方法文章

追踪细胞命运 大肠杆菌 λ噬菌体感染后

23.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/3363

⸱

2011年10月14日

 , 
1Department of Physics, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Center for the Physics of Living Cells, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了制备荧光标记的λ噬菌体、感染大肠杆菌（E. coli）、在显微镜下观察感染过程以及分析感染结果的实验步骤。

摘要

由噬菌体（噬菌体）λ和大肠杆菌（E. coli）组成的系统长期以来被用作细胞命运决定的典范模型1,2。当多个噬菌体同时感染一个细胞后，细胞将选择两条通路之一：裂解（毒性）途径或溶原（潜伏）途径3,4。我们近期开发了一种对单个噬菌体进行荧光标记的方法，能够在显微镜下实时观察感染后的决策过程，达到单个噬菌体和单个细胞的分辨率5。本文中，我们详细描述了此前研究所述感染实验的完整操作流程5，包括荧光噬菌体的构建、细胞感染、显微成像以及数据分析。该荧光噬菌体为一种“杂合体”，可同时表达野生型和YFP融合型的衣壳蛋白gpD。首先通过诱导携带表达野生型gpD蛋白质粒的gpD-EYFP（增强型黄色荧光蛋白）噬菌体溶原菌，获得粗制噬菌体裂解液。随后进行一系列纯化步骤，接着用DAPI标记并在显微镜下成像，以验证噬菌体储备液的均一性、DNA包装效率、荧光信号强度以及结构稳定性。噬菌体与细菌的初始吸附在冰上进行，随后短暂孵育于35°C以触发病毒DNA的注入6。然后将噬菌体与细菌的混合物转移至薄层营养琼脂平板表面，加盖盖玻片，并在落射荧光显微镜下进行观察。感染后过程持续追踪4小时，每10分钟采集一次图像。通过追踪多个视野位置，单次实验可记录约100个细胞的感染过程。在每个位置和时间点，同步采集相差图像以及红色和绿色荧光通道的图像。后续利用相差图像实现细胞的自动识别，而荧光通道则用于判断感染结果：若观察到新荧光噬菌体（绿色）的产生并伴随细胞裂解，则为裂解途径；若检测到溶原性因子的表达（红色）并伴随细胞恢复生长与分裂，则为溶原途径。所获得的时间序列视频数据通过手动与自动方法相结合进行处理。数据分析可确定每次感染事件的相关参数（如感染噬菌体的数量与位置）以及感染结局（裂解/溶原）。根据需要还可提取其他参数。

方案

1. 制备粗制噬菌体裂解液（图1）

  1. 在50 ml的锥形瓶中，接种一环LE392(λ)新鲜菌落LZ1)[pPLate*D]（参见 表1 加入6 ml LB培养基中（详见方法）7 添加了 10 μg/ml 卡那霉素和 100 μg/ml 氨苄青霉素。在37°C下过夜培养 30°C 以温和振荡（180 rpm）进行。
  2. 将培养物按1:100比例稀释至LBM培养基（LB培养基中添加10 mM MgSO₄）中4）并在 30°C 在轻微振荡（180 rpm）条件下进行培养。为优化噬菌体产量，需确保培养液体积不超过摇瓶容量的十分之一。我们通常准备两个容量为2升或2.5升的摇瓶，每瓶中加入2.5 ml过夜培养物至250 ml LBM培养基中。
  3. 当细胞密度达到OD600 ≈ 0.6（约 2.5 - 3 小时），通过将培养物转移至 42°C 水浴摇床中温和振荡（180 rpm）18分钟，然后孵育于 37°C 在轻微振荡（180 rpm）条件下孵育，直至观察到裂解现象（培养物变澄清，约需 60 - 90 分钟）。
  4. 加入2%氯仿至培养物中，手动振荡混匀，室温孵育15分钟。注意：操作氯仿时需佩戴手套，避免吸入。
  5. 将培养物转移至两个250 ml离心管中，在Sorvall GSA转子中以10,000 rpm离心15 min，温度设为 4°C. 收集含有噬菌体颗粒的上清液，弃去沉淀的碎片。进行第二次离心以确保彻底去除可见的碎片。
  6. 采用标准的噬菌体滴定实验方案8 用于测定噬菌体浓度。噬菌体滴度应为 ~ 5-10 x 109 pfu/ml。使用 supF 菌株如 LE392 作为指示菌株，因为 Sam7 荧光噬菌体基因型中的突变，并使用富含NZYM的顶层琼脂和琼脂平板以获得更大的噬菌斑（图2).

2. 噬菌体纯化（图1）

  1. 将裂解液倒入一个较大的（例如 2 升）烧瓶中，向裂解液中加入 DNase I 和 RNase（各 1 μg/ml），以消化从裂解的细菌中释放出的核酸，并在室温下孵育 1 小时。
  2. 向裂解液中加入 1 M NaCl，将裂解液转移至 250 ml 离心管中，并在冰上孵育 3 小时。在 4°C 下使用 Sorvall GSA 转子以 10,000 rpm 离心 15 分钟，回收上清液。噬菌体滴度应与粗裂解液相近，约为 5–10 × 109 pfu/ml。加入 NaCl 可促进噬菌体颗粒从细菌碎片中解离，并且是 PEG8 高效沉淀噬菌体颗粒所必需的。
  3. 将裂解液倒入一个大烧瓶（例如 2 升烧瓶）中，向裂解液中加入 10%（w/v）PEG8000，在室温下缓慢搅拌或振荡以溶解 PEG8000。将裂解液转移至 250 ml 离心管中，然后在 4°C 下孵育过夜（约 16 小时）。在 4°C 下使用 Sorvall GSA 转子以 10,000 rpm 离心 15 分钟，弃去上清液。
  4. 用噬菌体 SM 缓冲液（每 250 ml 初始噬菌体裂解液加入 4 ml SM 缓冲液）浸泡沉淀（即与 PEG8000 共同沉淀的噬菌体颗粒），并在 4°C 下轻轻振荡或静置孵育 16 小时。
  5. 小心将裂解液（含噬菌体颗粒的 SM 缓冲液）转移至 50 ml Eppendorf 离心管中，然后用 0.5–1 ml SM 缓冲液洗涤残留的沉淀。
  6. 向裂解液中加入等体积的氯仿。通过上下颠倒数次的方式轻轻混合裂解液与氯仿。在 Eppendorf 5804R 或类似的台式离心机中，于 4°C 下以 4,000 rpm 离心 15 分钟。
  7. 重复步骤 2.6 以获得更澄清的裂解液。噬菌体滴度应约为 1–2 × 1011 pfu/ml。
  8. 配制三种不同密度（ρ）的 SM/CsCl 溶液，分别为 1.3 g/ml、1.5 g/ml 和 1.7 g/ml。测量折射率（η）以获得更精确的密度值。在 25°C 下的密度换算公式9为：ρ = 10.8601 η - 13.4974。详见表 3。
  9. 使用带有长针头的注射器将溶液装入 14 ml 透明超清 Beckman 40Ti 超速离心管中。为避免混合并形成更佳的密度梯度，应采用底层加样法（即按密度递增顺序逐层叠加溶液），即用 3 ml 注射器将针头插入管底，依次缓慢加入 2 ml SM/CsCl 溶液，顺序为 1.3 g/ml、1.5 g/ml 和 1.7 g/ml。
  10. 从 14 ml 超速离心管顶部轻轻覆盖加入 8 ml 噬菌体裂解液。准备一个平衡管。在 Beckman SW40Ti 转子中于 4°C 下以 24,000 rpm 离心 4 小时。
  11. 在暗室中小心取出离心管，使用手电筒从管顶部照射并以黑色背景衬托。噬菌体条带应清晰可见，位于 1.3 g/ml 与 1.5 g/ml SM/CsCl 层之间的界面处（图 3A）。使用带有 3 ml 注射器的 21.5 号针头，在条带略下方刺穿管壁，轻轻收集约 500 μl 噬菌体悬液。噬菌体滴度应约为 5–10 × 1011 pfu/ml。
  12. 将噬菌体悬液置于 4 ml 透明超清 Beckman 超速离心 SW60Ti 转子管中，用 1.5 g/ml SM/CsCl 溶液充满该管。准备一个平衡管。在 Beckman SW60Ti 转子中于 4°C 下以 35,000 rpm 离心 24 小时。
  13. 重复步骤 2.11 的相同操作，从可见条带中收集噬菌体。条带应如图 3B所示清晰可见。
  14. 将噬菌体悬液装入透析膜夹（表 2），在 4°C 下用 1000 倍体积的 SM 缓冲液透析三次，时间分别为 3 小时、3 小时和过夜（约 16 小时）。透析的目的是去除噬菌体悬液中存在的 CsCl。最终噬菌体滴度应约为 5–10 × 1011 pfu/ml。

3. 制备一块琼脂糖凝胶板（图4）

  1. 用 70% 乙醇清洗 6 张显微镜载玻片（75 × 50 mm，厚度 1 mm）。
  2. 将其中 5 张载玻片按图 4 所示排列并用胶带固定。
  3. 在覆盖保鲜膜的小烧杯中，将 0.09 g 琼脂糖加入 6 ml 培养基中（终浓度为 1.5% 琼脂糖），在加热板上加热至溶液澄清。
  4. 将琼脂糖溶液倒入已固定的载玻片上。
  5. 将最后一张载玻片盖在顶部，小心避免产生气泡。上方放置重物，并静置冷却约 30 分钟。
  6. 移除侧面的 4 张载玻片，将凝胶块连同上下两张载玻片一起用保鲜膜包裹。该凝胶块可在 4°C 下保存最多 3 天。

4. 测试纯化的噬菌体储备液

  1. 按上述方法（第3节）制备PBS-琼脂糖凝胶板。
  2. 用DAPI染色纯化的噬菌体。将10 μl噬菌体（约1 × 1010 pfu/ml）与10 μl 10 μg/ml DAPI混合（终浓度为5 μg/ml），在4°C孵育30分钟，或在室温孵育10分钟。
  3. 取1 μl噬菌体/DAPI混合液滴加在一块No.1 24 × 50 mm盖玻片中央，覆盖一块预先制备好的PBS-琼脂糖凝胶小片（约10 × 10 mm）。琼脂糖小片是在三明治凝胶的上层载玻片移除后，用剃刀片切割而成。通过YFP和DAPI通道在落射荧光显微镜下观察样品。单个噬菌体应在两个通道中均呈现为衍射极限的荧光“点”（图5）。显微镜和相机设置应与下文步骤6.2相同。

5. 感染（图6）

  1. 在14 ml的Falcon管中，将LE392[pPRE-mCherry]的新鲜菌落（详见表1）接种至2 ml LB培养基中，该培养基添加有100 μg/ml氨苄青霉素、10 mM MgSO4和0.2%麦芽糖。于37°C、中等振荡（265 rpm）条件下过夜培养。
  2. 将过夜培养物按1:1000比例稀释至LBMM培养基（LB培养基添加10 mM MgSO4和0.2%麦芽糖），即在50 ml锥形瓶中，将5 μl过夜培养物加入5 ml LBMM培养基中。于37°C、中等振荡（265 rpm）条件下培养至OD600 ≈ 0.4。
  3. 使用LBM培养基，按照上述第3节所述方法制备LBM-琼脂糖凝胶片。
  4. 取1 ml菌液，在台式微量离心机中以2,000g离心2分钟（室温）。弃去上清液，用20 μl预冷的LBMM培养基轻柔重悬菌体，使菌液OD600达到20。
  5. 操作纯化的噬菌体储备液时，应使用宽口移液枪头，或剪去常规枪头的尖端以扩大开口，避免剪切力损伤噬菌体颗粒3。将20 μl菌液与20 μl纯化噬菌体轻柔混匀，使噬菌体与细胞的平均比例在0.1–5范围内。冰上孵育30分钟以允许噬菌体吸附，随后在35°C水浴中孵育5分钟以触发噬菌体DNA注入6。
  6. 轻柔吹打数次以分散可能的细胞聚集体。再次使用宽口移液枪头以避免损伤噬菌体。将混合液以1:10比例稀释至LBMM培养基中，例如将5 μl混合液加入45 μl LBMM中。
  7. 将一块LBM-琼脂糖凝胶片（约10 × 10 mm）置于1号盖玻片（22 × 22 mm）上。预先制备的LBM-琼脂糖凝胶片应在使用前于室温放置至少1小时，以确保其温度平衡。在琼脂糖凝胶片上滴加1 μl噬菌体/细胞混合液，静置1分钟使其充分吸收。随后轻柔地将一张1号盖玻片（24 × 50 mm）覆盖于琼脂糖凝胶片上方。该操作旨在避免感染细胞释放的噬菌体受到剪切损伤（图6）。

6. 在显微镜下追踪细胞命运

  1. 将盖玻片小心地安装在显微镜载物台上。成像时使用高倍物镜（例如 100x）（参见下方讨论部分的显微镜系统）。
  2. 获取初始时间点的图像集。该图像集将用于表征所有感染性噬菌体的初始数量和位置。沿z轴（垂直方向）以200 nm的步进间隔连续采集15幅图像，通过YFP通道成像。此外，分别通过相差和mCherry通道各采集一幅聚焦清晰的单幅图像。优化光照强度和曝光时间，以在获得足够信号的同时尽量减少荧光漂白和细胞损伤（参见下方讨论部分的图像采集）。
  3. 采集感染后细胞命运的时间序列图像。在约4小时内，每隔10分钟通过相差、YFP和mCherry通道对样品进行一次成像。在时间序列成像过程中，每个时间点每个通道仅采集一个z轴位置的图像，以避免对样品造成不必要的光照，从而减少荧光漂白和光毒性。

7. 图像分析

  1. 手动计数噬菌体数量，并记录初始时间帧中噬菌体的位置和细胞长度。此操作可使用 MetaMorph 或 ImageJ 等软件完成。通过播放延时录像，记录细胞命运（裂解、溶原或未感染）、裂解时间以及任何其他所需信息。如需识别不同细胞命运，请参见下方代表性结果部分中的延时录像。
  2. 除上述手动分析外，还可通过自动细胞识别与谱系追踪算法提取更定量的信息（例如单个细胞中荧光强度随时间的变化）。我们使用自行开发的 Matlab 程序进行细胞谱系追踪和荧光强度分析，并结合加州理工学院 Elowitz 实验室编写的 Schnitzcell Matlab 代码进行细胞分割。

8. 代表性结果：

噬菌体铺板：

荧光标记噬菌体的噬斑（步骤1.6和第2节）明显小于野生型（图2）。因此，我们需在37°C培养箱中至少培养12小时，以使噬斑可见。

噬菌体超速离心：

在噬菌体样品经CsCl阶梯梯度超速离心后（步骤2.10），应可见两条条带（图3A）。上层条带位于噬菌体悬液与SM/CsCl 1.3 g/ml 层之间的界面，含有细胞碎片和空的噬菌体衣壳。下层条带位于SM/CsCl 1.3 g/ml 与1.5 g/ml 层之间的界面，为噬菌体条带。对于荧光噬菌体λLZ2，该条带呈绿色。野生型噬菌体λIG2903的条带则呈蓝色5。在步骤2.12中经CsCl平衡梯度超速离心后，应在离心管中部可见一条噬菌体条带（图3B）。由于荧光噬菌体λLZ2含有gpD-EYFP和gpD衣壳的混合物，其蛋白与DNA的比率高于野生型。因此，荧光噬菌体λLZ2的条带略浅一些（在离心管中位置稍高），与野生型λIG290310相比略有差异。

DAPI 染色：

图5显示了使用DAPI标记噬菌体后获得的典型图像（第4节）。成功纯化的噬菌体，其YFP信号与DAPI信号应接近100%共定位。我们通常观察到少于1%的YFP信号点不含DAPI（代表无病毒基因组的衣壳），少于1%的DAPI信号点不含YFP（对应于无荧光的噬菌体）5。

延时成像：

裂解性细胞通过细胞内 YFP 荧光（绿色通道）的积累，随后发生细胞裂解来识别。溶原性细胞通过细胞内均匀的 mCherry 荧光（红色）积累以及细胞正常生长和分裂的恢复来识别。未感染的细胞（或感染失败的细胞）不会表现出上述任何表型，并会正常生长和分裂。图7 展示了典型延时录像（第6节）中相位对比、YFP 和 mCherry 通道的若干图像集及其对应的三通道叠加图像。在初始时间帧中，单个噬菌体（绿色斑点）清晰可见（图7A）。通常，可在细胞表面观察到多个噬菌体（推测正在感染这些细胞），而其他噬菌体则未吸附，如 图7B（左图）所示。随着时间推移，感染结果逐渐可区分。裂解周期表现为细胞内新噬菌体的产生（绿色，图7C），随后发生细胞裂解（破裂的细胞释放出绿色噬菌体，图7D）。溶原化则表现为由 PRE 启动子驱动的 mCherry 表达（红色，图7C）以及细胞生长和分裂的恢复（红色，图7D）。

细胞培养和离心过程示意图；DNA/RNA 纯化步骤；孵育条件。
噬菌体纯化示意图；Sorvall GSA 转子；PEG8000 溶液；操作流程，离心步骤。
采用 CsCl 密度梯度离心法的噬菌体纯化示意图，显示分离步骤。
噬菌体纯化过程示意图；超速离心装置；透析法纯化噬菌体。
图 1. 描述荧光噬菌体制备流程的示意图。首先通过诱导携带表达野生型 gpD 蛋白质质粒的 gpD-EYFP 噬菌体溶原菌，获得粗制噬菌体裂解液（图 A-B）。随后通过一系列步骤对噬菌体进行纯化（图 C-L）。

使用荧光法比较细菌生长；培养皿、噬菌体检测、微生物学实验。
图 2. 噬菌体噬斑。荧光噬菌体（左）形成的噬斑比野生型（右）小，平板在 37°C 下培养 12 小时后观察。

噬菌体的密度梯度离心；示意图显示碎片、荧光噬菌体和野生型条带。
图3. 超速离心后噬菌体条带。A) 在 CsCl 不连续梯度中进行超速离心后可见两条带。上方条带对应细胞碎片和空的噬菌体衣壳；下方条带含有目标噬菌体。左侧：荧光噬菌体；右侧：野生型噬菌体。B) 在 CsCl 平衡梯度中进行超速离心后可见单一条带。荧光噬菌体条带（左侧）呈绿色，而野生型噬菌体条带（右侧）呈蓝色。

琼脂糖凝胶板制备示意图；用于电泳的载玻片装置及溶液浇注。
图4. 琼脂糖凝胶板的制备步骤。

荧光显微镜图像，YFP 和 DAPI 通道，细胞观察，分子可视化。
图 5. 噬菌体经 DAPI 染色后的荧光图像。单个噬菌体清晰可辨，YFP 与 DAPI 信号共定位效果良好。

噬菌体与细胞孵育过程；显微镜装置；琼脂糖凝胶板制备；成像序列示意图。
图 6. 噬菌体感染过程及成像装置示意图。点击此处查看该图像的完整尺寸版本。

荧光显微镜过程；YFP、mCherry通道；细菌裂解与噬菌体追踪示意图。
图7. 噬菌体感染延时录像中的典型图像。图中显示了相差、YFP 和 mCherry 通道图像，以及三通道合并图像。(A) 初始时间点的 YFP 通道图像。左侧为不同 z 位置 YFP 图像的叠加总和；右侧三幅为不同 z 位置的 YFP 样本图像，对应细胞表面的不同区域。(B)、(C) 和 (D) 不同时相点的合并图像（左），以及对应的相差（中左）、YFP（中右）和 mCherry（右）通道图像。(B) t = 0 时，可见两个细胞，其中一个被单个噬菌体感染（绿色斑点），另一个被三个噬菌体感染。此外还可观察到部分未吸附的噬菌体。(C) t = 80 分钟时，被单个噬菌体感染的两个细胞均已进入裂解途径，表现为细胞内新噬菌体的产生（绿色）；而被三个噬菌体感染的细胞则进入溶原途径，表现为 PRE 启动子驱动的 mCherry 表达（红色）。(D) t = 2 小时时，裂解途径导致细胞裂解（细胞破裂），而溶原性细胞已完成分裂§。

§图7(C)和(D)的左侧面板转载自《细胞》(Cell)，141卷，Lanying Zeng、Samuel O. Skinner、Chenghang Zong、Jean Sippy、Michael Feiss 和 Ido Golding，《亚细胞水平的决策决定噬菌体感染的结果》，第682–691页，版权所有 (2010)，经Elsevier许可。

菌株名称相关基因型来源/参考文献
细菌菌株  
LE392supFJohn Cronan, University of Illinois
噬菌体菌株  
λLZ1gpD-EYFP, cI857 Sam7 D-eyfp b::kanRZeng et al.5
λLZ2gpD-嵌合型，与 λLZ1 基因型相同Zeng et al.5
质粒  
pPRE-mCherrymCherry 受 PRE 启动子调控，ampRZeng et al.5
pPLate*DgpD 受 λ 晚期启动子调控，ampRZeng et al.5

表1. 本研究中使用的大肠杆菌菌株、噬菌体和质粒。

密度 ρ (g/ml)CsCl (g)SM (ml)折射率 η
1.3039861.3625
1.5067821.3815
1.7095751.3990

表3. 在SM缓冲液（100 ml）中配制的用于阶梯梯度的CsCl溶液。

讨论

细菌菌株、噬菌体与质粒：

菌株 LE392 为 supF 型，被选用于抑制噬菌体基因组中的 Sam7 突变（详见表1）。因此，经诱导的溶原细胞最终将裂解并释放噬菌体颗粒，选择裂解途径的感染细胞亦然。由于噬菌体基因组中含有温度敏感型 cI857 等位基因，溶原细胞需在 30°C 下培养。热诱导后，gpD-EYFP 和野生型 gpD 分别由 λLZ1 基因组和质粒 pPlate*D 共同表达。因此，新生成的噬菌体 λLZ2 的衣壳中含有 gpD-EYFP 与 gpD 蛋白的混合物。这种嵌合噬菌体结构稳定，且具有足够的荧光强度，可用于单个噬菌体的检测5。pPRE-mCherry 是一种用于检测溶原途径选择的报告质粒。启动子 PRE 在溶原建立过程中被 CII 激活1,11。pPRE-mCherry5 是通过将 pE-gfp11 中的 gfp 替换为 mCherry12 而获得。更多细节请参见我们先前的研究工作5。

培养条件参数：

在溶原性诱导过程中（第1节），以180 rpm的温和振荡可获得较高的病毒产量13。应避免在培养基中使用葡萄糖，因为葡萄糖代谢会产生酸性代谢产物，而成熟的λ噬菌体颗粒在酸性pH条件下不稳定13。添加MgSO4的目的是稳定噬菌体衣壳3。对于携带野生型cI基因（而非cI857）的噬菌体，可使用DNA损伤剂丝裂霉素C（Mitomycin C）诱导溶原菌3。在步骤1.3中，37°C孵育时间通常不应超过90分钟。建议每30分钟通过OD600检测一次细胞密度。良好的裂解液应表现为OD600下降至约0.2或更低，残留的OD600主要来自细胞碎片。孵育时间过长可能导致噬菌体产量降低，因为新生成的噬菌体可能开始将DNA注入细胞碎片中。为了在步骤2.11和2.13中获得可见的噬菌体条带（至少1 × 1011个噬菌体颗粒），在步骤1.2中应培养至少500 ml的菌液。在步骤5.1和5.2的培养基中添加0.2%麦芽糖，旨在诱导LamB的表达，LamB是λ噬菌体吸附的受体蛋白3,14。步骤5.2中采用1000倍稀释而非100倍稀释，目的是降低报告质粒pPRE-mCherry带来的mCherry背景信号水平。在步骤5.5中进行噬菌体DNA注入触发时，选择35°C是为了避免诱导温度敏感型cI857等位基因的表达。

噬菌体纯化：

噬菌体纯化步骤（步骤 2.1 至 2.11）可用其他纯化方案替代5，但最终通过 CsCl 平衡梯度进行超速离心（步骤 2.12 和 2.13）是必不可少的。在步骤 2.10 和 2.12 中需要使用摆动桶转子，以确保噬菌体条带清晰可见。获得纯化的噬菌体储备液可能需要长达一周的时间，因此有必要在过程中检测噬菌体滴度，以确保中间步骤未出现差错。

噬菌体操作：

在第2节的所有纯化步骤中，必须轻柔操作噬菌体裂解液，以避免噬菌体尾部从头部脱落。在第5节的细胞感染过程中（例如，步骤5.5至5.7），也必须避免噬菌体颗粒从感染细胞中发生剪切。需要注意的是，如果噬菌体在将其DNA注入细胞后从细胞上脱落，则会导致“暗感染”现象，即实验中可观察到感染结果，但无法检测到感染性噬菌体。为尽量减少此类问题，我们在操作噬菌体或噬菌体/细胞混合物时，均使用宽口移液管头。

DAPI 检测：

用 DAPI 染色噬菌体原液（第 4 节）是一种快速且高效的方法，用于检测噬菌体原液的纯度，也可用于检测现有噬菌体原液随时间可能发生降解的情况。对于纯度较高的原液，在荧光显微镜下 YFP 与 DAPI 信号的共定位率应接近 100%。我们通常观察到少于 1% 的 YFP 斑点不含 DAPI 信号（代表无病毒基因组的衣壳），这表明这些颗粒未能成功包装病毒 DNA，或已将 DNA 注入其他位置。少于 1% 的 DAPI 斑点不含 YFP 信号（对应于无荧光的噬菌体）。如果情况不符合上述标准，则需要重复步骤 2.12 至 2.14，以进行再次纯化。关于成像参数，步骤 4.3 中的显微镜设置不如第 5 节关键，因为此处无需进行长期活细胞成像。然而，若希望校准单个噬菌体颗粒的荧光强度，则保持与第 5 节相同的显微镜设置是有益的。如果 PBS-琼脂糖薄片不够洁净，或使用了过多的 DAPI 染料，则部分对应于噬菌体 DNA 的 DAPI 斑点周围可能出现“光晕”现象。若 DAPI 染料用量过少，则 DAPI 通道的信号可能非常微弱。

显微镜系统：

在第6节的成像中，我们使用一台商用倒置落射荧光显微镜（Eclipse TE2000-E，Nikon），配备100倍物镜（Plan Fluo，数值孔径1.40，油浸）和标准滤光片组（Nikon）。荧光光源为弧光灯，并可调节光照强度。以下功能均由计算机控制：x、y和z轴位置；明场和荧光快门；以及荧光滤光片的选择。必须具备自动对焦功能，否则在延时成像过程中（通常持续4小时）焦点容易发生漂移。在每个时间点采集多个（x, y）位置的功能非常有用，因为它允许同时追踪多个感染事件。我们通常在每段延时影片中采集8个载物台位置，以并行监测多达100个感染事件。所使用的相机为冷却型512×512 CCD相机，像素大小为16×16 μm，动态范围为16位（Cascade512，Photometrics）。图像采集使用MetaMorph软件（Molecular Devices）完成。显微镜应置于温度可控的房间内；或者，显微镜载物台应配备温控培养舱。

图像采集：

进行活细胞成像时，关键是要避免对样品进行不必要的光照，以免导致荧光淬灭和光毒性。因此，最好首先对系统进行表征，以确定最佳的光照条件，在保证荧光信号可检测的同时，避免过度淬灭或抑制细胞生长。为了获得良好的荧光图像，需调整激发光强度、曝光时间和相机增益。在步骤6.2–6.3中，选择10分钟的帧间隔是为了尽量减少光照暴露。在每一帧中，明场通道（用于识别细胞）和荧光通道（用于确定细胞命运）仅需采集一幅处于焦平面的单层图像。然而，在第一个时间点，需要通过YFP通道在多个z轴位置采集图像，以捕获细胞表面所有感染中的噬菌体。此外，初始帧中YFP通道的曝光时间可能需要高于后续时间点延时成像所使用的曝光时间。

图像分析：

在步骤 7.1 中需极其仔细地计数细胞表面周围的噬菌体颗粒。如上所述，我们在步骤 6.2 中通过 YFP 通道采集一系列 z 层扫描图像。然而，这仍可能导致部分荧光标记的噬菌体颗粒处于失焦状态，从而给计数带来困难。初始时间点的细胞长度使用 Metamorph 软件进行测量，也可通过 ImageJ 或其他软件工具测定。此外，自行开发的自动化 Matlab 程序在获取沿细胞谱系随时间变化的荧光信号信息方面具有重要价值。

致谢

我们感谢 Michael Feiss 和 Jean Sippy 在噬菌体构建与纯化方面的指导。感谢 Michael Elowitz 提供细胞识别软件 Schnitzcell。Golding 实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（R01GM082837）、美国国家科学基金会（082265，PFC：生命细胞物理学研究中心）、Welch 基金会（Grant Q-1759）以及人类前沿科学计划（RGY 70/2008）资助项目的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯仿费舍尔科技公司C298-500
氯化钠费舍尔科技公司S271-3
DNase I西格玛-奥德里奇公司D4527-10KU
RNase西格玛-奥德里奇公司R4642-10MG
PEG8000费舍尔科技公司BP233-1
SM 缓冲液TEKnova 公司S0249
NZYMTEKnova 公司N2062
氯化铯西格玛-奥德里奇公司C3011-250G
注射器BD 生物科学公司309585
针头BD 生物科学公司305176
透析盒赛默飞世尔科技公司66333
显微镜载玻片康宁公司2947-75x50
琼脂糖费舍尔科技公司BP160-100
SW40Ti 超透明离心管贝克曼库尔特公司344060
SW60Ti 超透明离心管贝克曼库尔特公司344062
SW40Ti 转头贝克曼库尔特公司331302
SW60Ti 转头贝克曼库尔特公司335649
折射仪费舍尔科技公司13-947
落射荧光显微镜尼康仪器公司Eclipse TE2000-E
表 2. 试剂与设备。

参考文献

  1. Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. Switches in bacteriophage lambda development. Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).
  2. Ptashne, M. A genetic switch : phage lambda revisited. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  3. Hendrix, R. W. Lambda II. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1983).
  4. Hershey, A. D. The Bacteriophage lambda. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1971).
  5. Zeng, L. Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection. Cell. 141, 682-691 (2010).
  6. Edgar, R. Bacteriophage infection is targeted to cellular poles. Mol. Microbiol. , (2008).
  7. Ausubel, F. M. Current protocols in molecular biology. , John Wiley & Sons. (1994).
  8. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  9. Fasman, G. D. Practical handbook of biochemistry and molecular biology. , CRC press. (1989).
  10. Kaiser, A. D. On the internal structure of bacteriophage lambda. J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).
  11. Kobiler, O. Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network. Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).
  12. Shaner, N. C. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
  13. Personal communication with M. Feiss. , Forthcoming.
  14. Schwartz, M. The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity. J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章