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用于揭示创伤后应激障碍神经、血液学及行为相关性的动物模型中的生物标志物

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DOI：

10.3791/3361

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2012年10月10日

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1Department of Psychiatry, Center for the Study of Traumatic Stress, Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, Maryland, 2Department of Gene and Protein Biomarkers, GenProMarkers, Inc.

本文内容

摘要

我们描述了一种创伤后应激障碍（PTSD）的大鼠模型，该模型揭示了神经内分泌功能的持续性改变以及延迟出现的长期过度恐惧反应，这些特征与PTSD患者的表现一致。本文所述的动物模型和方法可用于关联脑核团中的生物标志物（具有机制性意义但无法在患者中检测）与外周白细胞中的生物标志物（可检测）。

摘要

确定能够代表创伤后应激障碍（PTSD）病理生理演变过程的生物标志物至关重要，这不仅有助于实现客观诊断，还可用于评估治疗效果以及个体对创伤的恢复力。当前研究正致力于通过受试者的血液、唾液、尿液及死后脑组织等生物样本，寻找PTSD的分子生物标志物，包括由创伤应激诱导产生的蛋白质、转录组、基因组变异及遗传调节因子。然而，外周样本或死后样本中这些生物标志物分子与PTSD精神症状相关的大脑功能改变之间的关联仍不明确。本文介绍一种PTSD动物模型，可同时采集并测量外周血和中枢脑组织中的生物标志物以及行为表型，从而建立中枢生物标志物与外周生物标志物及行为表型之间的必要关联。中枢生物标志物具有机制性和特异性诊断价值，但无法直接从患者中获取；而外周生物标志物和行为表型则可无创或易获取，因此该模型为连接二者提供了重要桥梁。

我们的创伤后应激障碍（PTSD）动物模型采用连续三天重复的束缚与尾部电击——即大鼠的不可逃避尾部电击模型（ITS）。该ITS模型可模拟PTSD的病理生理过程17, 7, 4, 10。我们及其他研究者已证实，ITS模型可诱导出与PTSD患者相似的行为学和神经生物学改变17, 7, 10, 9。具体而言，这些应激大鼠表现出以下特征：（1）在应激结束数天后出现延迟且增强的惊跳反应；鉴于大鼠生命周期相对于人类更为短暂，这一延迟对应于PTSD患者症状出现的时间延迟（1至3个月），符合DSM-IV-TR PTSD标准D/E13；（2）血浆皮质酮（CORT）水平在数天内升高，提示下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）功能受损；（3）应激结束后体重增长减缓，提示代谢调节功能障碍。

本模型所采用的实验范式包括：（1）通过测量大鼠的听觉惊吓反应（ASR）及记录体重变化来评估其习得性无助行为范式；（2）将大鼠脑组织精细解剖为不同脑区和神经核团；（3）采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血液中CORT的水平；（4）基因表达微阵列分析及相关生物信息学工具18。该微阵列被称为rMNChip，专注于大鼠线粒体及与线粒体相关的核基因，旨在特异性地研究假定参与创伤后应激障碍（PTSD）的神经元生物能量学机制。

方案

1. PTSD 的动物行为模型

  1. 受试对象：使用雄性白化 Sprague Dawley 大鼠（Taconic Farms, Derwood, MD），在施加应激方案时体重为 150 至 200 g。
  2. 食物、饮水摄入量及体重增长的测量：大鼠到达实验室时体重为 100 ± 25 g，每笼饲养两只（笼具尺寸：45×24×20 cm）。笼内垫料（木屑）每周更换两次。实验前一周，动物饲养于温度（22 ± 4 °C）和相对湿度（30–70%）受控的环境中，采用反转的 12 小时光照周期（光照时间：1800–0600，熄灯时间：0600–1800）。在饲养笼内可自由获取水和标准颗粒饲料（Harlan（2018）18% 蛋白质啮齿类动物饲料，Global diets, Harlan Teklad），并在应激开始前 3 天、应激期间 3 天以及应激结束后 3 天每日记录体重。
  3. 适应性训练：大鼠在动物实验设施及声学惊跳检测室中适应三天。为使其适应声学惊跳检测室，实验前连续三天每天在检测室内操作动物 5 分钟。
  4. 应激方案：根据动物体重和基线惊跳反应将其均等地分配至各组。实验分为两组，每组包含 16 只动物。第 1 组接受应激处理，第 2 组为对照组。
    应激暴露方案为持续 2 小时的程序，每次会话包括“不可逃避”的束缚和尾部电击，连续 3 天每天重复一次。应激处理在上午（0800 至 1200 时间窗内）进行。动物被固定于通风的聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）管中以实现束缚。通过尾部施加 40 次电刺激（2 mA，持续 3 秒；Animal Test Cage Grid Floor Shocker, Coulbourn Instruments, USA），刺激间隔为 150 至 210 秒的半随机间隔（使用 Graphic State Notation 软件，Habitest Universal Link, Coulbourn Instruments, USA）。选择 2 mA 的刺激强度是因为当刺激输出施加于实验者手指时具有厌恶性但不引起疼痛。使用棉签涂抹电极凝胶，在电极与大鼠尾部皮肤之间形成一层薄薄的导电凝胶。调整电极夹并连接至尾部，以确保良好接触，同时不影响尾部血液循环。
  5. 声学惊跳反应（ASR）：声学惊跳反应测量使用 Startle Response Acoustic Test System（Coulbourn Instruments, Columbus, Ohio, USA）3。该系统由位于隔音室内的重量敏感型平台组成。每个惊跳平台内的传感器（应变仪）在使用前需进行校准。首先，耦合器必须处于直流耦合（DC coupled）模式以进行校准。在此模式下，耦合器输出直接跟随平台输入，这是使用静态重量校准所必需的模式。实验过程中传感器切换至交流耦合（AC coupled）模式，仅输出快速的力变化信号，即代表惊跳反应。因此，动物对声音刺激的运动反应通过每个平台内部的应变仪测量为电压变化，并记录为在惊跳刺激开始后 200 ms 内出现的最大反应值。
    共有六种刺激试验类型：仅 100 dB、100 dB 加预脉冲、仅 110 dB、110 dB 加预脉冲、仅预脉冲以及无刺激对照。每种试验类型呈现八次。试验类型以随机顺序呈现，以避免顺序效应和习惯化。试验间间隔随机设定为 15 至 25 秒。在八次试验中仅采集最大值，并最终根据同日动物体重进行调整。动物在应激或其他处理前一日进行基线测量，并在连续 3 天应激程序或其它处理结束后的第 1、7、14 和 21 天进行测试。
  6. 数据分析：
    1. ASR：每次测试的声学惊跳反应振幅以“% 基线值”表示，计算公式为：% 基线值 =（绝对振幅 / 基线绝对振幅）×100%。对每次测试日的数据，使用 SPSS（版本 16）软件对惊跳振幅进行重复测量方差分析（ANOVA），因素包括应激状态和药物剂量。采用 Tukey、Bonferroni 或 Dunnett 检验评估各组间显著的事后差异。数据以均值 ± 标准误（S.E.M.）表示。
    2. 生长指标：在应激前第 -1 天以及应激程序完成后的第 14、21 和 30 天测量体重、食物和水的消耗量。统计分析：食物和水摄入量数据采用单因素重复测量方差分析（ANOVA）。为分析食物摄入率随时间的变化，进一步将食物摄入量除以受试动物的体重，以减少应激方案引起的体重差异以及组间初始体重差异所导致的方差。所有操作均经机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准后进行。

2. 脑组织解剖

  1. 仪器 & 材料：
    1. 麻醉瓶：这是一种带盖的玻璃瓶，高度约6英寸，直径约5英寸，例如“药剂师瓶”、“棉球瓶”或“调味瓶”。
    2. 大鼠用断头器，例如 Kent Scientific 公司提供的产品。
    3. Vibratome 1000
      1. 将剃须刀片纵向切成两半，用酒精洗去油渍，插入夹具中。
      2. 用普通碎冰填满浴槽。
      3. 将托盘纵向放置。
      4. 在滴加氰基丙烯酸酯之前，将托盘上的湿气擦干。
    4. 咬骨钳（例如 Miltex 的 Micro Friedman 咬骨钳，货号 17-4801，或 Fine Science Tools 的 Pearson 咬骨钳，货号 16015-17）。
    5. #3 或 #5 钟表镊（尖头，用于剥离硬脑膜）。
    6. 尖头小剪刀（例如 Vantage V95-304）。
    7. （2）扁平的不锈钢小刮勺，例如用于将粉末状化学品转移至天平称量用的刮勺。其宽端向前弯曲，以便插入端脑与颅骨之间。
    8. 用勺子转移脑组织块。（可用食堂的塑料汤匙。）
    9. 手术刀 #10
    10. 双面剃须刀片（碳钢）：
      1. 一半用于振动切片机。
      2. 用于解剖的一半。
    11. 两个玻璃培养皿，直径分别约为 3.5 英寸和 4 英寸，使其中一个可嵌套于另一个内。在底部培养皿中放置碎冰。顶部培养皿中放置两张滤纸。通过移动滤纸将组织切片转移至所需位置。
    12. 100 ml 烧杯
    13. 用滴眼器向脑部灌注冰镇人工脑脊液。（可使用窄端插入半英寸宽乳胶橡胶 bulb 的玻璃巴斯德吸管，效果良好。）
    14. 碎冰托盘：高约5英寸，长20英寸，宽10英寸。包含：
      1. 将所有仪器插入碎冰中。
      2. 低钙/高镁人工脑脊液（aCSF），置于塑料瓶中，可敲击以破碎冰块。
      3. 氰基丙烯酸酯
    15. 低钙/高镁人工脑脊液（aCSF）：
      1. 单位为 mM：125 NaCl，2.5 KCl，0.5 CaCl2*2H2O₂, 2.0 MgCl₂2*6H20, 1.2 NaH2PO4H*2O₂，25 NaHCO₃，11 葡萄糖。
      2. 在可敲击以压碎冰块的塑料瓶中。
      3. 在 - 下静置 20 分钟80 °C 冷冻至呈泥状。
    16. 棉签
    17. 滤纸：Whatman 42.5 mm（货号 1001 042）。
    18. 用于收集较小组织样本的微型离心管。
    19. 将组织大块结构和组织切片收集到孔板中。
    20. 纸巾
    21. 红色生物危害袋。
  2. 麻醉：
    1. 麻醉罐、纱布垫、异氟烷、金属镊子置于通风橱内。
    2. 将大鼠放入麻醉罐中。
    3. 用异氟烷润湿纱布垫，并放入麻醉罐中。
    4. 等待直至足底反射（用镊子夹捏足蹼时足爪回缩）或角膜反射消失。
    5. 断头：用一只手从后方握住大鼠的胸廓，使用断头器尽可能靠近枕部切断大鼠头部。通常情况下，寰椎仍会附着于颅骨上。
    6. 采血：挤压大鼠胸部以防止血液从颈动脉喷出。逐渐放松挤压力度，以控制血液流入收集容器的流速。
  3. 脑的取出：
    1. 用小剪刀迅速将肌肉和残留的椎骨从基枕骨上剪下。
    2. 使用咬骨钳，从枕骨大孔开始，切除枕骨髁和基枕骨。
    3. 中线头皮切口，使用手术刀。
    4. 使用剪刀在枕骨和顶骨上做一正中矢状切口。用咬骨钳夹住颅骨切口边缘，像剥开蛋壳一样从正中线向后逐步折断颅骨，注意尽量减少与脑组织的接触。正中切开及向后折断操作可分阶段进行。
    5. 随着大脑进一步暴露，必须用冰冻的 aCSF 冲洗，以保持组织的完整性和活性。
    6. 同样地，剥离颞骨和额骨。
    7. 用精细镊子撕除硬脑膜，确保一并去除小脑幕。
    8. 用微型刮匙插入额叶下方，将脑组织从颅骨内板轻轻抬起，直至颅神经受到适当牵拉。
    9. 用剪刀横断颅神经。
    10. 将脑组织完全从颅骨中取出，放入盛有冰浴的低钙/高镁人工脑脊液（aCSF）的烧杯中。静置一分钟或更长时间以充分冷却，使组织变硬、结构清晰可见，并保持组织活性。
    11. 用塑料勺将脑组织转移至冰上预冷的培养皿中的滤纸上，腹面朝上。
  4. 脑的解剖：
    1. 用剃刀在大脑中动脉处进行冠状面横切图 2A).
    2. 将额叶暂时保存在盛有冰浴低温低钙/高镁人工脑脊液的100 ml烧杯中。
    3. 将脑组织翻转，使背侧朝上。在中脑与间脑交界处横断脑干。所得脑组织块如图所示。 图2B.
    4. 将阻断的脑组织重新放入冰冻的低钙/高镁人工脑脊液（aCSF）中。
    5. 使用微型刮勺从延髓/脑桥中分离小脑。保存于适用于预定分析的培养基中。
    6. 将切块的大脑放回培养皿中。使用两张滤纸操作：先将一张滤纸置于大脑腹面以托起脑组织；用另一张滤纸接触切块大脑的后冠状切面边缘。接着，用这张滤纸将切块大脑的前切面放置于振动切片机切片板上的一滴氰基丙烯酸酯胶滴中，使大脑皮层朝向刀片。
    7. 使用振动切片机，切去足够量的尾侧脑组织，以暴露海马图 2C).
    8. 取一片切片， 2,400 μ thic在一只125克的大鼠中， 2,700 μ thick 在200克大鼠中。使用棉签将切片转移至培养皿中的滤纸上（图2D).
    9. 用剃刀切割并保存扣带回皮层。
    10. 用牙科刮匙插入胼胝体的远端边缘以切断，然后剥离同源皮层。
    11. 从其腹外侧边缘剥离海马体（图 2E).
    12. 拯救中脑
    13. 取第二个切片， 2,400 μm 120 克大鼠中的厚度 2,500 μm 厚约200克大鼠。将切片置于培养皿中的滤纸上（图 2F）。或者，五种 500 μm 此时可切取脑片用于电生理实验。
    14. 用剃刀切割并保存扣带回皮层。
    15. 用剃刀在内囊处进行侧向切割，以去除同型皮层（图 2F).
    16. 用剃刀片做斜切以去除扁桃体（图 2F,G).
    17. 用剃刀进行盒状切割以移除下丘脑。侧向切割位于可见的下丘脑腹内侧核外侧。背侧切割位于第三脑室或腹侧被盖区上方不远处图 2H).
    18. 将解剖刀插入胼胝体，剥离附着于海马体的小块同源皮层。将解剖刀的窄端置于海马连合腹侧，向上背侧抬起，以分离海马体。
  5. 脑组织和血液样本中RNA与蛋白质的保存：
    1. RNA检测用培养基：
      1. 脑组织：Eppendorf管中的RNAlater RNA稳定试剂，货号#76106
      2. 血液：PAXgene Blood RNA 管（PreAnalytix, Quagen）
    2. 用于血液中蛋白质（CORT）检测的培养基：不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 d-HBSS 溶液（Quality Biological, Inc）。
    3. 储存：
      1. 采集的脑组织首先置于干冰篮中保存，时间不超过12小时，随后转移至-70 °C 6 个月内使用，即本研究的持续时间。
      2. 采集的血液在室温下放置过夜，以使试剂充分渗透，之后储存于 -70 °C 6 个月内使用，即研究持续期间。

3. 线粒体及线粒体相关核基因的基因微阵列

为了研究大鼠脑组织中线粒体的功能，我们近期开发了大鼠线粒体-神经元聚焦微阵列（rMNChip）以及生物信息学工具，可用于快速鉴定脑组织中的差异通路18。rMNChip 包含 1,500 个与线粒体功能、应激反应、昼夜节律和信号转导相关的基因。该生物信息学工具包含用于计算差异表达基因的算法，以及一个便于对微阵列结果进行直接且直观解读的数据库。

  1. 从组织中纯化总RNA（产品目录号：GPM-Kit 2011-1，GenProMarkers）：
    1. 特定核团的大鼠脑组织中的 RNA之后 RNA稳定剂（Qiagen）
    2. 组织（30 mg，放入 600 μl 使用 Ultra-Turrax T8 在 Dispergierstation（IKA Labortechnik）上进行 GPM-L/B 缓冲液匀浆处理。
    3. 在 1.5 ml 离心管中，于 Sorvall 21,000 rpm 条件下离心 15 分钟。
    4. 将上清液倒入带有2 ml收集管的离心柱中。
    5. 将柱管在15,000 rpm下离心3分钟，弃去穿流液。
    6. 添加 700 μl 向每个离心柱中加入 GPM-B/W 缓冲液，以 16,000 rpm 离心 15 秒，弃去穿流液。
    7. 添加 500 μl 向每个离心柱中加入 GPM-W 缓冲液，将柱管在 16,000 rpm 下离心 15 秒，重复一次。
    8. 将离心柱放入新的1.5 ml收集管中。
    9. 添加 30 μl 向每个离心柱中加入DEPC处理水，16,000 rpm离心1分钟，重复一次。
    10. 测定RNA浓度，将浓度调整至 1 μg/μl 含DNase- & RNase-free water，样品即可用于微阵列标记。
  2. 微阵列标记与杂交（货号 Array 900，Genisphere）：
    1. 1.0 μg 大鼠总RNA根据制造商说明书用于cDNA合成和微阵列标记。
    2. 在rMNChip上进行微阵列杂交 65 °C 12-16 小时，具体操作如前所述。18
  3. 洗涤杂交后的微阵列芯片（产品编号：GPM0101-6，GenProMarkers）：
    洗涤液 体积20 X SSC10% SDSddH₂O2O
    0.5 X SSC/0.01 SDS500 ml12.5 ml0.5 ml最多 500 ml
    0.5 X SSC500 ml12.5 ml 最多 500 ml
    0.1 X SSC500 ml2.5 ml 最多 500 ml
    0.01 X SSC500 ml0.25 ml 最多 500 ml

    洗涤过程中应避免光照。切勿让切片在任何步骤中干燥。
    1. 在玻璃 Coplin 染色缸（货号：70312-20，Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA）中加入 250 ml 溶液 1，于室温下在 BioShaker（Molecular Technologies Inc.，St. Louis，MO）上振荡洗涤载玻片，直至所有盖玻片从载玻片上脱落（所需时间取决于具体情况） <3分钟）。
    2. 用另一个容器以250 ml溶液2振荡清洗载玻片3分钟。
    3. 用另一个容器将载玻片在250 ml溶液3中旋转洗涤3分钟，重复此步骤两次。
    4. 用 250 ml 溶液 4 在另一个染色缸中冲洗载玻片，持续 10 秒。随后立即将装有载玻片的染色缸置于 PN11779 板和 ST-H750 转子上，在 Sorvall Super T21 离心机中以 1,000 rpm 离心 5 分钟，以快速干燥载玻片。
    5. 尽快将清洗后的载玻片放入扫描盒中。
  4. 使用 ScanArray Express 微阵列扫描仪（PerkinElmer）按照说明书进行微阵列图像扫描与分析，并重点关注：
    1. 微阵列图像扫描：简易扫描与标准扫描方案
    2. 激光功率、PMT及归一化方法对数据结果的影响
    3. GAL 文件与图像的比对
    4. 将斑点精确对齐至网格。
  5. 数据分析：微阵列数据分析所采用的定制化计算流程包括微阵列图像评估、数据过滤、点阵大小校正、数据纳入、标准化及比较，具体方法如前所述 18此外，为了确保产生可重复且可验证的微阵列结果，本研究采用的本体、通路和网络分析方法与先前所述方法相同 2, 22, 25, 19, 20, 8, 23, 18.

4. 血液样本采集与血浆皮质酮浓度测定

  1. 在第-1、14、21 和 30 天，从麻醉动物采集应激前或应激后的尾部血液样本，收集至肝素化管中，用于测定循环皮质酮（CORT）水平。
  2. 动物安乐死后，采集躯干血液样本至肝素化管中。分离血浆并储存于 -70 °C，待后续分析。
  3. 用于血浆提取的样本采集介质：
    1. 采用 PAXgene 血液 RNA 管（PreAnalytix, Quagen）采集用于 RNA 提取的血液样本。
    2. 采用 PAXgene 血液 DNA 管（PreAnalytix, Quagen）采集用于 DNA 提取的血液样本。
    3. 采用 MaketLab #ML5601 的锂肝素毛细管采集管（200 μl）采集用于蛋白质分析的血液样本。
  4. 采用 Active Rat Cort EIA 试剂盒（Diagnostic Systems Labs Inc. http://www.beckmancoulter.com/）检测和分析血浆 CORT 浓度，步骤如下：
    1. 标记将要使用的微量滴定板条。
    2. 将 Rat CORT 酶结合物浓缩液用结合物稀释液稀释，配制 Rat CORT 酶结合物溶液。
    3. 向各孔中加入 25 μl 的标准品、质控品和待测样本。
    4. 使用半自动分配器向每孔加入 100 μl 酶结合物溶液。轻轻敲击板架 5–10 秒。
    5. 使用半自动分配器向每孔加入 100 μl Rat CORT 抗血清。
    6. 将板置于室温（25 °C）、500–700 rpm 的摇床上孵育 60 分钟。
    7. 使用自动酶标板洗涤器用洗涤液洗涤每孔 5 次。将板倒置于吸水材料上，拍干。
    8. 使用半自动分配器向每孔加入 100 μl TMB 显色底物溶液。
    9. 在设定为 500–700 rpm 的轨道振荡酶标板摇床上室温孵育 15–20 分钟，观察颜色变化。
    10. 使用半自动分配器向每孔加入 100 μl 终止液。
    11. 手动轻轻震荡板 5–10 秒。
    12. 在 30 分钟内读取各孔溶液的吸光度。
    13. 检测滤光片设定为 450 nm。*EIA 试剂盒也可从 Immunobiological Laboratories（www.ibl-america.com）购买。

5. 典型结果

束缚大鼠的应激实验装置；图表显示应激组与对照组的数据分析结果。
图1. 大鼠被束缚并接受尾部电击。随后测量其体重、血浆皮质酮浓度以及听觉惊吓反应。A：应激暴露：动物被固定在通风的聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）管中以实现 immobilization。在150至210秒的半随机时间间隔内，向其尾部施加40次电击（2 mA，持续3秒）。B 和 C：应激抑制生长期间的体重增加：在应激前（第-3天）、应激开始当天（连续3天应激的第一天）以及此后每隔一天测量体重、食物和水的消耗量，直至第14天。应激期间体重增长的缺失从未得到补偿。D：应激提高血浆皮质酮浓度。E：听觉惊吓反应：动物在应激前一天（第-1天）进行基线测试，并在连续3天应激结束后的第12天再次测试。每组（应激组与对照组）的数据表示为第12天相对于第-1天听觉惊吓反应的百分比。应激显著增强了听觉惊吓反射。点击此处查看高清图像。

小鼠脑解剖过程；解剖切片制备、组织切片设置、脑区
图 2. 从脑切片中分离杏仁核、海马和下丘脑。A：大鼠脑腹侧观：箭头指向大脑中动脉。B：脑组织块腹侧观，准备转移至振动切片机。C：脑组织块已粘附于振动切片机托盘上，尾侧朝上，皮层面向刀片。尾侧脑组织已被切除，暴露出尾侧海马。此时组织块已准备好进行 2,500 μm 厚度的切片，以获取包含大部分海马的组织。D：包含尾侧海马的 2,500 μm 厚切片。E：将新皮层（ISO）从海马（HC）上剥离，并将海马从中脑上剥离。F：包含杏仁核和头侧海马的 2,500 μm 厚切片。G：新皮层已被切除，杏仁核（Amyg）被分离出来。H：下丘脑（HT）被切除并移位。点击此处查看大图。

杏仁核、海马、下丘脑和前额叶皮层中糖皮质激素受体和盐皮质激素受体 mRNA 水平的柱状图
图 3. 在尾部电击应激前（C，对照组）和应激后（Str），杏仁核、海马、下丘脑和前额叶皮层中糖皮质激素受体（GR）和盐皮质激素受体（MR）mRNA 的表达水平。单位为对照组比例；柱形图为标准误（S.E.M）。A：杏仁核：应激降低盐皮质激素受体 mRNA 的表达。B：海马：应激增加盐皮质激素受体 mRNA 的表达。C：下丘脑：应激增加盐皮质激素受体 mRNA 的表达。D：前额叶皮层：应激降低糖皮质激素受体 mRNA 的表达以及盐皮质激素受体 mRNA 的表达。

大鼠GR的（121 bp）PCR引物为：1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA
1r.AACACCTCGGGTTCAATCAC
大鼠MR的（99 bp）PCR引物为：1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC
1r.AACGTCGTGAGCACCTTTCT

显示基因表达水平的热图；红色和绿色表示差异表达。
图 4. 从5种大鼠脑组织（包括小脑（CL）、大脑（CR）、额叶皮层（FC）、下丘脑（HT）和海马体（HC））中获得的64个基因的差异表达RNA的聚类与热图。颜色图谱表示基因下调（绿色）和上调（红色）的倍数变化。（A）这五种脑组织15次微阵列实验中每个64个基因的9次测量归一化信号强度的聚类与热图。每个基因的表达通过技术重复三次和实验重复三次进行测定。（B）这64个基因每次9次测量的平均RNA水平的聚类与热图。这些结果表明线粒体基因表达及其相关功能存在明显差异，支持了我们的假设：不同脑区具有不同的能量需求。点击此处查看高清大图。

我们应用 rMNChip 及生物信息学工具，鉴定了来自5种大鼠脑组织（包括小脑（CL）、大脑（CR）、额叶皮层（FC）、下丘脑（HT）和海马体（HC））的64个差异表达RNA基因的聚类图和热图（图4）。这些数据表明了线粒体基因表达存在明显差异，因而其相关功能也有所不同。结果表明，不同脑区执行相应的脑功能所需能量水平各不相同。

讨论

创伤后应激障碍（PTSD）的诊断基于受试者自述的精神病学症状（DSM-IV）。目前尚无明确定义的生物标志物可用于评估潜在PTSD患者体内的病理生理状态。PTSD是由危及生命的创伤性事件引发的一种疾病，其主要精神病学症状在创伤事件发生后可持续数月甚至数年。PTSD患者表现出的最显著且持续存在的症状包括过度警觉、延迟出现的过度惊跳反应14, 15, 16以及下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）功能的明显受损。在人类中，这些症状在创伤性应激源停止后三个月内持续存在或开始出现24。我们目前用于PTSD生物标志物研究的动物模型采用连续三天的束缚与尾部电击（每次2小时，给予40次、2 mA的尾部电击）——即大鼠不可逃避尾部电击模型（ITS），实验所用大鼠体重为150克。已有研究表明，该ITS模型在很大程度上能够模拟PTSD的病理生理特征17, 7, 4, 10。我们实验室及其他实验室均已证实，大鼠在经历ITS应激模型后，会出现与PTSD患者相似的行为学和神经生物学改变17, 7, 10, 9。具体而言，这些应激大鼠表现出以下特征：（1）在应激源停止数天后出现延迟且过度的惊跳反应；考虑到大鼠生命周期相对于人类更为短暂，这一时间延迟相当于PTSD患者症状出现后延迟一至三个月（符合DSM-IV-TR PTSD诊断标准D/E项13）；（2）血浆皮质酮（CORT）水平升高持续约10天，提示下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）功能受损；（3）在应激结束后体重增长减缓，对应于PTSD患者代谢调节功能的紊乱。现有文献中并无证据表明狐狸气味、捕食者暴露或恐惧增强的惊跳反应能够表现出与PTSD相关的这些持久性行为学和神经内分泌表型。

经历单次应激（1DS）的大鼠表现出短暂的异常，但并未出现3DS大鼠所显示的持续性异常17。本实验比较了3DS和1DS大鼠在应激终止后第4、7和10天的惊跳反应。与先前研究一致，应激大鼠在应激后第一天表现出升高的基础血浆皮质酮（CORT）水平17。这些CORT水平对应激暴露次数敏感，3DS大鼠的CORT水平高于1DS大鼠。在惊跳反应方面，1DS大鼠在应激后7天表现出增强的惊跳反应，而3DS大鼠的惊跳敏感化仅在应激后10天才变得明显。因此，应激终止后出现的惊跳反应增强似乎与应激次数有关。3DS应激模型有助于深入了解与创伤后应激障碍（PTSD）症状相关的生物标志物表达改变，以及应激终止后不同时间点的关键可测量行为表型。所呈现的基因组学结果为应用rMNChip和生物信息学工具识别差异通路、基因和蛋白质生物标志物提供了原理性证明，这将极大促进对包括PTSD在内的复杂多因素神经疾病分子机制的系统生物学研究与理解。

尽管我们的研究范式未深入探讨创伤后应激障碍（PTSD）的认知及更复杂的行為层面，但我们注意到，ITS模型中改变的睡眠模式1与PTSD患者入睡困难、维持睡眠困难以及噩梦等症状相对应11（DSM-IV-TR PTSD标准D13）；而ITS模型中逃避/回避学习能力以及奖赏性任务学习能力的缺陷12，则对应于PTSD患者的注意力不集中和记忆障碍5（DSM-IV-TR PTSD标准C13）。当前模型与PTSD的关键症状具有良好的相关性，并为将可从患者获取的外周生物标志物与无法直接获取的中枢机制性生物标志物进行关联研究提供了良好的模型6。

致谢

本研究由美国国防部医学研究计划署（CDMRP）、美国统一健康科学大学资助项目 G188LE、G188MG 和 G188QC（授予 HL）以及美国统一健康科学大学创伤应激研究中心资助。

参考文献

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创伤后应激障碍动物模型声惊反射血浆皮质酮酶联免疫吸附测定基因表达微阵列束缚尾部电击脑组织解剖白细胞分析行为表型评估生物标志物相关性研究
用于揭示创伤后应激障碍神经、血液学及行为相关性的动物模型中的生物标志物
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