可视化线虫角质层结构的亲脂性的重要染料，直接投资收益

Summary

我们提出了一个可视化生活角质层的方法 C。线虫使用红色荧光亲脂性染料DII（1,1' - 双十八烷基- 3，3,3'，3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐），这是常用的 C。线虫可视化环境接触的神经元。这种优化的协议，alae和环形表皮结构是由DII染色和使用复合显微镜观察。

Abstract

角质层的C.线虫是一种高度耐药的结构，周围的^动物 1-4外部。角质层不仅可以保护环境的动物，但也决定体形和蠕动^4-6次的作用。由表皮细胞分泌的几层组成的角质层，包括最外层^的脂质层7。

在角质层的圆周脊称为环空中的模式动物的长度， ^目前在8发展的所有阶段。 Alae有纵脊目前是在特定的发展阶段，包括L1的dauer，和成人阶段^2,9。影响表皮胶原组织的基因突变可以改变表皮结构和动物的身体^形态 5,6,10,11 。虽然使用DIC的光学显微镜复合表皮成像是可行的，目前的方法，突出表皮结构包括荧光^12％的转基因表达，抗体染色，电子显微镜^1。也被用来标记麦胚凝集素（WGA）的可视化表皮糖蛋白，但受限于解决更精细的表皮^结构 14 。使用荧光染料染色表皮表面已被观察到，但从来没有在^细节 15的特点。我们提出了一个方法来可视化角质层在现场 C. 线虫使用红色荧光亲脂性染料DII（1,1' -双十八烷基- 3，3,3'，3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐），也就是通常用于在 C 线虫可视化环境接触的神经元。这是一个简单可靠的方法，高分辨率的荧光可视化的环空中，alae，外阴，男性的尾巴， 在 C和雌雄同体的尾穗DII染色的优化协议线虫 。

Protocol

1。 DII制备染色

1. 准备的20毫克/毫升DII（Biotium公司，公司，海沃德，CA）在DMF原液。 DII是光敏感，所以保护光箔包装DII。
2. 每个人口0.6μLDII股票加入到399.4微升M9的创建工作的DII稀释。这应该给最后的30微克/毫升DII在M9的工作液。这可以扩展多个种群同时染色。盾DII在铝箔包装管（S）。

2。线虫的制备

1. 包含一个未被污染的线虫人口使用60毫米的钢板。洗轻轻摇动整个板面的液体的圆周运动，放松所有的幼虫和成年动物，动物板，解决了0.5％的Triton X - 100的使用M9的缓冲区。转移到无菌1.5毫升管洗。
2. 立即降速在2000转每分钟30秒的动物。取下并丢弃很多SUPernatant尽可能在试管底部，而不会干扰动物的质量。
3. 为了减少残留的TRITON X - 100，冲洗动物使用M9的缓冲区，旋转，去除上清液。重复此步骤一次。
4. 管和涡简要加入400μL的工作DII M9的解决方案，以重悬在溶液中的动物。
5. 摇管在20 ° C水平为3个小时在350 RPM轻保护环境。如果需要的话，动物可以被孵育染色16小时。
6. 为了减少未结合的染料量，自旋向下的动物，在2000转，持续20秒。删除尽可能上清液丢弃，而不会干扰动物的质量。
7. 在400μLM9的缓冲区，并倒到无细菌的接种....

Discussion

这里介绍DII的染色方法，允许一个相对快速和方便的方法来可视化的角质层线虫。再利用和优化常用的图像环境暴露^15,17感觉神经元的方法，直接投资收益可用于荧光染色alae和环状结构（图1和2），以及外阴，男性的尾巴，和雌雄同体的尾穗（图3）。我们发现，洗液和时间的影响的直接投资收益的能力，始终染色的角质层（表1，图4）。 DII染色环境暴露的神经元的方法使用两个小时的孵育时间M9 TRITON X ^- 100 15。 M9与表面活性剂的初始洗TRITON X - 100有助于消除从表皮表面的污染和防止结块动物。然而，在同一个缓冲区染色液孵化三个小时的动物防止染料染色的角质层（表1）。这可能是引起血脂线虫表面上被剥夺了在洗涤剂溶液治疗。潜伏期的动物DII污渍角质层的水，表明M9盐溶液不是DII角质层染色的要求。虽然水为基础的协议是神经元DII染色¹⁵的建议，我们发现，动物治疗这种方式往往出现不健康的。洗衣机在0.5％的动物简要Triton X - 100在M9的的，在染色液三个小时的孵化与M9的表皮结构，提供一致的染色和维护动物福祉。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂	同义词	公司	目录编号	评论
DII	1,1' - 双十八烷基- 3，3,3'，3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐	Biotium公司，公司	60010	股票稀释: 20 mg / ml的二甲基甲酰胺 工作液:30毫克/毫升
二甲基甲酰胺	二甲基甲酰胺	Sigma - Aldrich公司，公司	D4551
海卫一 X - 100	Octylphenoxypolyethoxyethanol	厂商VWR International，LLC。	EM - 9410
M9	22MM KH 2 PO 4，4200万娜2 HPO 4，86mm的氯化钠，硫酸镁1MM 4
NGM	线虫的生长介质	IPM的科学，公司	11006-501	可以准备以下NGM琼脂协议18
琼脂		电解二氧化锰化工公司	1.01614	4％水
左旋咪唑	盐酸左旋咪唑	Sigma - Aldrich公司，公司	31742	100微米 - 1毫米所需的左旋咪唑
显微镜载玻片		厂商VWR International，LLC。	16005-106
显微镜盖玻片		厂商VWR International，LLC。	16004-302
复方范围		卡尔蔡司公司	A1m	利用的目标，以满足实验的需要
TRITC或其他兼容滤波器	＆NBSP;	色度科技股份有限公司	49005	（ET - DsRed的TRITC/Cy3）溅射过滤器设置