我们介绍一种利用红色荧光脂溶性染料DiI（1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）在活体C. elegans中可视化角质层的方法，该染料通常用于C. elegans中可视化暴露于环境的神经元。通过本优化方案，可利用DiI对侧线和环状角质结构进行染色，并使用复式显微镜观察。
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摘要
摘要
C. elegans 的角质层是一种高度抗性的结构，包裹在动物体外1-4。角质层不仅保护动物免受外界环境的影响，还决定其体形，并在运动能力中发挥重要作用4-6。角质层由表皮细胞分泌的多个层次构成，包括最外层的脂质层7。
角质层中称为环纹的环状脊贯穿动物体长，存在于发育的各个阶段8翅状突起是存在于特定发育阶段（包括L1、dauer和成虫阶段）的纵向脊状结构。2,9. 影响角质层胶原蛋白组装的基因突变可改变角质层结构及动物体形态5,6,10,11虽然可以使用微分干涉差（DIC）光学显微镜进行表皮成像，但目前突出显示表皮结构的方法包括荧光转基因表达12，抗体染色13，以及电子显微镜技术1标记的小麦胚芽凝集素（WGA）也已被用于可视化表皮糖蛋白，但在分辨更细微的表皮结构方面存在局限性14使用荧光染料对角质层表面进行染色已被观察到，但尚未得到详细表征15我们介绍一种在活体中观察角质层的方法 秀丽隐杆线虫 使用红色荧光脂溶性染料DiI（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate），该染料常用于 秀丽隐杆线虫 以可视化环境暴露的神经元。该优化的DiI染色方案是一种简单且可靠的高分辨率荧光成像方法，可用于观察环纹、侧线、阴门、雄性尾部及雌雄同体尾部尖突 秀丽隐杆线虫.
方案
1. DiI 染料的配制
- 在DMF中配制20 mg/mL的DiI（Biotium, Inc., Hayward, CA）储备液。DiI对光敏感，因此需用铝箔包裹以避光保存。
- 通过将0.6 μL DiI储备液加入399.4 μL M9中，为每个样品制备工作稀释液。最终工作浓度应为30 μg/mL DiI的M9溶液。若需同时染色多个样品，可按比例放大体积。用铝箔包裹离心管以避光保护DiI。
2. 线虫的制备
- 使用一个含有无污染线虫群体的60 mm培养皿。用含0.5% Triton X-100的M9缓冲液冲洗培养皿，轻轻旋转液体使其在培养皿表面呈环形流动，以松动所有幼虫和成虫。将冲洗液转移至无菌的1.5 mL离心管中。
- 立即以2000 rpm离心30秒，尽可能吸除上清液，注意不要扰动管底的线虫沉淀。
- 为减少残留的Triton X-100，用M9缓冲液重悬线虫，离心并弃去上清液。重复此步骤一次。
- 向离心管中加入400 μL用M9配制的工作浓度DiI溶液，短暂涡旋振荡，使线虫充分重悬于溶液中。
- 将离心管置于避光环境中，在20°C下水平摇动3小时，转速为350 rpm。如需要，可将孵育时间延长至16小时以增强染色效果。
- 为减少未结合的染料，以2000 rpm离心20秒，尽可能吸除上清液，注意不要扰动管底的线虫沉淀。
- 用400 μL M9缓冲液重悬线虫，将液体倒入接种了OP50 E. coli的大肠杆菌的无菌NGM琼脂平板区域。让线虫恢复至少30分钟。在此恢复期间，线虫应从DiI染色液中爬出并移至食物表面。此步骤可减少游离DiI造成的背景荧光。
3. 样品的封片与观察
- 使用高压灭菌器或微波炉将4%琼脂溶于水中。
- 通过在载玻片上叠加两层实验室胶带，制作可重复使用的垫片，用于确保琼脂垫厚度均匀。共制作两个垫片载玻片。
- 将一张洁净的载玻片置于两个垫片载玻片之间。用移液器吸取约150 μL（四滴）熔融的4%琼脂，滴加到洁净载玻片中央。迅速用另一张载玻片覆盖熔融琼脂，形成琼脂垫。小心移除覆盖用的载玻片，使琼脂垫保持在载物载玻片顶部中央位置。
- 在琼脂垫上滴加约5 μL线虫麻醉剂（例如100 μM–1 mM左旋咪唑）。
- 将8–12只线虫置于麻醉剂中，并加盖显微镜盖玻片。
- 使用配备至少40倍物镜和DSRed/TRITC（或其他兼容）滤光片的复式显微镜或共聚焦显微镜观察线虫。DiI的荧光激发峰值为549 nm，结合状态下的发射峰值为565 nm（Biotium, Inc., Hayward, CA）。
4. 代表性结果
DiI 可对野生型和突变型 C. elegans 的角质层进行染色。角质层表面具有由环形沟槽分隔的环状结构，在某些发育阶段还存在称为侧翼脊（alae）的纵向脊状结构。每个发育阶段的角质层结构均具有独特的组分2。根据表面组分的不同，侧翼脊和环状结构的脊或沟槽在幼虫期至成虫期均可产生荧光染色，且使用本方法回收后仍可保持可见达一天之久。有时可观察到背景荧光斑点（图2F，G），但并不常见（图1，图2A-E，H，I）。所有图像均采用转盘共聚焦显微镜拍摄，或在注明时采用宽场（wf）复式显微镜拍摄。
图 1. DiI 染料标记角质层及暴露于环境中的神经元。L2 期动物。630 倍放大。马赛克图像部分使用 iVision-Mac 软件（BioVision Technologies，宾夕法尼亚州埃克斯顿）采集。图像使用 Adobe Photoshop CS3（Adobe Systems, Inc.，加利福尼亚州圣何塞）拼接。比例尺 = 10 μm。DiI 还可对头部和尾部的锥形感器和侧尾感器感觉神经元进行荧光标记（箭头指示部分神经元）。
图 2. DiI 在秀丽隐杆线虫（C. elegans）后胚胎发育各阶段均能荧光标记其角质层。放大倍数为 630 倍。比例尺 = 10 μm。野生型个体在 A）L1 阶段；B）L2 阶段；C）dauer 阶段；D）L3 阶段；E）L4 阶段；以及 F）成虫阶段的染色情况。L1 和 dauer 阶段的个体中，侧线（alae）和环状脊（annular ridges）被荧光染色（A，C）。DiI 对 L2 阶段个体的环状脊进行染色（B）。L3 和 L4 阶段个体的环状沟（annular furrows）被染色（D，E）。成虫个体中，侧线和环的沟槽被染色（F–H）。侧线由两条、五条或三条脊组成（分别对应 L1、dauer 或成虫阶段），沿虫体全长延伸（箭头）16。环形成环绕虫体的周向脊（箭头所示，F 和 J）。成虫突变体的角质层表现出中等程度的结构紊乱（G–H）。G）侧线脊出现不连续（wf）。H）多余的侧线脊发生融合、分支或分叉（wf）。胶原蛋白基因突变体会表现出侧线和环状结构的组织缺陷（I–J）。I）在过表达 pRF4 (rol-6(su1006)) 的转基因个体中，侧线脊与虫体长轴呈一定角度排列。J）在过表达 pRF4 (rol-6(su1006)) 的转基因个体中，环呈现不规则模式。
图 3. 外部形态结构通过 DiI 染色显现。 630 倍放大。比例尺 = 10 μm。DiI 还可标记其他外部特征，包括 A) 成年雌雄同体的阴门，B) 成年雄虫尾部射线及扇状结构，以及 C) 雌雄同体尾部尖突（在此突变背景下呈分叉状）。
图 4. 角质层被DiI染色所需时间比暴露于环境中的神经元更长。放大倍数为630倍。比例尺 = 10 μm。染色两小时后，伞形（未显示）和尾感器感觉神经元（箭头）已充分染色。相比之下，较年轻动物的角质层仅部分区域呈斑块状染色（箭头指示）。
| 洗涤 | 染色液（含 DiI） | 孵育时间 | 角质层是否着色 |
| M9 + 0.5% Triton X-100 | M9 + 0.5% Triton X-100 | 2 hrs | 否 |
| M9 + 0.5% Triton X-100 | M9 + 0.5% Triton X-100 | 3 hrs | 否 |
| M9 + 0.5% Triton X-100 | M9 | 2 hrs | 部分 |
| M9 + 0.5% Triton X-100 | M9 | 3 hrs | 是 |
| M9 + 0.5% Triton X-100 | H20 | 2 hrs | 部分 |
| M9 + 0.5% Triton X-100 | H20 | 3 hrs | 是 |
表1. 不同条件下的角质层染色结果。 测试了多种孵育溶液和孵育时间，以优化动物样本中角质层的染色效果。H2O 表示无菌蒸馏水。部分染色指幼虫角质层染色呈斑块状分布（见图4），而成虫角质层则染色均匀一致。
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讨论
本文介绍的DiI染色方法可相对快速、便捷地对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的角质层进行可视化观察。通过改造并优化一种常用于成像环境暴露感觉神经元的方法15,17，DiI可用于荧光标记侧线（alae）和环状结构（图1和图2），以及阴门、雄性尾部和雌雄同体尾部尖突（图3）。我们发现，孵育溶液及孵育时间会影响DiI对角质层染色的一致性（表1，图4）。用于环境暴露神经元DiI染色的方法通常在含Triton X-100的M9溶液中孵育两小时15。使用含表面活性剂Triton X-100的M9溶液进行初始清洗，有助于去除角质层表面的污染物，并防止线虫聚集。然而，若将线虫在相同缓冲液中的染色溶液中孵育三小时，则会导致染料无法有效染色角质层（表1）。这可能是由于表面活性剂处理时间较长，导致线虫表面脂质被剥离所致。将线虫在含DiI的纯水中孵育可实现角质层染色，表明M9盐溶液并非DiI角质层染色所必需。尽管基于水的方案被推荐用于神经元的DiI染色15，但我们发现采用该方法处理的线虫常表现出不良状态。在M9溶液中用0.5% Triton X-100短暂清洗后，再在M9配...
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致谢
感谢 S. Taneja-Bageshwar、K. Beifuss、S. Kedroske 和 H-C. Hsiao 的有益讨论。本工作由德克萨斯农工健康科学中心分子与细胞医学系的启动资金资助。化合物范围和旋转圆盘的采购资金来自该系及德克萨斯农工健康科学中心院长办公室。部分菌株由线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center）提供，该中心由国家研究资源中心资助。质粒 pRF4（rol-6(su1006)）由 A. Fire 惠赠。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DiI（1,1’-二十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲碳菁高氯酸盐） | Biotium, Inc. | 60010 | 储存液稀释度： 20 mg/mL（溶于DMF） 工作液稀释度：30 mg/mL |
| DMF（二甲基甲酰胺） | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100（辛基苯氧基聚乙氧基乙醇） | VWR international | EM-9410 | |
| M9（22 mM KH2PO4、42 mM Na2HPO4、86 mM NaCl、1 mM MgSO4） | |||
| NGM（线虫培养基） | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | 可按照NGM琼脂培养基方案配制18 |
| 琼脂（Agar-agar） | EMD Millipore | 1.01614 | 4% 水溶液 |
| 左旋咪唑（盐酸左旋咪唑） | Sigma-Aldrich | 31742 | 根据需要使用 100 μM - 1 mM 左旋咪唑 |
| 显微镜载玻片 | VWR international | 16005-106 | |
| 显微镜盖玻片 | VWR international | 16004-302 | |
| 复合显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | A1m | 根据实验需求选用合适的物镜 |
| TRITC 或其他兼容滤光片 | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET - DSRed（TRITC/Cy3）溅射滤光片组 |
参考文献
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