胞吐作用及抑制性反馈的直接测量。（a）通过电压钳阶跃去极化（从 -70 mV 至 0 mV，持续 200 ms，箭头所示），激活了 Mb 末梢端树突中 Ca²⁺ 浓度的瞬时升高。Oregon Green 488 BAPTA-1（100 μM），一种 Ca²⁺ 指示荧光染料，被加入记录电极内液中。（b）Mb 端树突对应的荧光图像（感兴趣区域由红色虚线标示）。（c）神经递质释放（胞吐作用）的短期突触抑制。由一对持续 20 ms、间隔 200 ms 的去极化脉冲（上迹线）诱发的 Ca²⁺ 电流（中迹线）和膜电容变化（下迹线）。箭头指示了胞吐释放的质子对 Ca²⁺ 电流的影响，以及来自邻近无长突细胞的 GABA 能反馈性抑制作用^{15, 21}。注意，质子介导的 Ca²⁺ 电流抑制以及 GABA 能反馈性抑制仅出现在第一次去极化反应中，该反应同时伴随因突触囊泡胞吐所引起的电容跳跃。

讨论

本方案中的一个关键且困难的步骤是将视网膜组织转移至琼脂溶液中（方案 3.4）。必须仔细去除视网膜组织上的玻璃体以及残留的切片溶液，并在转移过程中避免组织发生扭曲或弯曲。为实现这一目标，我们使用一种尖端弯成90°角的小铲（21-401-25B，Fisherbrand）以及弯头镊子（11251-35，Fine Science Tools），在切片溶液中全程辅助定位视网膜组织。视网膜切片及小铲表面残留的溶液可通过折叠或卷起的Kimwipes（Kimberly-Clark）纸巾一角轻轻蘸拭去除。

制备视网膜横切片的另一种常用方法是基于滤纸的方案²³。简言之，将整片视网膜倒置并贴附于一片Millipore滤膜（节细胞层紧贴滤纸，感光细胞层朝上），然后使用手动垂直“拇指”切片器（例如Narishige ST-20）切成250 μm厚的切片。我们发现，基于滤纸的方案优势在于可获得更健康的感光细胞，并提高轴突切断的Mb终末与完整Mb终末的比例。因此，我们采用这种滤纸法来诱发嵌于视网膜切片中的单个Mb终末的光反应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低凝胶温度琼脂	Sigma-Aldrich	A0701	琼脂糖VII-A型
膜片钳移液管	World Precision Instruments, Inc.	1B150F-4	厚壁（外径1.5 mm）硼硅酸盐玻璃
垂直拉制仪	Narishige International	PP830
牙科蜡	Cavex
弹簧剪刀	Fine Science Tools	15003-08
45° 斜角精细镊子	Fine Science Tools	11251-35
剃须刀片	Personna Medical Care		双刃，用70%乙醇和H2O清洗
圆柱形管	Fisher Scientific	03-338-1B	2.5 ml聚乙烯样品瓶
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H6254
振动切片机	Leica Microsystems	VT1000S 或 VT1200S
直立显微镜	Olympus Corporation	BX51WI
60倍水浸物镜	Olympus Corporation	LUMPlanFl	数值孔径 0.90
CCD相机	Sony Corporation	XC-75
相机控制器	Hamamatsu Corp.	C2400
显示器	Sony Corporation		13”黑白显示器
注射器滤器	Nalge Nunc international		0.2 μm
微操纵器	Sutter Instrument Co.	MPC-200
锁相放大器	HEKA Instruments		EPC-9/10放大器具有软件模拟功能
转盘激光共聚焦显微镜	Yokogawa	CSU-X1	膜片钳全细胞记录后的活细胞成像
Slidebook软件	Intelligent Imaging Instruments (3i)		成像数据采集与分析
对苯二甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
磷酸盐缓冲液	GIBCO, by Life Technologies	70013
Superfrost载玻片	Fisher Scientific		载玻片
抗荧光淬灭剂	Biomeda corp.
共聚焦激光扫描显微镜	Carl Zeiss, Inc.	LSM 710	固定组织成像
刮勺	Fisher Scientific	21-401-25B
手动垂直切片器	Narishige International	ST-20
Oregon Green 488 BAPTA-1	Invitrogen	O-6806	Ca2+敏感型荧光染料
Alexa Fluor 555 肼	Invitrogen	A-20501MP	荧光染料