通过小型双特异性亲和标签实现的正交蛋白质纯化

摘要

已开发出一种新颖且高效的两步亲和层析方案，并在此详细描述。该方法基于一种具有两种内在亲和性的微小纯化标签，适用于多种具有不同性质的目标蛋白。

摘要

由于重组蛋白纯化成本较高，因此需要对实验方案进行优化。对于高通量研究，迫切需要无需针对目标蛋白进行特异性优化的通用方法¹。为实现这一目标，通常采用可与目的基因进行遗传融合的纯化标签²。其中应用最广泛的亲和标签是六组氨酸标签（hexa-histidine tag），该标签适用于天然和变性条件下的蛋白纯化³。该标签的代谢负担较低，但其特异性不及其他基于亲和层析的竞争性策略^1,2。

本文开发了一种双特异性纯化标签，该标签位于一个由46个氨基酸组成的小蛋白结构域上，具有两个不同的结合位点。其中的白蛋白结合结构域来源于链球菌蛋白G，对人血清白蛋白（HSA）具有强烈的内在亲和力。选取11个不参与白蛋白结合的表面暴露氨基酸位点⁴，通过基因随机化构建了一个组合文库。该蛋白文库具有新型随机排列的结合表面（图1），并在噬菌体颗粒上表达，以便利用噬菌体展示技术筛选结合分子。通过针对来源于金黄色葡萄球菌蛋白A的二聚体Z结构域⁵进行多轮生物淘选，鉴定出一种对HSA和新靶标均具有亲和力的小型双特异性分子⁶。

一种新型蛋白质结构域（称为ABDz1）被评估作为纯化标签，用于一系列具有不同分子量、溶解度和等电点的目标蛋白质。三种目标蛋白在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达，并在其N端融合了该新型标签，随后进行亲和纯化。使用固定化人血清白蛋白（HSA）或Z结构域的层析柱进行初步纯化，均获得了纯度相对较高的产物。采用双特异性标签的两步亲和纯化显著提高了蛋白质的纯度。目前已有商品化的Z结构域固定化层析介质（例如MabSelect SuRe），可用于抗体纯化；同时，HSA可方便地通过化学偶联固定于层析介质上，以提供第二类纯化基质。

当对回收目标蛋白的纯度要求较高时，该方法具有显著优势。标签的双功能特性允许使用两种不同的层析步骤，同时由于标签尺寸较小，对表达宿主的代谢负担也受到限制。该方法为所谓的组合标签策略提供了一种具有竞争力的替代方案，后者需联合使用多个标签^1,7。

方案

1. 目的基因/ABDz1标签融合构建体的克隆

1. 准备ABDz1基因的PCR片段，该片段两侧需包含合适的限制性酶切位点，用于在表达质粒中与目标基因的N端进行连接（含有ABDz1的质粒可通过材料转让协议免费获得）。
2. 在合适的反应缓冲液中，使用选定的限制性内切酶对纯化的表达载体和PCR片段进行酶切，并在连接前纯化酶切产物。
3. 将经酶切处理的ABDz1片段连接至含有目的基因的表达载体中，并将连接产物转化至E. coli（原始方法中使用了RR1ΔM15菌株⁸）。将转化后的细胞涂布于添加了适当抗生素的琼脂平板上进行筛选。
4. 对若干菌落进行PCR筛选，并通过DNA测序验证所获得的表达盒序列。
5. 从经测序验证的阳性菌落的过夜培养物中提取质粒，随后将其转化至首选的表达菌株中（原始方法中使用的是E. coli Rosetta (DE3)菌株，该菌株携带pRARE质粒，有助于提高由人类基因编码的蛋白质的表达水平）。

2. 蛋白质表达

1. 挑取单个细菌菌落接种于10 ml添加了5 g/l酵母提取物和适当抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤中，于37 °C、150 rpm条件下过夜培养。
2. 取1 ml过夜培养物接种至100 ml新鲜培养基中，当细胞进入对数生长期时诱导蛋白表达（若使用lac操纵子，通常使用1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导）。
3. 于25 °C、150 rpm条件下过夜培养，然后通过离心收集细胞。

3. 正交亲和纯化

1. 将沉淀重悬于25 ml洗脱缓冲液（25 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，1 mM EDTA，0.05 % (w/v) Tween 20，pH 8.0）中，使用超声波在60 %振幅、1.0/1.0脉冲模式下破碎细胞3分钟。离心样品后，将含有目标蛋白的上清液通过0.45 μm滤膜过滤，再进行后续纯化。
2. 在合适的蛋白纯化系统上，用10柱体积（CV）的洗脱缓冲液以1 ml/min流速平衡1 ml HSA Sepharose柱或根据供应商建议预先偶联HSA的NHS活化柱。以0.5 ml/min流速上样细菌裂解液，随后将流速调回1 ml/min。
3. 用5 CV洗脱缓冲液洗涤柱子，接着用5 CV洗涤缓冲液（5 mM NH₄Ac，pH 5.5）洗涤。
4. 以1 ml/min流速用洗脱缓冲液（0.5 M HAc，pH 2.5）洗脱样品并收集组分，监测280 nm处的吸光度，以选择洗脱峰中的组分进行进一步纯化。
5. 合并蛋白浓度最高的组分，用SuRe洗脱缓冲液（20 mM磷酸盐，150 mM NaCl，pH 7.2）稀释两倍，并确保pH接近中性。如有需要，可加入1 M Tris-HCl（pH 8）调节pH。
6. 将样品以0.5 ml/min流速上样至已用10 CV SuRe洗脱缓冲液（1 ml/min流速）平衡的1 ml HiTrap MabSelect SuRe柱，上样完成后将流速重置为1 ml/min。
7. 用5 CV SuRe洗脱缓冲液（步骤5）洗涤柱子，然后用0.2 M HAc（pH 2.7）洗脱蛋白。对于敏感的目标蛋白，可在收集洗脱液的同时直接加入Tris-HCl进行中和。

如果调换色谱步骤的顺序，则可将MabSelect SuRe柱的洗脱液用运行缓冲液（步骤3.1）稀释，并通过加入1 M Tris-HCl将pH值提高至约8。通常情况下，当SuRe基质用于第二步时，可观察到更窄的洗脱峰。

4. 采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）评估纯度

1. 将纯化的组分上样至还原性SDS-PAGE，并可根据需要通过质谱法分析纯化产物的分子量。必须充分还原样品，因为ABDz1中的游离半胱氨酸在非还原条件下可能导致产物发生二聚化。

5. 代表性结果：

作为概念验证，利用ABDz1标签介导的正交亲和纯化方法，针对三种代表不同溶解度类别、分子量和等电点的人源目标蛋白进行了评估（表1）。将ABDz1基因与目标基因进行遗传融合，并在大肠杆菌（E. coli）中表达。图2展示了该方法所有步骤的流程图。通过正交纯化方案纯化后，收集不同阶段的样品并进行SDS-PAGE分析（图3）。结果明确展示了双标签系统及两步高特异性纯化策略的优势。尽管从凝胶结果可见，初始纯化步骤后已获得较为纯净的产物，但后续纯化步骤进一步获得了极高纯度的蛋白，非常适合对纯度要求极高的应用。

图1. 用于筛选双特异性ABDz1标签的组合文库设计。
该46个氨基酸组成的白蛋白结合结构域折叠成一个稳定的三螺旋束，其与人血清白蛋白的结合位点主要位于第二螺旋。通过在第一和第三螺旋中对11个暴露于表面的氨基酸进行基因随机化，构建出一个新的结合表面。图中所示的11个位点按照Kraulis等⁹的编号方式进行标注。利用噬菌体展示的组合文库，对金黄色葡萄球菌蛋白A的Z结构域二聚体进行生物淘选后，筛选出双特异性ABDz1分子。

图2. 正交亲和纯化方案的简化流程图。
包含ABDz1序列的PCR片段在合适的表达载体中与目标基因进行N端连接。连接产物转化至E. coli中，用于序列验证和质粒制备。随后将质粒转化至表达宿主中，从初始的过夜培养物开始进行大规模重组蛋白表达培养。通过离心收集细菌，并通过超声破碎裂解，获得含有目标蛋白的细菌裂解液。经过滤步骤去除残留的固体颗粒后，裂解液在液体处理系统上依次进行两步正交亲和纯化。收集两步纯化中洗脱的峰组分，通过SDS-PAGE分析其纯度，并与纯化前的裂解液进行比较评估。

图3. 与ABDz1融合表达并纯化的靶蛋白的SDS-PAGE分析。
从三种与ABDz1融合表达、具有不同特性的蛋白质以及ABDz1标签本身的细菌裂解液中取样，并与HSA柱纯化后接MabSelect SuRe柱纯化所得相应峰组分的样品一同进行分析（A）。第1-4泳道为纯化前裂解液样品，第5-8泳道为HSA柱纯化（第一步）样品，第9-12泳道为MabSelect SuRe柱纯化（第二步）样品。样品加载顺序如下：ABDz1-141377、ABDz1-HT875、ABDz1-HT2375和ABDz1。此外，还分析了相同裂解液样品在相同层析柱上以相反顺序进行纯化所获得的样品（B）。第1-3泳道为纯化前裂解液样品，第4-6泳道为MabSelect SuRe柱纯化（第一步）样品，第7-9泳道为HSA柱纯化（第二步）样品。样品加载顺序与（A）相同，但未包含标签蛋白本身。由结果可知，无论步骤顺序如何，该两步法均可获得高纯度的蛋白质。

名称b	靶蛋白 Uniprotc	分子量 （kDa）	溶解度 等级d	融合产物的 分子量（kDa）	融合产物的 等电点
141377	B7Z315	17.4	4	23.7	8.5
HT875	P01040	10.8	3	17.1	4.9
HT2375	P00740	8.9	5	15.2	6.8

1. ABDz1 标签的分子量为 6.3 kDa，等电点为 6.7。
2. 目标蛋白是 Uniprot 蛋白的一部分。
3. http://www.uniprot.org。
4. 带有 N 端 His₆ABP¹⁰ 的蛋白片段的溶解度分类。

表1. 在概念验证研究中评估的带有ABDz1标签^a的目标蛋白及融合产物。

选择三种具有不同分子量、溶解度和等电点的独特人类蛋白质，通过正交亲和方法进行表达和纯化。

讨论

本文介绍的正交亲和纯化方案可高效纯化多种目标蛋白。通过将白蛋白结合结构域的固有结合位点与一种新型结合表面相结合，开发出一种小型双特异性蛋白标签。该标签使用非常简便，只需将其克隆并表达为任何感兴趣蛋白的融合蛋白，适用于任意首选表达载体。两步蛋白纯化过程可采用大多数实验室常见的标准设备完成。由于ABDz1标签的功能依赖于结构域的正确折叠，以有效暴露其两个结合表面，因此该方法仅适用于以可溶形式表达的蛋白，不适用于变性条件下的纯化。此外应避免使用还原剂，因为它们会干扰ABDz1与MabSelect SuRe介质上Z结构域的结合。

正交亲和纯化为满足许多高要求应用中对高纯度蛋白质的需求，提供了一种有益的传统方法替代方案。同时，该方法在连续使用不同纯化策略时，避免了组合标签的需要。对于需要天然目标蛋白的应用，可引入蛋白酶切割位点，以实现ABDz1标签的酶切去除¹¹。此外，ABDz1标签是迄今为止报道的首个双特异性的小型折叠蛋白结构域。其独特之处在于，提供了一种依赖于两种靶标特异性亲和相互作用的纯化策略。未来，通过开发携带新型结合表面的双特异性标签，并使其与 readily available 且廉价的层析树脂兼容，将这一概念进一步拓展将十分有意义。例如，通过将参与白蛋白结合的氨基酸替换为碱性残基，可能获得适用于离子交换层析的标签。类似的概念已通过Z结构域的电荷工程得到验证，由此产生的标签分别被称为适用于阴离子交换和阳离子交换的Z_acid¹²和Z_basic¹³。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E. coli RR1ΔM15	American Type Culture Collection	35102
E. coli Rosetta (DE3)	Novagen, EMD Millipore	70954
Tryptic soy broth	Difco Laboratories	211822
Yeast extract	Difco Laboratories	212720
Vibra cell sonicator	Sonics and Materials, Inc.	-
HSA Sepharose	Pharmacia Corporation (Pfizer)	Former product
HiTrap MabSelect SuRe	GE Healthcare	11-0034-93
HiTrap NHS-activated HP column	GE Healthcare	17-0716-01